【指南與共識(shí)】高通量宏基因組測序技術(shù)檢測病原微生物的臨床應(yīng)用規(guī)范化專家共識(shí)

1、指南與共識(shí)】高通量宏基因組測序技術(shù)檢測病原微生物的臨床應(yīng)用規(guī)范化專家共識(shí)摘要：宏基因組下一代測序(mNGS)技術(shù)直接針對標(biāo)本中核酸無偏倚檢測 病原微生物序列。但是，mNGS需經(jīng)標(biāo)本前處理、核酸提取、文庫制備、上 機(jī)測序、數(shù)據(jù)庫比對、報(bào)告生成及結(jié)果解讀等一系列過程，對技術(shù)平臺(tái)及人 員素質(zhì)要求較高。為規(guī)范mNGS技術(shù)在感染性疾病診斷中的應(yīng)用，提高危 急重癥、疑難感染性疾病和新發(fā)突發(fā)傳染病的救治水平，在多項(xiàng)國家科技專 項(xiàng)的支持下，本領(lǐng)域有關(guān)專家起草了本共識(shí)，以促進(jìn)mNGS技術(shù)的規(guī)范應(yīng) 用和良性發(fā)展?？焖贉?zhǔn)確的微生物鑒定技術(shù)始終是臨床微生物關(guān)注的焦點(diǎn)。傳統(tǒng)微生物檢驗(yàn)，諸 如形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)、抗原抗體及靶向

2、核酸檢測等方法在解決疑難及未知病原微生物 上存在局限性32。新型宏基因組下一代測序(metagenomics next-generation sequencing, mNGS)技術(shù)直接針對樣本中所有核酸進(jìn)行無偏性測序，結(jié)合病原 微生物數(shù)據(jù)庫及特定算法，檢測樣本中含有的可能病原微生物序列。隨著該技術(shù) 的社會(huì)經(jīng)濟(jì)成本不斷降低和技術(shù)的不斷完善，已逐漸從科研走向臨床應(yīng)用，成為 臨床疑難和未知病原微生物檢驗(yàn)的重要手段a。利用mNGS技術(shù)進(jìn)行病原微生 物檢測需經(jīng)樣本前處理、核酸提取、文庫制備、上機(jī)測序并滿足測試的質(zhì)量控制 要求后，采用特定算法軟件與專用的病原微生物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，實(shí)現(xiàn)對病毒、 細(xì)菌、真菌、

3、寄生蟲及非經(jīng)典微生物等的檢測“° mNGS技術(shù)不依賴培養(yǎng)， 對常見病原微生物檢驗(yàn)陰性、經(jīng)驗(yàn)治療失敗、不明原因的危急重感染的病原學(xué)診 斷以及新發(fā)突發(fā)傳染病的病原體發(fā)現(xiàn)具有獨(dú)特價(jià)值s九。為進(jìn)一步規(guī)范mNGS技術(shù)在感染性疾病診斷中的應(yīng)用，提高危急重癥和疑難感 染性疾病的診療水平，在多項(xiàng)國家科技專項(xiàng)的支持下，參考國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)、共 識(shí)與規(guī)范電9,皿1匕0 14,兇，特別借鑒了高通量測序技術(shù)臨床檢測規(guī)范化應(yīng)用 北京專家共識(shí)(第一版通用部分)組織本領(lǐng)域有關(guān)專家起草了本共識(shí)，以促進(jìn)mNGS技術(shù)的規(guī)范應(yīng)用和良性發(fā)展。本共識(shí)中聲明的內(nèi)容為專家討論并 推薦的要點(diǎn)。一、臨床應(yīng)用的基本要求(-)適應(yīng)證基于醫(yī)

4、學(xué)決策的mNGS病原微生物檢測申請，一般用于傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法未能給出明確病原學(xué) 結(jié)果從而影響患者準(zhǔn)確診療的感染性疾病、新發(fā)突發(fā)傳染病、驗(yàn)證常規(guī)檢驗(yàn)結(jié)果或排除其他 發(fā)熱疾病。推薦臨床通過擬診先行傳統(tǒng)微生物檢驗(yàn)及聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction. PCR)檢測擬診疑似常見病原微生物，不盲目使用mNGS技術(shù)。在必要或緊急情 況下，如危急重癥、疑難感染、群體性感染事件等，可考慮作為一線檢測方法。表1列出了 mNGS臨床應(yīng)用適應(yīng)性說明。*1 mNGSIIS床應(yīng)用適應(yīng)性說明除成夾條G本獎(jiǎng)型由四安全位培齊.反黑紀(jì)的犯.巳定同BKPC丑期爛寤養(yǎng)、枕原儂領(lǐng)陰性片聯(lián)亙分必 PCR巾除了

5、甲甥煮：山、田.H5. M7).乙里天S.冠扛WfNL63. 229c CC43. HKU1. S«XRS. MARS. 2019-nCOV).戴黑苔頷5 里癥肺炎夠弘LF(1、N茶N).入僻電SA七B.辱交R.孱的Z. Of吸道臺(tái)翔電忠”kB.君電士第爽三手冬QH的次體、髓類衣原Q.宅三支麗.五聳CI匚麗 研之旅域面.百日朝您面及晶煙MS子面年檔聲麗見后祗曲理工WN-TgR* XRS舲了2t酶兔麗生皿見 巨掠其而.永運(yùn)石沈噠田.人乏修逐.勢遭W而.撫徹£療至.航 便為出£.元日E二4二WMES志耳內(nèi)類.美feK.-p. . _章炎.第芟給其.利京后注組性.PC磔

6、際了巨而肅口里窿。也名.dRgfi5性史I，2N.人®絲宓電6省.人死浪有無空.水也-就：法宏宏.歌類期解無燙.好突爸覆旋. Kfi3.克定imfL慶題華恬定麗見石與工場巨力E運(yùn)茸.陣班堂耳弼住.PCR揮陟了先玩侯W.旦大R.加定on).洌試、芍安氣華二. RK.小題夢5 炎號箱防炎耳爾奇白.至楊坦WW.結(jié)場穹EM、應(yīng)瀉住K揚(yáng)汗W ( 日正C、EHEC. EIEC、EPEC. E7EC ).記很僮R(shí).或壬式第血至少，諂松可O：姐百碎旗 霜廣序1硼近區(qū) GSaStlie 一 AY 口_工 “Tq_笈統(tǒng)哈丹后先獲得翼5竽沙的IS關(guān)關(guān)斥本注:8ALF為交W筲充同R澆液,EAEC力坊髏奐佳大

