免疫學試驗-凝集試驗

1、免疫學實驗-凝集試驗實驗一凝集試驗顆粒性抗原(細菌、螺旋體、紅細胞等)與 相應抗體結(jié)合后，在有適量電解質(zhì)存在下，抗 原顆?？上嗷ツ扇庋劭梢姷哪瘔K，稱為 凝集反應(Agglutination reaction) 或凝集試驗。 參與凝集反應的抗原稱為凝集原(Agglutinogen ),抗體稱為凝集素 (Agglutinin )。細菌或其它凝集原都帶有相同的負電荷， 在懸液中相互排斥而呈現(xiàn)均勻的分散狀態(tài)。抗 原與相應抗體相遇后可以發(fā)生特異性結(jié)合，形 成抗原抗體復合物，降低了抗原分子間的靜電 排斥力，此時已有凝集的趨向，在電解質(zhì)(如 生理鹽水)參與下，由于離子的作用，中和了 抗原抗體復合物外面

2、的大部分電荷，使之失去 了彼此間的靜電排斥力，分子間相互吸引，凝 集成大的絮片或顆粒，出現(xiàn)了肉眼可見的凝集 反應。根據(jù)是否出現(xiàn)凝集反應及其程度，對待 測抗原或待測抗體進行定性、定量測定。凝集反應包括直接凝集反應和間接凝集 反應兩大類，本實驗主要介紹直接凝集反應。目的要求1 .掌握平板凝集試驗和試管凝集試驗的 操作方法。2 .掌握凝集試驗的結(jié)果判定及判定標 準。3 .熟悉平板凝集試驗和試管凝集試驗所 需材料和試劑。材料與試劑1 .玻板，載玻片，試管（1cm x 8cm）, 試管架，刻度吸管，滴管，微量可調(diào)加樣器， 滴頭（tip頭），牙簽或火柴棒，記號筆。2 .滅菌的生理鹽水，滅菌的 0.5%石炭

3、酸 生理鹽水。3 .布氏桿菌病試管凝集抗原，布氏桿菌 病平板凝集抗原，布氏桿菌病虎紅平板凝集抗 原，布氏桿菌病陽性血清，布氏桿菌病陰性血 清，被檢血清（牛、羊或豬）。4 .雞白痢平板凝集抗原，雞白痢陽性血 清，雞白痢陰性血清，被檢雞血清。實驗內(nèi)容及操作方法（一）試管凝集試驗以牛布氏桿菌病試管凝集試驗為例1 .試管準備：每份血清用試管4支，另取3 支試管作為對照，作好標記，置試管架上。如 被檢血清有多份，對照只需做1份。2 .被檢血清稀釋：第 1管加入2.3 ml 0.5% 石炭酸生理鹽水，第2、3、4管加入0.5 ml 0.5% 石炭酸生理鹽水；然后用加樣器或刻度吸管吸 取被檢血清0.2 ml

4、 ,加入第1管中，反復吹 吸5次混勻，吸取1.5 ml棄之，再吸取0.5 ml 加入第2管中，混勻后吸取 0.5 ml加入第3 管，依此類推至第4管，混勻后吸棄0.5 ml （見 表1-1 ）。該被檢血清的稀釋度分別是1:12.5、1:25、1:50、1:100。3 .對照管制作：第5管中加0.5%石炭酸生 理鹽水0.5 ml ,第6管加1:25稀釋的布氏桿 菌病陽性血清0.5 ml ,第7管加1:25稀釋的 布氏桿菌病陰性血清 0.5 ml。4 .加抗原：將布氏桿菌病試管凝集抗原 用0.5%石炭酸生理鹽水作 1:20稀釋，每支試 管加0.5 ml 。表1-1布氏桿菌病試管凝集試驗術(shù)式表（單位

5、：ml）試管號1234567對 照管最終血清稀釋度1: 251 : 501 : 1001: 200抗原陽性血清1 : 25陰性血清1 : 250.5%石炭酸生理鹽水2.3、0.5 0.5、0.5、0.5被檢血清0.20.54、0.5。.5 %0.50.5抗原(1 : 20)0.50.50.50.50.50.50.5棄1.5棄0.55.感作（反應）：7支試管加完抗原后，充 分混勻，置于37c溫箱中4-10h ,取出后置室 溫18-24h （或37 c溫箱12-14h ,取出后置室 溫2-4h ;或37c溫箱中22-24 h取出），然后 觀察并記錄結(jié)果。6 .結(jié)果判定：判定結(jié)果時用“ +”表示反

6、應的強度。根據(jù)各管中上清液的透明度、抗原 被凝集的程度及凝集塊的形狀，來判定凝集反 應的程度。+ + + + :100 %抗原凝集，上清液完全透明，菌體完全被凝集呈傘狀沉于管底，振蕩 時，沉淀物呈片狀、塊狀或顆粒狀。+ + + : 75 %抗原凝集，上清液略呈混濁， 菌體大部分被凝集沉于管底，振蕩時情況如 上。（管底凝集物與100艱集時相同，只是上 清液稍渾濁）。+ + : 50 %抗原凝集，上清液渾濁半透明，管底有中等量的凝集物（管底有明顯的凝集）+ : 25 %抗原凝集，上清液完全渾濁不透 明，管底有少量凝集物或凝集的痕跡?？乖耆茨锨逡和耆珳啙岵?透明，但由于菌體的自然下沉，在管

