+遺傳圖譜-9資料

1、第5章遺傳圖譜遺傳圖譜是應(yīng)用遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建能顯示基因以及其它序列特征在基因組上的位置的 圖。遺傳學(xué)技術(shù)包括雜交育種實(shí)驗(yàn)、人類家族的系譜分析。1遺傳圖譜的標(biāo)記1.1 基因基因是首先被使用的標(biāo)記。最初的遺傳圖譜是在20世紀(jì)初對果蠅等生物構(gòu)建的，使用基因作為標(biāo)記。一個(gè)遺傳性狀必須以兩種替換形式或表型存在才能用于遺傳學(xué)分析。如孟德爾首先研究的豌豆莖的高或矮。每種表型是由相應(yīng)基因的不同等位基因所決定的。起初只有那些能通過視覺區(qū)分的基因表型能用于研究。比如，第一張果蠅遺傳圖顯示了負(fù)責(zé)身體顏色、眼睛顏色、翅膀形態(tài)等基因的位置，這些表型都可在低倍顯微鏡下或肉眼觀察果蠅而看到。 早期覺得這種方法很精確，但遺傳學(xué)

2、家們很快發(fā)現(xiàn)，只有有限的幾種可見表型的遺傳可用于 研究，而在許多情況下，由于不止一個(gè)基因影響一個(gè)物理特征，分析起來并不太容易。 例如，到1922年，有超過50個(gè)基因被定位在 4條果蠅染色體上，而其中9個(gè)基因負(fù)責(zé)眼睛的顏色， 想在此領(lǐng)域有所貢獻(xiàn)的每一個(gè)初涉者必須首先學(xué)會(huì)辨別果蠅眼睛的顏色是紅、淡紅、朱紅、 石榴石紅、康乃馨色、肉桂色、深褐色、猩紅色或深紅色。為了使基因圖更加全面，有必要 找到一些比 可見的性狀 更多、更明確而且更簡單的性狀。解決的方法是應(yīng)用生物化學(xué)方法區(qū)分表型。這對于微生物與人類尤為重要。細(xì)菌與酵母只有為數(shù)很少的可見性狀，因此這類生物的基因作圖只能依賴于生化表型。人類以血液分型為

3、代表的生化標(biāo)記研究從 20世紀(jì)20年代就開始了。血液分型研究不僅包括如ABO系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)血型，還有血清蛋白以及人類白細(xì)胞抗原（ HLA系統(tǒng)）等免疫蛋白的等位基因可變體。 這些標(biāo)記相對于可見表型的一個(gè)巨大優(yōu)點(diǎn)是其相關(guān)基因往往為復(fù)等位基因。HLA-DRB1 基因至少有59個(gè)等位基因，而 HLA-B至少有60個(gè)。這正是與人類基因作圖相關(guān)的。與在果 蠅或小鼠等生物中建立的雜交實(shí)驗(yàn)不同，人類基因遺傳的數(shù)據(jù)只能通過檢查一個(gè)家族中各成員的表型來獲得。如果對所研究的基因而言，所有的家族成員都為純合子，就得不到有用的 信息。這對于只有兩個(gè)等位基因的基因較為常見。因?yàn)榛榕渑既坏匕l(fā)生于同一個(gè)等位基因純合子個(gè)體之間。而

4、當(dāng)所研究的基因有60個(gè)而不是2個(gè)等位基因時(shí)，這就很少見了。1.2 DNA標(biāo)記基因是非常有用的標(biāo)記，但絕不是理想的。特別是對于像脊椎動(dòng)物及開花植物的較大基 因組來說，僅依賴基因作出的圖不夠精細(xì)。即使是每個(gè)基因都在圖上定位，情況依然如此，這是因?yàn)樵谶@些生物的基因組中， 基因散在分布而且它們中間有大的間隙，此外基因中僅有一部分以比較容易區(qū)分的等位形式存在，從而使這一問題更為嚴(yán)重。因此遺傳圖譜就不夠全面。故我們需要其它類型的標(biāo)記。除基因外用于作圖的DNA特征稱為DNA標(biāo)記(DNA marker)。與基因標(biāo)記一樣，DNA標(biāo)記必須有至少兩種等位形式。有三種序列特征滿足此要求：1.2.1 限制性酶切片段長度