7、競典巖旗, EHEC為費(fèi)出位作兀版2交, HEC為場位案性大競典學(xué)被EPC為終防性正融?£麗.ETEC為假產(chǎn)王性大臨床上在選擇mNGS進(jìn)行病原微生物確認(rèn)時(shí)應(yīng)注意如下事項(xiàng)。1. mNGS檢測申請表：mNGS檢測實(shí)驗(yàn)室應(yīng)提供適合臨床使用的申請表。除患者基本信息外, 申請單應(yīng)包括標(biāo)本類型、擬診、現(xiàn)病史、既往史、流行病學(xué)史、關(guān)注的病原體、抗菌藥物使 用史等。另外，申請表中應(yīng)列出不同測序項(xiàng)目及適用范圍供醫(yī)生選擇C2. 靶向基因測序：基于高通量測序技術(shù)的病原微生物檢測，除無偏倚的mNGS外，還包括原 核生物的16s rRNA基因、真菌(5S rRNA基因兩端的ITS1、ITS2及25-28S r

8、RNA基因中的 D1及D2區(qū)等)以及特定病原微生物靶基因等。如懷疑沙眼衣原體可選即即(主要外膜蛋 白基因)，懷疑結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)可選等靶向基因 測序m .臨床醫(yī)生通過測序?qū)嶒?yàn)室提供的項(xiàng)目清單選擇適宜的項(xiàng)目，切忌大撒網(wǎng)式排 查。3. DNA測序與RNA測序的選擇：mNGS技術(shù)理論上可檢測以核酸為遺傳物質(zhì)的所有病原微生 物。若臨床上已排除病毒感染，可直接進(jìn)行DXA測序?？紤]到DNA測序受人源基因組影響較 大，為避免因死亡微生物DNA殘留影響現(xiàn)癥感染判斷，可進(jìn)行RNA測序"=" .當(dāng)懷疑病 毒感染，尤其對呼吸道、腦脊液

9、(cerebrospinal fluid, CSF)及血液標(biāo)本，或臨床表現(xiàn)復(fù) 雜，無特定懷疑方向時(shí)，需要同時(shí)對樣本中的DNA和RNA進(jìn)行測序。mNGS技術(shù)本身是一種 核酸檢測技術(shù)，由于不同微生物類別本身結(jié)構(gòu)差別，其核酸釋放效率差異明顯，尤其是真菌、 分枝桿菌等核酸提取需要特定的破壁處理，對于疑似真菌或分枝桿菌感染時(shí)也應(yīng)特別提出， 在檢測過程中增加必要的樣本處理過程。4. mNGS技術(shù)的局限性：受臨床mNGS技術(shù)本身、測序成本及數(shù)據(jù)庫等影響，常規(guī)mNGS策略 常無法獲得樣本中所有微生物的序列，臨床標(biāo)本中低濃度致病微生物可能會(huì)漏檢，同時(shí)針對 特定的耐藥或毒力基因的分析亦較難實(shí)現(xiàn)。如果需要對耐藥基因

10、或毒力基因進(jìn)行分析，可 以采用特定方法去除部分人源宿主核酸以提升微生物基因組比例，或者結(jié)合耐藥相關(guān)基因或 毒力基因進(jìn)行靶向捕獲富集后進(jìn)行。申請者如有特殊要求應(yīng)加以注明。(二)標(biāo)本類型及采集規(guī)范理論上，凡存在于臨床標(biāo)本中的病原微生物均可通過mNGS檢出，但該技術(shù)的準(zhǔn)確性依賴標(biāo) 本中微生物的核酸質(zhì)量及含量，也依賴于不同類別微生物核酸的提取效率。1.血液及高凝標(biāo)本：持針器肘靜脈采集35 ml 實(shí)驗(yàn)室提供專用采血管，即游離DNA樣本 保存管，內(nèi)含乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid. EDTA)抗凝劑和保護(hù) 劑，可抑制血漿中核酸酶及有核細(xì)胞中DNA的釋放。采

11、血時(shí)皮膚需徹底消毒，采血至刻度， 上下顛倒混勻510次，條碼標(biāo)記或編號。切忌在輸液處或?qū)Ч芴幉杉獦?biāo)本。此外，高凝 狀態(tài)的關(guān)節(jié)液、胸腹腔積液，甚至CSF也可采用此方法。如果增加RNA測序應(yīng)同時(shí)采2管。 2.支氣管肺泡灌洗液及痰液：嚴(yán)格按操作規(guī)程采集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF),棄去前段可能污染的部分，回收10 ml置無菌螺帽管(塑料或玻璃 質(zhì)地均可）中，內(nèi)含支氣管末梢和肺泡中的分泌物?？忍禈?biāo)本需在醫(yī)護(hù)人員協(xié)助下，患者用 生理鹽水漱口 23次，彎腰90° ,用力咳出深部痰35 1nl置無菌螺帽管中。若無法自行咳 痰，可通過吸痰

12、器從氣道采集。咽拭子只適用于呼吸道病毒檢測。檢查容器有無滲漏，緊蓋 后封口膜密封，條碼標(biāo)記或編號。3. CSF、房水及其他體液：經(jīng)專科醫(yī)生標(biāo)準(zhǔn)化采集方法獲得，無菌螺帽管封口膜密封。CSF （留 取第2管或第2管后標(biāo)本）、關(guān)節(jié)腔積液、膽汁等檢測病原微生物DNA或RNA需采集1 ml, 如同時(shí)進(jìn)行DNA及RNA測序應(yīng)采集2 ml。房水至少采集200 uK骨髓單獨(dú)進(jìn)行DNA或RNA 測序，0.5 ml標(biāo)本即可，如果同時(shí)進(jìn)行DNA及RNA測序則至少采集1 ml。這些臨床標(biāo)本采 集困難，切記防污染，避免經(jīng)引流管采集。胸腹腔積液需富集后提核酸，至少采集10 ml'-o 4.膿腫及深部組織：（1）開

13、放性膿腫需清創(chuàng)后采集深部傷口或潰瘍基底部分泌物拭子置無 菌管中。（2）封閉的膿腫需對病灶局部的皮膚或黏膜表而徹底消毒，注射器抽取膿液，若 少于3 ml,應(yīng)采集最大標(biāo)本量送檢。（3）深部組織感染需手術(shù)取材，置于無菌螺帽瓶中。 多數(shù)情況下組織中病原微生物含量低于膿液，盡可能取膿腫邊緣組織。5 .糞便標(biāo)本：至少黃豆粒大小的新鮮標(biāo)本，稀便35 ml,置螺帽容器中。6 .標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)：若標(biāo)本在24 h內(nèi)到達(dá)實(shí)驗(yàn)室并開始檢測，可考慮冰袋低溫運(yùn)輸：若運(yùn)輸時(shí)間 在2472 h內(nèi)，應(yīng)干冰運(yùn)輸，并立刻進(jìn)行標(biāo)本前處理和核酸提取：血液標(biāo)本4 °C冰箱保存 不得超過7 d （專用采血管），在運(yùn)輸過程中避免劇烈晃動(dòng)

