具有潛在抑制腸道致病菌能力的乳酸菌的篩選

1、具有潛在抑制腸道致病菌能力的乳酸菌的篩選Abstract Objective Lactic acid bacteria( LAB) with strongresistance of acid and bile salt were screened from laboratory , and their adhesion ability of intestinal epithelial cells and inhibition ability to intestinal pathogens were studied.MethodThe resistance of acid and bile sa

2、lt and the adhesion ability of IEC6 cells were studied by artificial gastrointestinal fluid and cocultured with IEC6 cells , respectively , and the bacteriostatic effect was deter mined by single agar plate diffusion method.ResultThe survival rate of 10 strains were cultured 3 h in pH 3.0 artificial

3、 gastric juice was greater than 44.00% and cultured 4h in pH 8.0 artificial intestinal juice was greater than 51.56%, and cultured 24 h in medium containing 0.30% bile salts was greater than 20.00%； the adhesion number of C13 , A03, A17 and A90 on IEC6 cells was greater than 8 cells ; the inhibiting

4、 capacity of C13 ,A03 on Clostridium difficile , Salmonella and Escherichia coli was stronger than others the antibacterial circle diameter was greater than 22 mm.C13 and A03 were identified as Lactobacillus rhamnosu and Lactobacillus plantarum by 16S rRNA sequencing , respectively.ConclusionL.rhamn

5、osu C13, L.plantarum A03 with the strong ability of acid and bile salt resistance and adhesion to epithelial cells ， which have good inhibitory effect on pathogenic bacteria ， and can be used as a fit probiotic candidate strain.Key words Lactic acid bacteria ； Resistance of acid and bile salt; Adhes

6、ion ； Inhibition of pathogenic bacteria踢道菌群在維持機(jī)體的健康過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，與人體的消化營(yíng)養(yǎng)、免疫代謝、生物拮抗等密切相關(guān)。抗生素由于見 效快、針對(duì)性強(qiáng)等特點(diǎn)被大量用于疾病的治療，而其過(guò)度使用導(dǎo)致了腸道菌群的紊亂，引起了艱難梭菌、沙門氏菌、大腸桿菌等 腸道致病菌的繁殖，進(jìn)而引發(fā)機(jī)體腹瀉、嘔吐、酸中毒等癥狀， 同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致機(jī)體易感染情況增加，引起二重感染，降低其免疫功能，對(duì)機(jī)體的健康產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響2-3 o乳酸菌作為人體腸道中的重要有益微生物，可以通過(guò)產(chǎn)生短鏈脂肪酸、乳酸、甲酸、細(xì)菌素、過(guò)氧化氫及小分子肽類等一系 列代謝產(chǎn)物來(lái)拮抗腸道致病菌；同

7、時(shí)乳酸菌通過(guò)其表面的黏附素 與腸黏膜細(xì)胞緊密結(jié)合，形成生理屏障，并通過(guò)與致病菌競(jìng)爭(zhēng)腸 道上皮細(xì)胞的黏附位點(diǎn)、生存空間及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)抑制腸道病原菌的生長(zhǎng)，改善腸道菌群紊亂的狀況，達(dá)到改善腸道微環(huán)境的效果。 乳酸菌作為益生菌必須對(duì)腸道的酸和膽鹽等不良環(huán)境有一定的 耐受性，同時(shí)能夠黏附在腸上皮細(xì)胞上才能發(fā)揮其益生功能。筆者從實(shí)驗(yàn)室保藏的乳酸菌中篩選出耐酸耐膽鹽能力及黏附能力 較強(qiáng)的乳酸菌，研究其對(duì)腸道病原菌的抑制能力，為其進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。1材料與方法1.1 材料1.1.1 菌株與主要試劑。試驗(yàn)菌株，江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。 膽鹽，美國(guó)Difco公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶，上海

8、生工生物工 程公司；DNA提取試劑盒，上海生工生物工程公司； 艱難梭菌、 大腸桿菌、沙門氏菌，中國(guó)微生物菌株保藏中心；IEC-6細(xì)胞，上海麥莎生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基，美國(guó)Invitrogen公 司；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司；強(qiáng)化梭菌培 養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；抗生素藥敏試紙，杭州天和 微生物試劑有限公司。1.1.2 主要儀器設(shè)備。JF-SX-500全自動(dòng)滅菌鍋，日本TOMY 公司；Thermo Scientific 1300 生物安全柜、Legendmach1.6R 高 速冷凍離心機(jī)，美國(guó)塞默飛世爾科技有限公司； OlympusCX41生 物顯微鏡，日本 Ol