5、多態(tài)性(RFLP )RFLP (restriction fragment length polymorphism )是第一種用于研究的 DNA 標(biāo)記。限制性內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease) 是結(jié)合在 DNA 分子的特定序列上，并在識別序列或其附近將雙鏈DNA分子切開的酶。限制f內(nèi)切酶有三種：I類和III類的切割位點(diǎn)和識別序列不存在嚴(yán)格的關(guān)系，而n類限制性內(nèi)切酶則在識別序列或非常接近的位置進(jìn)行切割。用限制酶處理一個(gè)DNA分子時(shí)，即產(chǎn)生 限制片段。如n類限制酶 EcoRI (從大腸桿菌中分離得到)只在6核甘酸5'-G I AATTC-3'處

6、切割。這種序列特異性意味著用一種限制酶 處理一種DNA分子總會(huì)產(chǎn)生同樣的片段。但對于基因組DNA來說，并不總是這樣。這是因?yàn)橛行┫拗莆稽c(diǎn)具多態(tài)性，以兩種等位形式存在。一種等位形式有正確的限制位點(diǎn)序列， 能被酶切開；另一等位形式的序列有改變，從而該限制位點(diǎn)不能被識別。后者的結(jié)果使在限 制性核酸內(nèi)切酶處理后，兩個(gè)相鄰的限制片段仍然連接在一起，從而導(dǎo)致了多態(tài)性。 現(xiàn)在已分離到2500種以上的H類限制性內(nèi)切酶，其中有 300多種已在實(shí)驗(yàn)室種使用。人類基因組 中大約有105個(gè)RFLP。限制性片段長度多態(tài)性的檢測為了量化RFLP,有必要在很多不相關(guān)片段的背景中判定一個(gè)或兩個(gè)限制片段的長度。 這不是一個(gè)小問

7、題，核酸內(nèi)切酶如的識別序列長6bp,那么大約每 46 (= 4096bp)能切割DNA 一次，因此如果切割人基因組DNA ,可產(chǎn)生近750 000個(gè)片段。所以必須采用一定技術(shù)檢測特定的限制片段。目前檢測RFLP的方法主要有 Southern雜交和PCR。Southern 雜交(Southern hybridization)它是用于對RFLP的第一種技術(shù)，限制性內(nèi)切核酸酶酶切產(chǎn)生的DNA片段通過瓊脂糖凝膠電泳而相互分離，待研究的片段是用于探針雜交檢測。其步驟如下：第一步：酶切第二步：凝膠電泳凝膠電泳 是分離不同長短 DNA分子和RNA分子的標(biāo)準(zhǔn)方法。電泳是帶電分子在電場中的運(yùn)動(dòng)。帶負(fù)電荷的分子（

8、如 DNA）向陽極移動(dòng)，帶正電荷的分子則向陰極移動(dòng)。電泳 技術(shù)起初是在水溶液中進(jìn)行的，但對DNA分子的分離來說，這樣并不適用，因?yàn)樵谒芤褐杏绊戇w移率的主要因素是分子形狀和它所帶的電荷。而大多數(shù)DNA分子性狀相同（線性），雖然其所帶電荷依賴于它的長度，但由此產(chǎn)生的電荷差異不足以產(chǎn)生有效的分離。 當(dāng)電泳在凝膠中進(jìn)行時(shí)，情形就有所不同，此時(shí)分子形狀和電荷的影響降低，而分子長度成為決定遷移率的最重要因素。因?yàn)槟z形成一個(gè)網(wǎng)狀孔道，DNA分子從中穿過到達(dá)陽極。較短的分子受孔道的阻礙較小，能夠比較長的分子更快地穿過凝膠。從而不同長度的分子在凝膠上形成不同的條帶。制備瓊脂糖凝膠時(shí)， 將適量瓊脂糖粉末混入緩