14、：其他臨床標(biāo)本如需長期保存， 應(yīng)按如下原則執(zhí)行：（1）DNA測序：-20 保存不超過7 d0 （2） RNA測序：應(yīng)置-80 C° （3）避免標(biāo)本反復(fù)凍融，一般不得超過3次。（4）理論上-80 C可長期保存。（5）若懷 疑高致病性或新發(fā)突發(fā)傳染病，嚴(yán)格按照國內(nèi)傳染病法等相關(guān)法律要求包裝及轉(zhuǎn)運(yùn)。盡可能 在醫(yī)院生物安全防護(hù)條件下抽提核酸后再送測序。建議1原則上，臨床懷疑病原微生物感染，常規(guī)方法未得到明確病原學(xué)證據(jù)而影響臨床救 治時(shí)，可利用mNGS進(jìn)一步確認(rèn)。鼓勵(lì)臨床在排除常見病原微生物后有目的選擇mNGS。申請 單應(yīng)填寫臨床表現(xiàn)、癥狀體征、治療經(jīng)過、現(xiàn)病史、流行病學(xué)史及既往史等。測序?qū)嶒?yàn)

15、室應(yīng) 讓申請者知曉不同類型感染性疾病的標(biāo)本選擇、采集時(shí)機(jī)、采集方式、送檢量、轉(zhuǎn)運(yùn)及儲(chǔ)存 條件、不同mNGS檢測策略的適用范圍。疑為傳染病應(yīng)符合國家相關(guān)生物安全標(biāo)本采集及轉(zhuǎn) 運(yùn)要求。申請者可提出重點(diǎn)關(guān)注的病原體,如呼吸道病毒、結(jié)核分枝桿菌、真菌及寄生蟲等。 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)提供適宜臨床使用的申請單，內(nèi)容應(yīng)包括不同inNGS測序策略及對應(yīng)的適應(yīng)證。（三）報(bào)告解讀原則目前病原微生物的確認(rèn)依然遵循Koch法則，即：（1）該微生物存在于同類疾病患者中，健 康個(gè)體則無此微生物。（2）該微生物必須能夠被分離、培養(yǎng)、純化。（3）該微生物接種于 易感動(dòng)物可引起相同疾病，并可從被接種的動(dòng)物體內(nèi)分離到此微生物。（4）該微生

16、物可引 起每一個(gè)個(gè)體發(fā)病。但是，作為一種臨床檢驗(yàn)方法，利用mNGS確認(rèn)的感染病例并不能夠 完全滿足傳統(tǒng)Koch法則，作為該法則的補(bǔ)充，mXGS具有如下特征。1 . mNGS結(jié)果分析：理論上，凡存在于標(biāo)本中的微生物均可檢出，但因不同類型微生物基因 組長度和測序平臺(tái)等差異，導(dǎo)致無法針對所有微生物建立統(tǒng)一的陰陽性判讀標(biāo)準(zhǔn)廣* ,幻。 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)預(yù)期用途、標(biāo)本類型、檢測目標(biāo)和技術(shù)特點(diǎn)，建立并驗(yàn)證陽性閾值及判讀標(biāo)準(zhǔn)。 原則上mNGS的臨床意義同核酸檢測。另外，決定一個(gè)序列是否來自于某種微生物，很大程 度上取決于用于比較的參考微生物序列數(shù)據(jù)庫，如果數(shù)據(jù)庫中未包括該物種以及與其進(jìn)化距 離較近物種的基因組序

17、列可能造成結(jié)果不準(zhǔn)確。2 . mNGS結(jié)果確認(rèn)：如果檢出的微生物符合疾病特征則可能是引起感染的病原微生物，但不 能只從序列數(shù)多少確認(rèn)，需考慮序列在基因組上的覆蓋度、特異性及保守性e該病原微 生物可通過PCR等方法得到驗(yàn)證，如呼吸道標(biāo)本中的流感病毒、腺病毒及新冠病毒等；糞便 標(biāo)本中的志賀菌、沙門菌及諾如病毒等：CSF中的腸病毒、單純皰疹病毒及西尼羅河病毒等； 血液中的布魯菌、巴爾通體及人類免疫缺陷病毒等。如果檢出高序列數(shù)的某種未命名微生物, 應(yīng)高度警惕新物種的出現(xiàn)。3 .mNGS陽性閾值及判讀標(biāo)準(zhǔn)：報(bào)告單中的陽性閾值以百萬分子序列數(shù)確定。陽性閾值的確 定不依賴某個(gè)單一的指標(biāo)，包括但不限于特定微生

18、物的檢出序列數(shù)、歸一化每百萬序列（reads per million, RPM）的比值、檢出物種的基因組覆蓋度等。病毒因極少存活于環(huán) 境中，因此，少量的特異序列檢出即可判為陽性（如少于3條特異序列）避免報(bào)出與臨 床不相關(guān)的環(huán)境菌、共生菌及條件致病菌等。一般序列數(shù)越高病原微生物的可能性越大（數(shù) 十條特異性序列）。對于結(jié)核分枝桿菌、鼠疫耶爾森菌、布魯菌等臨床關(guān)注度高、且較難檢 測的病原菌可采用獨(dú)立的判讀標(biāo)準(zhǔn)，即檢出1條特異序列即可判為陽性上寄生蟲基因組 因較為復(fù)雜，且與人源基因組相似，應(yīng)在嚴(yán)格確認(rèn)序列特異性之后再行判讀“L如果檢出序 列為新發(fā)物種，則可不受閾值限制，但需給出同源性比對結(jié)果。4 .微

19、生物種群致?。簾o菌部位膿腫標(biāo)本可見多種病原微生物共檢出現(xiàn)象。如腦膿腫、頸間 隙膿腫、咽旁膿腫、口腔膿腫等，所檢出的微生物序列數(shù)均可能達(dá)到陽性閾值，多數(shù)為嚴(yán)格 厭氧菌與兼性厭氧菌共生。這種因微生物種群而致病的現(xiàn)象稱為一個(gè)種群或一個(gè)微生物生態(tài) 系統(tǒng)引起一種疾病，而非Koch法則的一種病原菌引起一種疾病。盡管種群致病的理論還需 進(jìn)行深入探討，但隨著深度測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，這種現(xiàn)象在臨床上將得到更多驗(yàn)證.5 .不可培養(yǎng)或難培養(yǎng)微生物的結(jié)果驗(yàn)證：mNGS針對標(biāo)本中所有病原微生物核酸序列，不可 培養(yǎng)或難培養(yǎng)微生物不能通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法再現(xiàn)，且這類病原微生物同樣缺乏血清學(xué)或抗原 檢測。除病毒、螺旋體、立克次體

20、、寄生蟲外，這些微生物可通過核酸檢測驗(yàn)證，測序同樣 是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。6 .致病菌、定植菌和污染菌：當(dāng)確定條件致病菌為病原菌時(shí)應(yīng)考慮患者免疫狀態(tài)、基礎(chǔ)疾 病及標(biāo)本來源。若出現(xiàn)大量背景菌或雜菌序列而無主導(dǎo)微生物應(yīng)首先考慮污染，其次考慮條 件致病菌。如果外科手術(shù)或其他有創(chuàng)操作后，無菌部位來源的標(biāo)本，表現(xiàn)為細(xì)菌單一，序列 數(shù)可能不高，應(yīng)結(jié)合臨床考慮醫(yī)院感染，此時(shí)應(yīng)與背景菌區(qū)分，不可一味認(rèn)為污染。mNGS不 能區(qū)分微生物是定植還是感染。mNGS檢測陰性對排除感染有意義，但也應(yīng)結(jié)合臨床表現(xiàn)作 出正確的診斷“7 .高度傳染性微生物：針對具有高度傳染性的特殊病原微生物，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)相關(guān)衛(wèi)生行 政部門的規(guī)定制定