7、底中央出 現(xiàn)規(guī)則的菌體自沉圓點，振蕩后立即散開呈均 勻混濁。7 .判定標準：能使50%抗原凝集的血清 最高稀釋度稱為該血清的凝集價（或稱滴度）（牛、馬和駱駝的血清凝集價大于或等于 1:100 ,判為陽性，1:50的凝集價判為疑似反 應（可疑）；豬、綿羊、山羊和狗的血清凝集 價大于或等于1:50 ,判為陽性，1:25的凝集 價判為疑似反應（可疑）。注意事項1 .實驗時必須設抗原、陽性血清及陰性 血清對照，以避免假陽性、假陰性的結(jié)果。2 .結(jié)果判為可疑時，隔 2-3周后采血重 做。陽性畜群，重檢時仍為可疑，可判為陽性。 對同群中既無臨床癥狀又無凝集反應陽性者， 馬、豬重檢仍為可疑，判陰性；牛、羊重

8、檢仍 為可疑者，可判為陽性，或以補體結(jié)合反應核（二）布氏桿菌病平板凝集試驗1 .加血清：取潔凈玻板一塊，用蠟筆劃 成方格（4cm2）,并注明被檢血清號碼，以100 L 微量可調(diào)加樣器按下列量加被檢血清于方格內(nèi)，第l格80 L、第2格40 L、第3格20 L、 第4格10 L。血清用前需放室溫，使其溫度達 20 c左右。每一份檢樣需換一個 tip頭。大規(guī)模檢疫時，允許只用兩個血清量作試 驗，牛、馬、駱駝用 40 L和20 L ;豬、山 羊、綿羊、狗用 80 L和40 L。2 .加抗原：每格加布氏桿菌病平板凝集 抗原30 L,滴在血清附近，而不與血清接觸。 從血清量最少的一格起，用牙簽將血清與抗原

9、 混勻，一份血清用一根牙簽?？乖们皳u勻，并置室溫使其溫度達 20 C 左右。3 .作用：混和完畢后，將玻板置恒溫箱 中或采用別的辦法適當加溫，使溫度達到30 C 左右，3-5min內(nèi)記錄反應結(jié)果。4 .對照：每次試驗須用標準陽性血清和 陰性血清以及生理鹽水作對照。5 .結(jié)果判定：按下列標準記錄反應結(jié)果+ + + + :出現(xiàn)大的凝集塊，液體完全透 明，即100%凝集。+ + + :有明顯凝集塊，液體幾乎完全透 明，即75%凝集。+ + :有可見凝集塊，液體不甚透明，即 50%凝集。十 :液體混濁，有小的顆粒狀物，即25%凝 集。液體均勻混濁，無凝集現(xiàn)象。6 .平板凝集試驗與試管凝集試驗的關(guān)系見

10、表 1-2。表1-2 平板凝集試驗與試管凝集試驗的關(guān)系平板凝集80 L40 L20 L10 L相當于試管凝集1:251:501:1001:2007 .判定標準：同試管凝集試驗。8 .注意：對于陽性及可疑的被檢血清需用 試管凝集試驗進行驗證。（三）虎紅平板凝集試驗這種試驗是快速平板凝集試驗?？乖遣?氏桿菌加虎紅制成。虎紅平板凝集試驗可與試管凝集試驗及補體結(jié)合試驗效果相比，具有操 作簡單、快速、特異性強的優(yōu)點。1 .被檢血清和布氏桿菌病虎紅平板凝集 抗原各30 L滴于玻璃板的方格內(nèi)，每份血清 各用一支牙簽或火柴棒混合均勻。在室溫 （20C） 4-10min內(nèi)記錄反應結(jié)果。 同時以陽、 陰性血清作

11、對照。2 .結(jié)果判定：在陽性血清及陰性血清試 驗結(jié)果正確的前提下，被檢血清出現(xiàn)任何程度 的凝集現(xiàn)象均判為陽性，完全不凝集的判為陰 性，無可疑反應。3 .注意：抗原用前充分搖勻，抗原和被 檢血清用前應放室溫 30-60min后再進行試驗。（四）雞白痢平板凝集試驗1 .被檢雞血清和雞白痢平板凝集抗原各 1滴（約30 L）滴于玻板或載玻片上，用牙簽 或火柴棒充分混合。2 .結(jié)果判定：在室溫（20 C）下，觀察 30-60S ,凝集者為陽性，不凝集者為陰性。思考題1 .凝集反應的原理是什么 ？2 .哪些因素影響細菌凝集試驗？3 .凝集試驗中為什么要設陽性、陰性血 清及抗原對照？實驗二 病毒的血凝及血凝