9、沖液中，加熱使其溶解，然后將熔化的凝膠注入到有機(jī)玻璃板上，板四周用膠帶封閉以防止?jié)B漏。在膠中插入梳子以形成加樣孔。待凝膠凝固后，將其置于緩沖液中進(jìn)行電泳。加樣前，向 DNA樣品中加入一種或兩種已知遷 移率的染料，便于電泳過程中觀察進(jìn)度。電泳完畢后，將凝膠浸泡于澳化乙錠溶液中使DNA帶顯現(xiàn)，因?yàn)榘幕义V可嵌入DNA分子堿基對間，并在紫外線照射下發(fā)出熒光。第三步：Southern印跡由于瓊脂糖凝膠易碎， 不便于隨后的分子雜交操作，所以需要將凝膠上的片段轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。第四步：分子雜交雜交探針是一個(gè)被標(biāo)記的DNA分子，其序列與我們希望檢測的靶DNA互補(bǔ)，它們能形成堿基配對，因此能通過檢測探針上的標(biāo)記

10、發(fā)出的信號來確定靶限制性片段在膜上的位 置。探針可以是合成的寡核甘酸或克隆的DNA片段。為檢測 RFLP,探針通常是覆蓋多態(tài)限制位點(diǎn)的克隆的 DNA片段。將膜置于含標(biāo)記探針以及一些緩沖液的玻璃瓶中，將玻璃瓶緩慢旋轉(zhuǎn)數(shù)小時(shí)以使探針有充分時(shí)間與其靶 DNA雜交，洗膜以去除雜交的探針，然后檢測信號。探針通常是放射性標(biāo) 記的，信號通過放射性自顯影（autoradiography）來檢測。放射性自顯影圖上看到的帶是與 探針互補(bǔ)的片段。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）DNA分子選定區(qū)域的指數(shù)級擴(kuò)增。反應(yīng)時(shí)，將靶 DNA分子與核甘酸、兩條合成的寡核甘酸引物（pr

11、imer）以及耐熱DNA聚合酶混合。兩條引物與待擴(kuò)增區(qū)域的靶DNA兩端復(fù)性，從而能夠合成合適的寡核甘酸。PCR可持續(xù)進(jìn)行3040個(gè)循環(huán)。一個(gè)初始分子可以擴(kuò)增出成千上萬個(gè)相同的片段，相當(dāng)于第3頁幾微克。因?yàn)樗萐outhern雜交分析更快速，現(xiàn)在更常用。在DNA經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶處理之 前，先將含RFLP的DNA區(qū)段擴(kuò)增成多拷貝。然后 RFLP可通過用澳化乙錠對載有限制性 片段的瓊脂糖凝膠染色而看到。1.2.2 簡單序列長度多態(tài)性(SSLP)SSLP(simple sequence length polymorphism)是一系列不同長度的重復(fù)序列，不同的等位形式含有不同數(shù)目的重復(fù)單位。與RFL

12、P不同，由于每個(gè)SSLP可能有很多不同的長度變異體，所以它可以是多等位形式。SSLP有兩種類型：小衛(wèi)星(minisatellite ):也稱為可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)( variable number of tandem repeat,VNTR )。重復(fù)單位長度為幾十個(gè)核甘酸。微衛(wèi)星或簡單串聯(lián)重復(fù)(simple tandem repeat, STR):它的重復(fù)單位長度短得多，通常 為二、三或四核甘酸單位。微衛(wèi)星比小衛(wèi)星更常用作DNA標(biāo)記。這有兩個(gè)原因：第一，小衛(wèi)星在基因組中并不是均勻分布，只是更常見于染色體末端。用地理學(xué)術(shù)語來講，相當(dāng)于試圖用燈塔圖來找出一個(gè)島中央得路一樣。而微衛(wèi)星在基因組中的分布更