21、特殊報(bào)告程序，標(biāo)本上傳疾病預(yù)防控制中心（Center for Disease Control and Prevention, CDC）,如當(dāng)出現(xiàn)像疑似01群或0139群霍亂弧菌、鼠疫耶爾森 菌、埃博拉病毒或新型病原微生物等，應(yīng)盡快采用其他方法驗(yàn)證，如PCR、血清學(xué)等，如果 支持測序結(jié)果應(yīng)迅速反饋臨床和CDC系統(tǒng)。8 .提高測序深度：mNGS常規(guī)數(shù)據(jù)量對耐藥和毒力基因檢測有局限性"如，因其得到的微生 物序列數(shù)不足樣本總序列的5%,特異性序列覆蓋度不到微生物基因組1%,在這種情況下進(jìn) 行耐藥基因、毒力島基因、轉(zhuǎn)錄組及代謝通路分析幾乎不可能。目前，有以下幾種做法可提 高測序深度：（1）在常

22、規(guī)測序深度下已明確了病原微生物，再提高測序數(shù)據(jù)量至可覆蓋該 物種基因組80樂但花費(fèi)巨大不適合普及。（2）在宏基因組基礎(chǔ)上趣加固定的若干種耐藥基 因進(jìn)行靶向測序。（3）研發(fā)降低人源核酸比例的創(chuàng)新方法，獲得更多微生物測序數(shù)據(jù)量”.% 建議2 mNGS作為一種新型檢測方法，其臨床意義仍未超出核酸檢測范疇，它補(bǔ)充了傳統(tǒng)病 原微生物確認(rèn)的Koch法則。mNGS可檢測難培養(yǎng)、罕見或新發(fā)病原微生物，可同時(shí)給出多種 病原微生物信息，因此，在一份無菌部位來源的臨床標(biāo)本（尤其膿腫）中檢出微生物種群（包 括不同類別或同類不同種屬）不應(yīng)輕易視為污染。如果這些微生物的存在符合臨床診斷，應(yīng) 給予抗菌藥物全覆蓋，這恰好體現(xiàn)

23、了該技術(shù)對全面認(rèn)識(shí)病原微生物的優(yōu)越性。mNGS常規(guī)數(shù) 據(jù)量對耐藥和毒力基因檢測有局限性，如需耐藥和致病信息需提高測序數(shù)據(jù)量。建議3如果檢出的病原微生物符合臨床預(yù)期，應(yīng)確認(rèn)序列結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性。為提高 結(jié)果的特異性，降低錯(cuò)誤率，即使病原微生物也應(yīng)建立陽性閾值。陽性閾值建立在微生物特 異序列數(shù)及其在基因組覆蓋度上。臨床醫(yī)生在解讀條件致病菌時(shí)，應(yīng)排除污染和背景微生 物，考慮患者免疫狀態(tài)及與臨床表現(xiàn)的符合性。mNGS結(jié)果不能作為臨床決策的唯一依據(jù)， 結(jié)果陰性也需結(jié)合臨床排除感染。二、mNGS檢測病原微生物的實(shí)驗(yàn)室要求mNGS是NGS技術(shù)的一種，多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用邊合成邊測序方法9。該方法使單個(gè)DNA分

24、 子擴(kuò)增成大量相同的DNA,然后同步復(fù)制，以此增強(qiáng)熒光信號強(qiáng)度，從而讀出DNA序列。 因此，mNGS具有通量高、讀長短、流程復(fù)雜、操作環(huán)節(jié)多、對實(shí)驗(yàn)環(huán)境及人員要求高的特 點(diǎn)。因此，對實(shí)驗(yàn)室設(shè)施要求高，需要嚴(yán)格遵守臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法的相 關(guān)規(guī)定。（一）實(shí)驗(yàn)室分區(qū)及人員要求1 .基本原則：即各區(qū)獨(dú)立、注意風(fēng)向、因地制宜、方便工作，以達(dá)到工作有序、互不干擾、 防止污染、報(bào)告及時(shí)口3 mNGS檢測分“干、濕實(shí)驗(yàn)”，“濕實(shí)驗(yàn)”指從樣本處理到測序數(shù) 據(jù)產(chǎn)生的整個(gè)測序過程，需要在標(biāo)準(zhǔn)的測序分區(qū)實(shí)驗(yàn)室完成。一般“測試分區(qū)實(shí)驗(yàn)室”分試 劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本處理與核酸提取區(qū)、文庫構(gòu)建區(qū)及測序區(qū)?！案蓪?shí)驗(yàn)

25、”指測序數(shù)據(jù)的生物信 息學(xué)分析。2 .單向工作流程：若實(shí)驗(yàn)室設(shè)有緩沖間，緩沖間統(tǒng)一為正壓或負(fù)壓。若未設(shè)緩沖間，從試劑 準(zhǔn)備區(qū)到測序區(qū)壓力依次遞減。為避免相互干擾，DNA和RNA操作（核酸提取）應(yīng)分開。如 在同一實(shí)驗(yàn)室應(yīng)分兩個(gè)區(qū)域，主要儀器耗材包括生物安全柜、核酸提取儀、移液槍、離心機(jī)、 試劑及耗材等不可混用。如使用瓊脂糖凝膠電泳檢查核酸及文庫質(zhì)量，則需有單獨(dú)的電泳區(qū)。 靶向測序PCR應(yīng)在單獨(dú)的擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行o3 .污染防控：應(yīng)定期進(jìn)行環(huán)境評估，為了監(jiān)控污染需制定試劑、儀器和實(shí)驗(yàn)室物表定期消毒 的標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序（standard operation procedure, SOP） o還應(yīng)對無模板參考品

26、或陽性對 照中可能出現(xiàn)的污染物進(jìn)行連續(xù)跟蹤，并使用保守的閾值標(biāo)準(zhǔn)（見第一章第三部分報(bào)告解讀 原則3）,最大程度減少假陽性結(jié)果產(chǎn)生4 .實(shí)驗(yàn)室人員能力：實(shí)驗(yàn)室人員應(yīng)參加相關(guān)培訓(xùn)，并獲得國家要求的相應(yīng)資質(zhì)，檢驗(yàn)人 員應(yīng)具備mNGS項(xiàng)目制定和質(zhì)量控制能力。報(bào)告簽發(fā)人員應(yīng)具備臨床醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)和分子 生物學(xué)背景，掌握相關(guān)臨床診療指南，疑難報(bào)告的簽發(fā)及結(jié)果解釋需咨詢相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜?。開 展mNGS實(shí)驗(yàn)室自建檢測項(xiàng)目(laboratory-developed tests> LDT)的實(shí)驗(yàn)室同時(shí)還應(yīng)具備 生物信息學(xué)分析的專業(yè)人員，生物信息學(xué)分析人員需熟練掌握mNGS檢測原理及生物信息軟 件，具備數(shù)據(jù)信息維