9、ympus公司；UV-2550紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；PCR擴(kuò)增儀，美國(guó)ABI公司；In萬(wàn)nity3026凝膠成像 系統(tǒng)，法國(guó) Vilber Lourmat公司。1.1.3 主要試劑的配制。模擬胃液：0.3%勺胃蛋白酶溶于 PBS溶液，1 mol/L HCl調(diào) pH至3.0,經(jīng)0.22以屣膜過(guò)濾除菌，現(xiàn)配現(xiàn)用。模擬腸液：0.1%勺胰蛋白酶溶于PBS溶液，0.4% NaOH溶液 調(diào)pH至8.0,經(jīng)0.22以m濾膜過(guò)濾除菌，現(xiàn)配現(xiàn)用。1.2 方法1.2.1 乳酸菌的培養(yǎng)處理。將活化后的乳酸菌按3%勺接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 C培養(yǎng)24 h后，10 500 r/min離心10 mi

10、n收集菌體，用滅菌 的PBS溶液將菌體洗滌后懸浮，并調(diào)整其OD560nm為1.0, 4 C 冰箱冷藏備用。1.2.2 IEC-6細(xì)胞的培養(yǎng)。將IEC-6細(xì)胞置于 DMEM培養(yǎng)液中，于37 、5%CO2的培 養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，隔天更換1次培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞增殖融合率達(dá)80% 時(shí)，用0.25%勺胰酶（0.02%EDTA消化細(xì)胞，傳代5次后進(jìn)行下1.2.3 致病菌的培養(yǎng)與處理。將沙門氏菌、大腸桿菌以3%勺接種量接種到LB液體培養(yǎng)基 中，艱難梭菌以3%勺接種量接種到 RCM培養(yǎng)基中，活化3代, 37 C培養(yǎng)24 h,利用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定其活菌數(shù)，用滅菌的培養(yǎng) 基調(diào)整其活菌數(shù)為107 CFU/mL, 4 C冷藏

11、備用。1.2.4 乳酸菌的耐酸耐膽鹽能力。分別取 1.0 mL的乳酸菌菌 懸液于9.0 mL的模擬胃液和9.0 mL的模擬腸液中，于37 c分 別培養(yǎng)3 h和4 h后測(cè)定其活菌數(shù)，按公式(1)、(2)計(jì)算其存 活率。將乳酸菌菌懸液按3%勺接種量接種于含0.30%且鹽及不含 膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，37 C培養(yǎng)24 h測(cè)定其OD600nm 值，按公式(3)計(jì)算其存活率。存活率=3 h的活菌數(shù)/0 h的活菌數(shù)X 100% (1)存活率二4 h的活菌數(shù)/0 h的活菌數(shù)X 100% (2)存活率=含膽鹽培養(yǎng)基的OD值/不含膽鹽培養(yǎng)基的 OD值 X 100% (3)1.2.5 乳酸菌的黏附能力。調(diào)整I

12、EC-6細(xì)胞的濃度為2X 104 cells/mL,接種于培養(yǎng)板中， 預(yù)先置入22 mmx 22 mm無(wú)菌蓋玻片，使細(xì)胞貼附蓋玻片生長(zhǎng)， 37 C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用PBS沖洗并調(diào)整培養(yǎng)后的乳酸 菌，使其菌體濃度為 1X108 CFU/mLo待細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層后， 用PBS緩沖液漂洗細(xì)胞2次，然后每孔加入不含抗生素的1 mLDMEM培養(yǎng)液和1 mL上述制備好的乳酸菌菌懸液，輕輕搖晃混勻，置于CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育，每株菌重復(fù) 3孔。培養(yǎng)60 min后，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞5次，除去未黏附 的乳酸菌，然后加入無(wú)水甲醇固定 20 min ,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行革蘭氏染 色，顯微鏡下隨機(jī)選取 20個(gè)視野，計(jì)算100個(gè)細(xì)胞上黏附的乳 酸菌個(gè)數(shù)，以平均每個(gè)細(xì)胞所黏附的乳酸菌個(gè)數(shù)表示黏附能力。1.2.6 乳酸菌的抑菌能力。采用單層瓊脂平板擴(kuò)散法，將固體 LB培養(yǎng)基溶化后倒入平 板中，待冷凝后，取菌液濃度為 108 CFU/mL的0.20 mL致病菌 菌液加入培養(yǎng)基平板上，用無(wú)菌