13、便于用來定位。第二，用于長度多態(tài)性分型的最快的方法是通過PCR,而PCR分型對于300bp以下的序列更快也更準(zhǔn)確。 但大多數(shù)小衛(wèi)星由于其重復(fù)單位相對較長，而且在一個(gè)序列中常有許多重復(fù)，因此長度大于 300bp。典型的微衛(wèi)星含有 1030個(gè)長度不超過4bp的重復(fù)，因此它 們更適合于PCR分型。在人類基因組圖上，已發(fā)現(xiàn)大約104個(gè)微衛(wèi)星。1.2.3 單核甘酸多態(tài)性(SNP)基因組中存在單個(gè)的點(diǎn)突變(point mutation ),且數(shù)量極大，有些也可產(chǎn)生 RFLP,但 許多并不能，這是因?yàn)樗鼈兯幍男蛄胁荒鼙幌拗菩詢?nèi)切核酸酶所識別。在人類基因組中，據(jù)認(rèn)為有 200 000個(gè)以上的 SNP(sin

14、gle nucleotide polymorphism)位于基因內(nèi)，而可能有10倍 于這個(gè)數(shù)字甚至更多的SNP位于非基因的 DNA中。SNP的優(yōu)點(diǎn)是它的數(shù)目龐大，而且對SNP分型所用的方法不需凝膠電泳。這非常重要，因?yàn)橐炎C明凝膠電泳很難實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，所以使用它的檢測方法相對緩慢而且費(fèi)力。SNP以寡核甘酸雜交分析( oligonucleotidehybridization analysis)為基礎(chǔ)，故其檢測更快速。寡核甘酸是在試管中合成的通常小于50個(gè)核甘酸的短單鏈 DNA分子。在適當(dāng)?shù)臈l件下，一個(gè)寡核甘酸與另一個(gè)DNA分子僅在可形成完全的堿基配對結(jié)構(gòu)時(shí)才能雜交。如果有一個(gè)錯(cuò)配，寡核甘酸上就有一個(gè)

15、位置不能形成第4頁堿基對，則不能雜交。因此寡核甘酸雜交能區(qū)分一個(gè)SNP的兩個(gè)等位形式。 通過DNA芯片可以篩選到SNP。DNA芯片DNA芯片是一塊面積為 2cm2或更小的硅片，以高密度排列方式攜帶有許多不同的寡核 甘酸，芯片密度可以達(dá)到每平方厘米一百萬個(gè)寡核甘酸探針，探針位于芯片表面，可以是合成的寡核甘酸或其它短 DNA分子(如cDNA)。待測DNA用熒光標(biāo)記后加到芯片的表面， 用熒光顯微鏡觀察雜交情況，顯示熒光信號的位置即表示該處的寡核甘酸與待測DNA發(fā)生了雜交。2.遺傳作圖的方法2.1 連鎖分析遺傳圖譜是應(yīng)用遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建能顯示基因以及其它序列特征在基因組上的位置的圖。遺傳學(xué)技術(shù)包括雜交育

16、種實(shí)驗(yàn)、人類家族的系譜分析。遺傳作圖技術(shù)都是以遺傳連鎖 (genetic linkage)為基礎(chǔ)。2.1.1 連鎖20世紀(jì)早期的遺傳學(xué)家就認(rèn)識到基因位于染色體上，每條染色體作為一個(gè)完整的單位 遺傳，換句話說，如果一對基因位于同一條染色體上，那么它們就物理地連接在一起，應(yīng)該一起遺傳。但遺傳學(xué)家發(fā)現(xiàn)只有極少數(shù)幾對基因表現(xiàn)為完全連鎖。成對的基因或者像不同染色體上的基因那樣獨(dú)立遺傳，或者只表現(xiàn)為部分連鎖( patial linkage )：有時(shí)一起遺傳，有時(shí) 不一起遺傳。2.1.2 交換一一部分連鎖的原因在減數(shù)分裂過程中同源染色體聯(lián)會(huì)形成二價(jià)體，這二價(jià)體中每條染色體含有兩條染色單體。在減數(shù)分裂末期產(chǎn)生