27、護(hù)和管理、開發(fā)新算法及更新數(shù)據(jù)庠的能力。建議4微生物檢測非靶向mNGS實(shí)驗(yàn)室至少應(yīng)包括試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、文庫制備區(qū)及 測序區(qū)。實(shí)驗(yàn)室工作流程應(yīng)為單向。若實(shí)驗(yàn)室設(shè)有緩沖間，緩沖間統(tǒng)一為正壓或負(fù)壓。若未 設(shè)緩沖間，壓力從試劑準(zhǔn)備區(qū)到測序區(qū)依次遞減。DNA和RNA核酸提取分區(qū)域進(jìn)行。若開展 靶向擴(kuò)增NGS測序，應(yīng)額外增加擴(kuò)增區(qū)及電泳區(qū)。若同時(shí)開展遺傳及腫瘤NGS,核酸提取及 建庫過程不宜與之混用。報(bào)告簽發(fā)人員應(yīng)具備臨床醫(yī)學(xué)、病原微生物或分子生物學(xué)背景，罕 見病原微生物結(jié)果解釋可咨詢相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜?。若配備有生物信息學(xué)分析人員，需掌握mNGS 微生物檢測軟件應(yīng)用，具備數(shù)據(jù)信息維護(hù)和管理、開發(fā)新算法及

28、更新數(shù)據(jù)庫的能力。(二)檢測平臺(tái)1 .建立標(biāo)本前處理及核酸提取方法：標(biāo)本預(yù)處理方法和核酸提取技術(shù)在使用前需經(jīng)過驗(yàn)證。2 .測序平分的選擇：包括儀器設(shè)備的選擇、測序平臺(tái)質(zhì)量的評價(jià)及主流測序平臺(tái)類型3個(gè)方 而。配備開展高通量測序檢測項(xiàng)目所需的所有儀器設(shè)備：優(yōu)先選擇國家藥品監(jiān)督管理局 (National Medical Products Administration, NMPA)批準(zhǔn)的測序平臺(tái)和配套試劑。測序平臺(tái)應(yīng)達(dá)到臨床預(yù)期：除開展?jié)M足臨床需求的項(xiàng)目外，測序通量、序列的準(zhǔn)確率、支持 讀長、儀器性能驗(yàn)證、內(nèi)部質(zhì)控、測序周期及批量檢測能力等也是評價(jià)測序平臺(tái)質(zhì)量的重要 指標(biāo)。主流測序平分：目前，mNGS

29、主流測序方法有邊合成邊測序、DNA納米球測序及半導(dǎo)體測序 15 5： O實(shí)驗(yàn)室根據(jù)需要選擇適宜的檢測平臺(tái)，使用模擬樣本或臨床已知微生物樣本驗(yàn)證測序 全流程。表2列出了不同類型測序平臺(tái)的技術(shù)特點(diǎn)及環(huán)境要求。力2主諦融速等平臺(tái)的技術(shù)特點(diǎn)及林W荽求由合儂> 我停技術(shù)ON極麻板I吊食術(shù)半日體測后楨術(shù)F空港;22±3 ) P 棺?班受境20%叱：三匹三洽多 面=，：22±3)*0相過-20%-以保：31序或位的注分良 氈2030 < ;相游=8的%6%：冽字至這定的;甘岳為百萬4£或更S友改以上；程丹會(huì)一甌 為百萬或次更二；百合一甌彳境需：的治送三間及祥戈*球a

30、3 .自動(dòng)化測序平臺(tái)：mNGS微生物檢測的靈敏度與標(biāo)本背景有關(guān)，如組織標(biāo)本中含有大量人 源基因組，導(dǎo)致微生物序列數(shù)占比減少，通過高效自動(dòng)化測序平臺(tái)，增加測序深度可提高檢 測靈敏度。自動(dòng)化過程降低人工操作、減低外源污染，實(shí)驗(yàn)室分區(qū)簡化。已有文獻(xiàn)報(bào)道實(shí)現(xiàn) 了血液、CSF、尿液等標(biāo)本，從文庫構(gòu)建到報(bào)告發(fā)放全自動(dòng)化過程。自動(dòng)化平臺(tái)應(yīng)包括標(biāo) 本前處理、核酸提取、文庫構(gòu)建、高通量測序、生物信息分析和報(bào)告發(fā)送。（三）生物信息平臺(tái)生物信息學(xué)分析（也稱“干實(shí)驗(yàn)”）是mNGS檢測中的重要部分，是對測序產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù) 進(jìn)行處理和分析，包括但不限于數(shù)據(jù)質(zhì)控、人源序列比對過濃、微生物物種檢測等過程” J 目前尚無統(tǒng)一的

31、標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)分析程序及軟件 數(shù)據(jù)分析流程由多種分析軟件配套完成，包 括數(shù)據(jù)質(zhì)控軟件（如 Fastp Trimmomaticx FastQC 等）、比對軟件（如 Bowtie2x BHA、MAQ、 S0AP2、Blast 等）、物種分析軟件（如 SURPI、Taxonomer、MegaBLAST 等）% 人源 基因組和微生物基因組檢測數(shù)據(jù)庫有美國國家生物技術(shù)信息中心、美國病原體系統(tǒng)資源整合 中心”二真核生物病原體數(shù)據(jù)庫"及病毒病原數(shù)據(jù)分析資源庫g等，在構(gòu)建物種比對數(shù)據(jù) 庫時(shí)可予以選擇，還有耐藥基因分析可考慮抗性基因數(shù)據(jù)庫e “，毒力基因分析可使用毒 力基因分析數(shù)據(jù)庫依等。隨著mNGS產(chǎn)品

32、的體外診斷化發(fā)展，結(jié)合人工智能技術(shù)的自動(dòng)化 的數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)已經(jīng)能夠提供給臨床實(shí)驗(yàn)室。建議5實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建mNGS技術(shù)平臺(tái)以擬開展的檢測項(xiàng)目及科研工作為依據(jù)，充分論證不同檢 測平臺(tái)的適用性，包括生物信息平臺(tái)。技術(shù)平臺(tái)的建設(shè)應(yīng)包含標(biāo)本處理、核酸提取、文庫構(gòu) 建（DNA和RNA文庫）、高通量測序、核酸擴(kuò)增、產(chǎn)物分析、數(shù)據(jù)分析等全流程。采用模擬 樣本或臨床已知病原體樣本對所有技術(shù)環(huán)節(jié)進(jìn)行驗(yàn)證，包括檢測靈敏性、測序通量、序列質(zhì) 量、讀取準(zhǔn)確率、支持讀長、儀器性能驗(yàn)證、內(nèi)部質(zhì)控、測序周期及生物學(xué)信息分析能力。 比對數(shù)據(jù)庫應(yīng)滿足各類微生物檢測需求.三、mNGS微生物檢測方法的建立（一）標(biāo)本前處理標(biāo)本液化、濃縮及