12、抑制試驗有些病毒具有凝集某種（些）動物紅細胞的能力，稱為病毒的血凝，利用這種特性設計 的試驗稱血球凝集（HA）試驗，以此來推測被檢 材料中有無病毒存在，是非特異性的，但病毒 的凝集紅細胞的能力可被相應的特異性抗體 所抑制，即血球凝集抑制（HI）試驗，具有特異 性。通過HA-HI試驗，可用已知血清來鑒定未 知病毒，也可用已知病毒來檢查被檢血清中的 相應抗體和滴定抗體的含量。目的要求掌握病毒HA和HI試驗的原理和基本操作 方法，了解其實用價值。材料與試劑1 . 96孔" U'形或" V'形微量反應板， 50 L定量移液器，滴頭，微型振蕩器。2 .生理鹽水，0.5

13、%雞紅細胞懸液。3 .新城疫病毒液（尿囊液或凍干疫苗 液），新城疫陽性血清，被檢雞血清。實驗內(nèi)容及操作方法（一）血球凝集（HA）試驗1 .在96孔微量反應板上進行，自左至右 各孔加50 L生理鹽水。2 .于左側(cè)第1孔加50 L病毒液（尿囊液 或凍干疫苗液），混合均勻后，吸 50 L至第2 孔，依次倍比稀釋至第 11孔，吸棄50 L;第 12孔為紅細胞對照。3 .自右至左依次向各孔加入0.5%雞紅細胞懸液50 L,在振蕩器上振蕩，室溫下靜 置后觀察結(jié)果（表4-1 ）。表4-1病毒血凝試驗的操作方法 （單位：L）孑L號123456789101112病毒稀釋度1:1021:2041:21:41:81

14、:161:321:641:1281:2561:51248對照生理鹽水病毒液50 550 ；50 5。150 550 150 】50、50 550、5al卜卜、卜、鼠 50505050/50,5050505050 5” 500.5%紅細胞5050505050505050505050 50f棄50結(jié)果觀察+-4 .結(jié)果判定：從靜置后 10 min開始觀察 結(jié)果，待對照孔紅細胞已沉淀即可進行結(jié)果觀 察。紅細胞全部凝集，沉于孔底，平鋪呈網(wǎng)狀， 即為100%凝集（+）,不凝集者（-）紅細 胞沉于孔底呈點狀以100%凝集的病毒最大稀釋度為該病毒 血凝價，即為一個凝集單位。從表 4-1看出， 該新城疫病毒液

15、的血凝價為1:128 ,則1:128為1個血凝單位，1:64、1:32分別為2、4個 血凝單位，或?qū)?128/4=32 ,即1:32稀釋的病 毒液為4個血凝單位。(二)血球凝集抑制(HI)試驗1 .根據(jù)HA試驗結(jié)果，確定病毒的血凝價， 配制出4個血凝單位的病毒液。2 .在96孔微量反應板上進行，用固定病 毒稀釋血清的方法，自第 1孔至第11孔各加 50 L生理鹽水。3 .第1孔加被檢雞血清 50 L,吹吸混合 均勻，吸50 L至第2孔，依此倍比稀釋至第 10孔，吸棄50 L,稀釋度分別為：1: 2、1:4、 1:8;第12孔加新城疫陽性血清 50 L, 作為血清對照。4 .自第1孔至12孔各加

16、50 L 4個血凝 單位的新城疫病毒液，其中第11孔為4單位新城疫病毒液對照，振蕩混合均勻，置室溫中 作用10min 。5 .自第l孔至12孔各加0.5%雞紅細胞懸液50 L,振蕩混合均勻，室溫下靜置后觀察結(jié)果（表4-2）表4-2 病毒血凝抑制試驗的操作方法 （單位:孑L號血清稀釋度生理鹽被冷雞-Mr4單位病主L)123456789101:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:1024505050505050505050505050”1112病毒 血清對照對照50500.5泡細-ft-結(jié)果觀505050505050505050505050室溫中靜置10 min

17、505050505050505050505050-+-6 .結(jié)果判定：待病毒對照孔（第 11孔）出現(xiàn)紅細胞100俺集（+）,而血清對照孔（第12孔） 結(jié)果觀察。為完全不凝集（-）時，即可進行以100%抑制凝集（完全不凝集）的被檢 血清最大稀釋度為該血清的血凝抑制效價，即 HI效價。凡被已知新城疫陽性血清抑制血凝 者，該病毒為新城疫病毒。從表4-2看出，該血清的HI效價為1:64 , 用以2為底的負對數(shù)（-log2）表示，即6log2 。7句橡酸鈉 7句椽酸（ 葡萄糖 氯化鈉 雙蒸水1. 阿氏液（Alsever ）:即紅細胞保養(yǎng)液（5H2。）0.80gH2O）0.055g2.05g0.42g加至 100 ml調(diào)整pH將以上試劑加熱溶解于雙蒸水中，至6.8 , 115c滅菌10min,4 °C保存?zhèn)溆?. 0.5% 雞紅細胞制備方法 先用滅菌注射器吸取 3.8%枸檬酸鈉溶液（其量為所需血