17、 4個(gè)配子，每一個(gè)染色體拷貝進(jìn)入 4個(gè)配子中的一個(gè)。在二價(jià)體中， 染色單體可以發(fā)生斷裂以及DNA片段的交換，這稱為交換或重組?，F(xiàn)在我們考慮100個(gè)相同的細(xì)胞減數(shù)分裂的結(jié)果。如果從未發(fā)生過交換，那么產(chǎn)生的配 子為：200個(gè)AB和200個(gè)abo這是完全連鎖，在減數(shù)分裂中基因A和基因B作為一個(gè)單位。但如果一些核中發(fā)生了A和B之間的交換，那么這對等位基因?qū)⒉荒茏鳛橐粋€(gè)單位遺傳。如果在 100個(gè)細(xì)胞的減 數(shù)分裂中有40個(gè)出現(xiàn)交換，將產(chǎn)生下列的配子：160個(gè)AB、160ab、40個(gè)Ab、40個(gè)aB。這時(shí)是不完全連鎖，即部分連鎖。除了兩個(gè)親代基因型( AB、ab)以外，還出現(xiàn)了重組基因型(Ab、aB)的配子

18、。其重組率為重組率=重組型配子數(shù) /配子總數(shù)=(40+40) 7400 = 20%2.1.3 遺傳作圖在理解了減數(shù)分裂中的交換可以解釋部分連鎖后，摩爾根的學(xué)生Arthur Strurtevant提出一個(gè)假設(shè)：交換是一個(gè)隨機(jī)事件，在一對并列的染色單體的任何位置發(fā)生交換的機(jī)率是相同 的。如果這種假設(shè)是正確的，那么相鄰的兩個(gè)基因由于交換而分開的機(jī)率將低于距離較 遠(yuǎn)的兩個(gè)基因。進(jìn)一步說，基因間因交換而去連鎖的機(jī)率與它們在染色體上的距離成比例。因而重組頻率是衡量兩個(gè)基因間距離的單位。計(jì)算出不同基因?qū)﹂g的重組頻率，就可以構(gòu)建出顯示基因在染色體上相對位置的圖，即連鎖遺傳圖。遺傳連鎖圖上的距離單位為厘摩(cM

19、) ,1cM=1%重組率。習(xí)題：下表是果蠅 X染色體上一些基因的重組頻率，請根據(jù)這些數(shù)據(jù)繪制遺傳連鎖圖基因重組率黃體(y)和白眼(w)黃體(y)和辰砂眼(v)黃體(y)和小翅(m) 辰砂眼(v)和小翅(m) 白眼(w)和辰砂眼(v)白眼(w)和小翅(m)白眼(w)和斜截翅(r)辰砂眼(v)和斜截翅(r)1%32.2%35.5%3%30%32.7%45%26.9%答案：現(xiàn)在已經(jīng)知道交換隨機(jī)性的假設(shè)并不完全正確。染色體上一些稱為重組熱點(diǎn) (recombination hotspot )的區(qū)域比其它區(qū)域更容易發(fā)生交換，這意味著遺傳圖上的距離并不一定能顯示兩個(gè)標(biāo)記間的物理距離。但是，連鎖分析通常能正確

20、推斷出基因的順序，而且對基因間距離的估計(jì)的精確度足以構(gòu)建出可為基因組測序計(jì)劃提供框架的遺傳圖。2.2 連鎖分析方法對于不同類型的生物，所采用的連鎖分析的方法不同雜交實(shí)驗(yàn)：適用于果蠅、小鼠、擬南芥等；系譜分析：適用于人類；細(xì)菌的連鎖分析：適用于不發(fā)生減數(shù)分裂的原核生物。2.2.1 雜交實(shí)驗(yàn)遺傳作圖的關(guān)鍵是確定減數(shù)分裂所產(chǎn)生的配子基因型。其方法有兩種：一、直接檢查配子例如一些微小真核生物（如釀酒酵母）產(chǎn)生的配子可以長成單倍體細(xì)胞的克隆，其基因型可以通過生物化學(xué)方法判斷。應(yīng)用DNA標(biāo)記也可以對高等真核生物配子直接進(jìn)行基因分型，例如可以對一個(gè)個(gè)體的精子的DNA做PCR,從而進(jìn)行RFLP、SSLP、SN