33、去除宿主核酸等前處理方法和設(shè)備使用應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化。所有標(biāo)本應(yīng)具有唯一標(biāo) 識(shí)，防止在信息錄入和標(biāo)本分揀過程中交叉污染。根據(jù)申請要求提前準(zhǔn)備被檢測微生物所需 的文庫資料及生物信息分析軟件。建立臨床標(biāo)本的前處理程序，包括復(fù)雜標(biāo)本、微量標(biāo)本和組織標(biāo)本的前處理程序，針對真菌和/或分枝桿菌等特殊微生物的破壁處理程序。建立RNA 病毒、微生物游離核酸測序的前處理方法。建立組織標(biāo)本研磨方法，具體方法見表3。*3不同類型臨床標(biāo)本而處理方法標(biāo)本買出的枳多4 （斯石忠%4七國1）一 .（1）. «1020 rngfiD400 pl2）小建沈?；駿地,無苦刀片切注謗更礪蓑啟棒寸彩妥法或膝三分泌檢A5mi. 士盧二

34、承化利二=硝二,SiS3Z37£緲£ ,代與全生;解S旅謝空語30mh .版上活1.5ml. 10SRBAlCO&X源 35 mm .三起密險(xiǎn).GALLIO ml, 10 000x015 min.三二洋；走刀夠班可武若巨疾I.液幺后里 15 ml. 10 000/第心1521發(fā).冠才法.孕叼液、關(guān) 向瓦硝.卻貼卷5、S&S市福子與子依二加45。M 1*呸馮族西5 mm .現(xiàn)物J西慮常皿亥咫谷液可元至苔亙短雹.DNd和西.1.5mmooox純。5 min.沉電S他.如題三跳10ml.45 w純二1。mh .底士涌1.5ml MOOT，成。15min. Kii攝

35、啰但.號出:若三儂%后咋可上注:PB5力加象0卻通：血F為支，3宗趙斌短（二）核酸提取1 .使用經(jīng)性能確認(rèn)的核酸提取試劑：臨床標(biāo)本中存在不同類型的病原微生物，核酸提取方法 的可重復(fù)性和提取效率對保證核酸的完整性及純度至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)臨床標(biāo)本類型和 微生物種類建立針對性的標(biāo)準(zhǔn)化提取程序。建議使用經(jīng)性能驗(yàn)證的商品化提取試劑及設(shè)備。2 .核酸質(zhì)量驗(yàn)證：（1）高質(zhì)量的DNA 4s/&。應(yīng)在1.71.9, &/4“應(yīng)2,可用居瓊脂糖 凝膠電泳驗(yàn)證DNA質(zhì)量（無雜帶、無拖尾、背景無蛋白污染）。（2）DNA完整性（如Agilent 2100 Bioanalyzer）檢測，如果大部分片段

36、在200 nt （血漿游離DNA除外,140 nt）以下 說明DNA降解嚴(yán)重，需重提。（3）高質(zhì)量的RNA生/加。應(yīng)在1. 82. 0,4國/4”應(yīng)2。（4） 微量的核酸采用Qubit熒光染料法進(jìn)行定量測定皿。3 .核酸含量極低樣本的處理：如CSF、房水等，應(yīng)在標(biāo)本中加50 ul ATL （DX）研磨珠，低 頻震蕩10 min,離心后取150 ulo加入150 u 1裂解液和8 口1蛋白酶K,渦旋震蕩混勻 30 s, 56 C恒溫震蕩15 min （若無恒溫震蕩儀，可用金屬浴代替，期間每3 min混勻1 次）：取裂解后的樣本300 Ml,加入磁珠240 U1,震蕩混勻，室溫靜置5 min,上清

37、提 核酸.按照商品化的操作說明進(jìn)行。4 .去除人源DNA的方法：多數(shù)臨床標(biāo)本存在大量宿主細(xì)胞和宿主游離核酸，微生物核酸豐度 相對較低。因此，在核酸提取環(huán)節(jié)中可考慮建立高效去宿主DNA方法，提高mNGS微生物檢 測的靈敏度“，去除人源核酸的方法選擇需要結(jié)合臨床檢測目的，舉例如下。去污劑處理：因人源細(xì)胞的細(xì)胞膜較微生物外壁脆弱，在核酸提取前用溫和去污劑（如身背） 裂解宿主細(xì)胞釋放DNA,再用脫氧核糖核酸酶I降解人源DNA,通?？墒刮⑸锔患侍?高1 000倍。低滲溶液破壞宿主細(xì)胞:使用細(xì)胞膜不透性的疊氮碘化丙錠結(jié)合暴露在溶液中的宿主DNA 4 抗甲基化DNA磁珠：因人源DNA甲基化程度高，大多

38、數(shù)微生物基因組中缺乏甲基化DNA,使 用抗甲基化DNA磁珠可有效去除人源DNA,可實(shí)現(xiàn)35倍富集.使用CRISPR-Cas9 （基因編輯技術(shù)）剝離目標(biāo)序列：此法對構(gòu)建RNA文庫較為有利，可提高 非編碼rRNA序列含量，但對DNA文庫構(gòu)建意義不大,不推薦花費(fèi)更大財(cái)力去除全部人源DXA。 5. qPCR預(yù)估人源核酸的去除效率：去除宿主DNA后，對宿主及微生物常用的標(biāo)志基因，如 B肌動(dòng)蛋白基因、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因和16s rRNA基因等，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR （quantitative real-time PCR, qPCR）定量檢測，通過經(jīng)驗(yàn)積累大概預(yù)估宿主殘余比例及 有效數(shù)據(jù)比例，必要

39、時(shí)可提高測序數(shù)據(jù)量。（三）文庫制備文庫制備是將基因組DNA片段化并在片段末端連接寡核昔酸接頭的過程，文庠質(zhì)量直接影 響測序數(shù)據(jù)質(zhì)量。目前常用的建庫方法有超聲波打斷建庫、酶切建庫及轉(zhuǎn)座酶建庫等，選用 操作簡單的方法對降低污染有利。1 .明確核酸質(zhì)量及文庫產(chǎn)出標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)室根據(jù)文庫制備方法及測序平臺(tái)明確起始核酸質(zhì)量標(biāo) 準(zhǔn)（純度、濃度）及文庫產(chǎn)出標(biāo)準(zhǔn)（文庫濃度、片段大小等）。2 .建議使用配套試劑：若起始DNA在10 ng以上，可采用普通建庠試劑盒；若DNA在100 pg10 ng之間，則采用超微量DXA建庫試劑盒；若DXA量低于下限，應(yīng)先行全基因組擴(kuò)增， 再進(jìn)行建庫。3 .構(gòu)建RNA文庫：逆轉(zhuǎn)錄前需

