精品慢病毒包裝原理-介紹

1、慢病毒包裝原理-介紹慢病毒包裝系統(tǒng)簡介及應用一、慢病毒包裝簡介及其用途慢病毒(Lentivirus )載體是以HIV-1(人類免疫缺陷I型病毒)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能 力。慢病毒載體的研究發(fā)展得很快，研究的也非常深入。該載體可以將外源基因有效地整 合到宿主染色體上，從而達到持久性表達。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細胞、肝 細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞、干細胞等多種類型的細胞，從而達到良好的的基 因治療效果，在美國已經(jīng)開展了臨床研究，效果非常理想，因此具有廣闊的應用前景。目前慢病毒也被廣泛地應用于表達RNAi的研究中

2、。由于有些類型細胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效果差，轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)的 siRNA半衰期短，體外合成 siRNA對基因表達的抑制作用通常是短 暫的，因而使其應用受到較大的限制。采用事先在體外構(gòu)建能夠表達siRNA的載體，然后轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄 siRNA的策略，不但使脂質(zhì)體有效轉(zhuǎn)染的細胞種類增加，而且對基因表 達抑制效果也不遜色于體外合成siRNA ,在長期穩(wěn)定表達載體的細胞中，甚至可以發(fā)揮長期阻斷基因表達的作用。在所構(gòu)建的siRNA表達載體中，是由 RNA聚合酶出啟動子來指導RNA合成的，這是因為 RNA聚合酶出有明確的起始和終止序列，而且合成的RNA不會帶poly A 尾。當RNA聚合酶出遇到連續(xù) 4個或5個T

3、時，它指導的轉(zhuǎn)錄就會停止， 在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3'端形成14個U。 U6和H1 RNA啟動子是兩種 RNA聚合酶出依賴的啟 動子，其特點是啟動子自身元素均位于轉(zhuǎn)錄區(qū)的上游，適合于表達 21ntRNA和 50ntRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)(stem loop )。在siRNA 表達載體中，構(gòu)成 siRNA 的正義與反義 鏈，可由各自的啟動子分別轉(zhuǎn)錄，然后兩條鏈互補結(jié)合形成siRNA ;也可由載體直接表達小發(fā)卡狀 RNA(small hairpin RNA, shRNA)，載體包含位于 RNA聚合酶出啟動子和 45 T轉(zhuǎn)錄終止位點之間的莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列，轉(zhuǎn)錄后即可折疊成具有14個U 3 '突出端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)

4、，在細胞內(nèi)進一步加工成siRNA 。構(gòu)建載體前通常要通過合成siRNA的方法，尋找高效的siRNA ,然后從中挑選符合載體要求的序列，將其引入siRNA表達載體。慢病毒載體(Lentiviral vector )較逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有更廣的宿主范圍，慢病毒能夠有 效感染非周期性和有絲分裂后的細胞。慢病毒載體能夠產(chǎn)生表達shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性細胞、干細胞、受精卵以及分化的后代細胞中表達shRNA ,實現(xiàn)在多種類型的細胞和轉(zhuǎn)基因小鼠中特異而穩(wěn)定的基因表達的功能性沉默，為在原代的人和 動物細胞組織中快速而高效地研究基因功能，以及產(chǎn)生特定基因表達降低的動物提供了可 能性。慢病毒表達

5、載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質(zhì)粒可提供 所有的轉(zhuǎn)錄并包裝 RNA到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒 顆粒，需要利用表達載體和包裝質(zhì)粒同時共轉(zhuǎn)染細胞，在細胞中進行病毒的包裝，包裝好 的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養(yǎng)基中，離心取得上清液后，可以直接用于宿主細胞的感 染，目的基因進入到宿主細胞之后，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而高水平的表達效應 分子。1 .對于一些較難轉(zhuǎn)染的細胞，如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等，能大大提高目的基 因轉(zhuǎn)導效率，而且目的基因整合到宿主細胞基因組的幾率大大增加，這就為RNAi, cDNA克隆以及報告基因的研究提供了一

6、個有利的途徑。2 .進行穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的篩選；3 .為活體動物模型實驗提供高質(zhì)量的包含目的基因的病毒液；在細胞相關(guān)的實驗操作中，對于一些按常規(guī)方法難以轉(zhuǎn)染甚至無法轉(zhuǎn)染的細胞，通過病毒 介導的實驗能夠大大提高基因的轉(zhuǎn)導效率，以達到目的基因的高效瞬時表達。三、慢病毒載體介紹慢病毒載體(Lentiviral vector, LVs )是在HIV-1 病毒基礎(chǔ)上改造而成的病毒載體系 統(tǒng)，它能高效的將目的基因(或 RNAi )導入動物和人的原代細胞或細胞系。慢病毒載體 基因組是正鏈 RNA ,其基因組進入細胞后，在細胞漿中被其自身攜帶的反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)為 DNA,形成DNA整合前復合體，進入細胞核后，DNA整合