21、P的分型。但精子分型很費(fèi)力，因而不是常規(guī)的方法。二、測交（test cross）分析假設(shè)Aa和Bb是果蠅2號染色體上的兩對等位基因，現(xiàn)在通過測交分析計(jì)算它們的遺 傳距離。測交分析親本的基因型：1 .雙雜合子，即 AB/ab2 .雙純合子，即 ab/ab實(shí)驗(yàn)的目的是推斷雙雜合子親本產(chǎn)生的配子的基因型，以計(jì)算重組體的比例。 對于雙純合子無論是親本型還是重組型配子，都具有ab基因型。結(jié)果雙純合子的減數(shù)分裂對后代的基因型沒有影響。這意味著從二倍體后代的基因型可以確定地推斷出雙雜合子親本來源配子 的基因型，可以對一次減數(shù)分裂進(jìn)行直接分析，從而計(jì)算出重組頻率。如果使用顯性與隱性的基因標(biāo)記，則雙純合子親本必

22、須是雙隱性純合子（即ab/ab）,但如果使用共顯性的 DNA標(biāo)記，那么雙純合子親本就可以為任意組合的純合等位基因（例如 AB/AB、Ab/Ab、aB/aB、ab/ab）。原理如下：2.2.2 系譜分析對于人類，不可能為了作圖的需要而預(yù)先選擇親本基因型以設(shè)計(jì)特定的雜交。用于計(jì)算重組率的資料只能通過檢測現(xiàn)存家庭連續(xù)的幾代成員的基因型獲得。這意味著只能獲得有限的資料而且經(jīng)常很難解釋。因?yàn)槿祟惖幕橐龊苌賹?dǎo)致測交，而且經(jīng)常由于一個(gè)或多個(gè)的家庭成員死亡或不愿合作而不能獲得他們的基因型。如下圖所示，是一個(gè)具有一種遺傳病的家庭的系譜。遺傳病常用作人類的基因標(biāo)記，疾第7頁病狀態(tài)相當(dāng)于一個(gè)等位基因，健康狀態(tài)相當(dāng)于

23、另一個(gè)等位基因。為了對這一個(gè)遺傳病進(jìn)行基因定位，為此研究了這一基因于微衛(wèi)星標(biāo)記M的連鎖情況?，F(xiàn)存的家庭成員中有4個(gè)M的等位形式 M1、M2、M3、M4 ,那么有多少子女是重組體呢？巴黎人類多態(tài)性中心(CEPH)收集家庭的培養(yǎng)細(xì)胞系，它包括 4個(gè)祖父母和外祖父母 及至少8個(gè)第二代子女。CEPH可以為那些愿意將研究成果送 CEFP中心數(shù)據(jù)庫的研究人員 提供這一標(biāo)本用于 DNA標(biāo)記作圖。2.2.3 細(xì)菌的遺傳作圖細(xì)菌等單倍體生物不發(fā)生減數(shù)分裂。所以需要設(shè)計(jì)其它的方法以誘導(dǎo)細(xì)菌DNA同源片段間的交換。下列三種方法可用于將DNA片段從一個(gè)細(xì)菌轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)菌。(1)接合(conjugation)：兩個(gè)細(xì)菌形成物理性接觸，DNA從一個(gè)細(xì)菌(供體)轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)菌(受體)。轉(zhuǎn)移的DNA可以是供體細(xì)胞染色體的一部分或全部拷貝，或整合在質(zhì) 粒上的染色體 DNA片段，后者稱為附加體轉(zhuǎn)移( episome transfer)。(2)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)：是