40、在冰上操作，防止RNA降解。應(yīng)添加RNA酶抑制劑，必要時(shí)在 建庫前采用雜交捕獲法或核糖體分離法去除rRNR R。4 .文庫質(zhì)量：可采用Qubit熒光染料法檢測文庫濃度，qPCR檢測文庫中有效連接接頭的核 酸濃度。上機(jī)前需根據(jù)不同的測序平臺(tái)對文庫濃度的要求進(jìn)行。高質(zhì)量的文庫DXA,其 通常在L752.00。此外，還應(yīng)采用生物分析設(shè)備檢測文庫片段大小及峰型，文庫片段大小 為插入片段和接頭序列的總長度，合格文庫插入片段長度大于100 bp,文庫應(yīng)主峰明顯、 無雜峰、無接頭、無引物二聚體建議6實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備針對不同類型臨床標(biāo)本的前處理方法，尤其針對復(fù)雜和極微量標(biāo)本應(yīng) 具備經(jīng)驗(yàn)證的靈敏的手段。無論DNA還

41、是RNA核酸提取質(zhì)量應(yīng)滿足測序要求。在核酸提取 的過程中應(yīng)引入經(jīng)驗(yàn)證的降低人源核酸處理方法。推薦使用配套試劑構(gòu)建文庫，根據(jù)初始核 酸濃度選擇文庫建庫試劑盒，若DNA量低于下限應(yīng)先行全基因組擴(kuò)增再進(jìn)行建庫，文庫核 酸濃度、純度及長度應(yīng)達(dá)到測序（包括靶向測序和宏基因組測序）要求。文庫制備方法需用 已知臨床標(biāo)本或模擬樣品或質(zhì)控品進(jìn)行驗(yàn)證或開展實(shí)驗(yàn)室間比對，合格后方可用于臨床。（四）上機(jī)測序測序數(shù)據(jù)量指每個(gè)樣本測序所得的序列數(shù)或堿基數(shù)（nt）,二者可相互轉(zhuǎn)換，一般宏基因組 測序用序列數(shù)表示。測序數(shù)據(jù)量與預(yù)期用途（如微生物檢測、耐藥基因檢測、微生物組學(xué)分 析、宏基因組學(xué)分析等）、樣本中微生物與人源核酸占

42、比、測序靈敏度以及測序成本等因素 相關(guān)。mNGS微生物檢測的靈敏度與標(biāo)本人源核酸含量有關(guān)，不同類型臨床樣本人源核酸平均含量 不一樣，為保證結(jié)果可靠性，在相同樣本處理和核酸提取方法時(shí)，通常不同類型臨床標(biāo)本推 薦不同測序數(shù)據(jù)量，原則上背景簡單的標(biāo)本如CSF、血漿等（人源核酸含量低）較低的測序 數(shù)據(jù)量即可滿足病原微生物檢出。在條件允許的情況下可增加測序數(shù)據(jù)量以提高檢測靈敏 度?？赏ㄟ^數(shù)據(jù)抽樣，即從下機(jī)數(shù)據(jù)中（如20 M）隨機(jī)抽取15 M組成一個(gè)模擬的15 M測 序數(shù)據(jù)集模擬分析不同測序數(shù)據(jù)量、不同物種的檢測限，從而最終確定不同標(biāo)本類型的最佳 測序數(shù)據(jù)量。通常靶向測序的數(shù)據(jù)量應(yīng)3萬條序列，宏基因組測序

43、鳥槍法測序數(shù)據(jù)量應(yīng)22 000萬（20 million, 20 M）高質(zhì)量序列,準(zhǔn)確度Q30比例N85%。也有文獻(xiàn)推薦CSF600萬 條（6 M）序列J八血液游離DNA 2 400萬條序列（24 M）、咽拭子病毒檢測1 000萬 條（10M）序列”等。測序數(shù)據(jù)量提升可顯著提高靈敏度，以血流感染為例，每個(gè)標(biāo)本平均 20 M序列時(shí)，總體靈敏度為31簿”:每個(gè)標(biāo)本平均24 M序列時(shí)，總體靈敏度達(dá)到48$ ”， 當(dāng)每個(gè)標(biāo)本平均數(shù)據(jù)量達(dá)到33 M序列時(shí)，總體靈敏度達(dá)到71$旬.（五）生物信息學(xué)分析生物信息分析是對測序得到的原始序列進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理的過程，以預(yù)定程序執(zhí)行。該流 程由多個(gè)軟件組成，包括去除

44、人源序列、處理微生物序列及相關(guān)元數(shù)據(jù)、檢測候選目標(biāo)微生 物，實(shí)現(xiàn)檢測與數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)換。數(shù)據(jù)分析中應(yīng)考慮預(yù)期用途、軟硬件功能、數(shù)據(jù)存儲(chǔ)位置、版 本號及信息備份等。同時(shí)應(yīng)確?；颊咝畔踩?，設(shè)置讀取規(guī)則、人員權(quán)限、數(shù)據(jù)異常提取的 警報(bào).目前已經(jīng)具有商業(yè)化的自動(dòng)分析系統(tǒng)可以選擇，實(shí)驗(yàn)室也可選擇與國際同步的算法和 軟件，搭建實(shí)驗(yàn)室自己的分析流程，搭建過程中應(yīng)選已知陰陽性樣本或質(zhì)控品進(jìn)行生物信息 學(xué)分析能力模擬測試。1 .序列質(zhì)量：堿基質(zhì)量值是衡量測序質(zhì)量的重要指標(biāo)，用于評估下機(jī)序列數(shù)的準(zhǔn)確度。質(zhì)量 值（Q）越高代表堿基被測錯(cuò)的概率（P）越低，兩者關(guān)系為Q=-10 IgPo Q20對應(yīng)的測序錯(cuò) 誤概率為現(xiàn)、準(zhǔn)

45、確率99%a Q30對應(yīng)的測序錯(cuò)誤概率為1%、準(zhǔn)確率99. 9機(jī) 常用Q20和Q30 分別代表質(zhì)量值220或30的堿基所占百分比。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)要求保證Q30至少達(dá)到85% 。在 對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析之前，應(yīng)首先進(jìn)行質(zhì)量控制，去除讀長過短（如50 bp）和低質(zhì)量的序列，獲得的高質(zhì)量序列再與人源基因組比對去除，剩余序列進(jìn)入后續(xù)的微生物檢測分析（ix. IK X5） O2 .判讀標(biāo)準(zhǔn)：判讀標(biāo)準(zhǔn)與測序數(shù)據(jù)量密切相關(guān)，在生物信息學(xué)分析流程搭建和優(yōu)化過程中， 應(yīng)確定判讀標(biāo)準(zhǔn)，以區(qū)分陰陽性結(jié)果。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對不同類型的臨床標(biāo)本和不同類型微生物建 立不同的判讀標(biāo)準(zhǔn)。判讀標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括但不限于檢出序列數(shù)、基因組覆蓋度、微生物