7、到細胞基因組中。整合后的DNA轉(zhuǎn)錄mRNA,回到細胞漿中，表達目的蛋白；或產(chǎn)生 RNAi干擾。慢病毒載體介導的基因表達或RNAi干擾作用持續(xù)且穩(wěn)定，原因是目的基因整合到宿主細胞基因組中，并隨細胞基因組的分裂而分裂。另外，慢病毒載體能有效感染并整合到非分 裂細胞中。以上特性使慢病毒載體與其它病毒載體相比，比如不整合的腺病毒載體、整合 率低的腺相關(guān)病毒載體、只整合分裂細胞的傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，有鮮明的特色。大量文 獻研究表明，慢病毒載體介導的目的基因長期表達的組織或細胞包括腦、肝臟、肌肉、視 網(wǎng)膜、造血干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞、巨噬細胞等。慢病毒載體不表達任何 HIV-1蛋白，免疫原性低，在注射部

8、位無細胞免疫反應，體液免疫反應也較低，不影響病毒載體的第2次注射。四、慢病毒載體的構(gòu)建1 .構(gòu)建原理慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，但其基因組結(jié)構(gòu)復雜，除gag、pol和env這3個和單純逆轉(zhuǎn)錄病毒相似的結(jié)構(gòu)基因外，還包括4個輔助基因，vif、vpr、nef、vpu和2個調(diào)節(jié)基因tat和rev 。 HIV 21是慢病毒中最具特征性的病毒，第一個慢病毒載體系統(tǒng)即以此 病毒為基礎(chǔ)進行構(gòu)建的。慢病毒載體的構(gòu)建原理就是將HIV 21基因組中的順式作用元件(如包裝信號、長末端重復序列)和編碼反式作用蛋白的序列進行分離。載體系統(tǒng)包括包裝成分和載體成分：包裝成分由HIV 21基因組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式

9、作用序列而構(gòu)建，能反式提供產(chǎn)生病毒顆粒所需的蛋白；載體成分與包裝成分互補，含有包 裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的HIV 21順式作用序列。同時具有異源啟動子控制下的多克隆位點及在此位點插入的目的基因。為降低兩種成分同源重組產(chǎn)生有復制能力的病毒(RCV )的可能性，將包裝成分的5 ' LTR換成巨細胞病毒(CMV )立即早期啟動子，3 ' LTR換成SV 40 polyA 位點等。將包裝成分分別構(gòu)建在兩個質(zhì)粒上，即一個表達gag和pol、另一個表達env 。根據(jù)這個原理，Naldini和Kafri等構(gòu)建了三質(zhì)粒表達系統(tǒng)。2 .三質(zhì)粒表達系統(tǒng)三質(zhì)粒表達系統(tǒng)包括包裝質(zhì)粒、包膜蛋白質(zhì)粒和轉(zhuǎn)移質(zhì)

10、粒。其中包裝質(zhì)粒在CMV啟動子的控制下，表達HIV 21復制所需的全部反式激活蛋白，但不產(chǎn)生病毒包膜蛋白及輔助蛋白 vpu;包膜蛋白質(zhì)粒編碼水泡性口炎病毒G蛋白(V SV 2G),應用VSV 2G包膜的假構(gòu)型慢病毒載體擴大了載體的靶細胞嗜性范圍，而且增加了載體的穩(wěn)定性，允許通過高速離心 對載體進行濃縮，提高了滴度；轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中除含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄及整合所需的順式序列，還保留350 bp的gag和RRE,并在其中插入目的基因或標志基因(綠色熒光蛋白GFP)。將載體系統(tǒng)分成三個質(zhì)粒最大的益處是使序列重疊的機會大大減少，減少載體重組 過程中產(chǎn)生RCV的可能性。通過三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，超速離心后病毒滴度可達109IU /m l。3 .四質(zhì)粒表達系統(tǒng)為了減少HIV 21 包裝結(jié)構(gòu)的序列同源性，進一步減少重組成RCV的可能性，Dull等人將輔助基因去除。但由于gag2pol的轉(zhuǎn)運需要rev ,因此，在上述的三質(zhì)粒系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建成四質(zhì)粒表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)加上含rev的質(zhì)粒減少了產(chǎn)生 RCV的可能性，而且對非分裂期細胞轉(zhuǎn)導效率無影響。五、慢病毒載體應用1 .將目的基因/RNAi基因轉(zhuǎn)入難以轉(zhuǎn)染的細胞，比如神經(jīng)元細胞、干細