46、豐度、測 序深度、離散度、序M比值等技術(shù)指標(biāo)s 高通量測序得到的是大量短序列（通常在100 bp以內(nèi)），因此，當(dāng)序列比對到參考序列時(shí)， 如同時(shí)出現(xiàn)人源和某種微生物，則優(yōu)先判為宿主序列。判讀為某微生物屬水平的序列數(shù)應(yīng)大 于種水平。當(dāng)種水平序列數(shù)越接近屬水平，則該物種的可能性越高。比對到微生物的序列數(shù) 與基因組測序覆蓋度呈正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)基因組覆蓋度、序列特異性等參數(shù)計(jì)算出病原 微生物檢測可信度（舟），便于臨床判斷。其他判讀方法：有文獻(xiàn)通過自建參考品先設(shè)定判讀標(biāo)準(zhǔn)，再采用臨床標(biāo)本進(jìn)行判讀標(biāo)準(zhǔn)的確 認(rèn)。也有文獻(xiàn)通過檢測一定數(shù)量的已知陰陽性樣本，采用統(tǒng)沖學(xué)方法，如受試者工作特征曲 線或準(zhǔn)確率-召回

47、率（precision-recall. PR）曲線來確定合理的判讀標(biāo)準(zhǔn)。3 .陽性閾值：判讀為陽性的界值即為陽性閾值。閾值的設(shè)置與檢出序列數(shù)、檢出序列的特異 性、特異序列的基因覆蓋度、該物種同源性復(fù)雜程度以及檢測靈敏度有關(guān)。即使病原微生物 也應(yīng)制定陽性閾值。針對某些特殊傳染病病原微生物，在排除污染的前提下，即使檢出1條 序列也應(yīng)視為陽性，如MTB、鼠疫耶爾森菌及流行性出血熱病毒等匕”4 .數(shù)據(jù)庫:包含兩個(gè)部分，即微生物檢測數(shù)據(jù)庫和人源數(shù)據(jù)庫。微生物檢測數(shù)據(jù)庫包含細(xì)菌、 真菌、病毒和寄生蟲基因組序列信息，其中支原體、衣原體、螺旋體、立克次體視情況可獨(dú) 立也可并入細(xì)菌類別中。公共數(shù)據(jù)庫需經(jīng)驗(yàn)證方可

48、使用。構(gòu)建微生物數(shù)據(jù)庫應(yīng)優(yōu)先選擇全長 參考基因組以及測序質(zhì)量高、樣本來源、臨床信息完整的序列。臨床重要的病原微生物應(yīng)入 選具有時(shí)間和地域代表性的毒菌株基因組。有條件應(yīng)構(gòu)建科研數(shù)據(jù)庫二級數(shù)據(jù)、以確保重要 的病原微生物不錯(cuò)報(bào)、不漏報(bào)。人源數(shù)據(jù)庫是為去除人源序列干擾而設(shè)計(jì)，包含染色體基因 組、線粒體基因組及轉(zhuǎn)錄組等序列信息。收錄的信息應(yīng)確保準(zhǔn)確、完整、有詳細(xì)注釋，不是 越多越好。推薦采用模擬數(shù)據(jù)對數(shù)據(jù)庫的有效性進(jìn)行驗(yàn)證（見本文第四章第三節(jié).分析性能確 認(rèn)）叫5 .具備數(shù)據(jù)庫更新能力：實(shí)驗(yàn)室應(yīng)持續(xù)跟蹤使用版本的數(shù)據(jù)庫。應(yīng)使用標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)集對更新 后的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行驗(yàn)證，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。6 .建立

49、背景微生物數(shù)據(jù)庫：mNGS可能含有多種微生物信息，其中不乏正常菌群、污染微生 物及背景微生物”。應(yīng)建立人體不同部位正常種群數(shù)據(jù)庠，并納入報(bào)告分析解讀流程。雖然 有些微生物存在于標(biāo)本中，但與疾病無關(guān)，應(yīng)在報(bào)告中去除或說明。此外，mNGS流程中所用 的各種試劑中也可能存在微生物個(gè)體或核酸，應(yīng)建立試劑背景微生物序列數(shù)據(jù)庠，在報(bào)告中 予以去除。7 .建立錯(cuò)誤數(shù)據(jù)修正機(jī)制：mNGS同樣存在測序錯(cuò)誤的情況，因此需去除原始下機(jī)數(shù)據(jù)中的 低質(zhì)量序列，包括測序接頭污染的序列、質(zhì)量值低的序列及短重復(fù)序列等。由于mNGS為批 量標(biāo)本平行上機(jī)測序，難以完全避免標(biāo)簽跳躍，應(yīng)通過技術(shù)手段與分析流程防止高拷貝微生 物序列污

50、染平行上機(jī)樣本。建議7實(shí)驗(yàn)室需通過已知標(biāo)本確立不同類型標(biāo)本個(gè)性化的測序數(shù)據(jù)量、驗(yàn)證序列質(zhì)量值、 確定判讀標(biāo)準(zhǔn)及不同類型微生物陽性閾值。在進(jìn)行序列比對時(shí)掌握如下原則：序列比對一致 性相同優(yōu)先考慮人源序列，該序列與數(shù)據(jù)庫中微生物種屬匹配度高、屬水平序列數(shù)大于種水 平、種序列數(shù)越接近屬水平則確認(rèn)該種的可能性越大、結(jié)果的可靠性與基因組覆蓋度成正 比、低于陽性閾值的病原微生物不可輕易放過，需結(jié)合臨床或復(fù)檢或重留標(biāo)本再測。建議8實(shí)驗(yàn)室應(yīng)使用國際公認(rèn)或經(jīng)驗(yàn)證或文獻(xiàn)推薦的公共數(shù)據(jù)庫，包括人源數(shù)據(jù)庫與微生 物數(shù)據(jù)庫。實(shí)驗(yàn)室可在臨床用庫的基礎(chǔ)上建立二級科研數(shù)據(jù)庫，以便應(yīng)對罕見或新發(fā)微生 物。建立生物信息學(xué)分析程序

51、并進(jìn)行性能確認(rèn)，確定測序數(shù)據(jù)量與不同類型微生物的判讀標(biāo) 準(zhǔn)。生物信息學(xué)分析程序滿足預(yù)期檢測性能參數(shù)，結(jié)果應(yīng)符合預(yù)期要求。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立監(jiān)測 生物信息學(xué)分析程序，記錄分析流程中各組分改變或版本更新（如軟件升級、數(shù)據(jù)庫更新、 腳本更改等），定義流程及數(shù)據(jù)庫的版本號，以保證報(bào)告的可溯源性。（六）檢驗(yàn)報(bào)告1 .基本要求:過濾后的序列才可用于微生物檢測報(bào)告，用于種屬檢測的短序列應(yīng)為特異序列， 特異序列作為最后報(bào)告的陽性閾值。正式報(bào)告單應(yīng)包括測序總序列數(shù)、內(nèi)標(biāo)檢測數(shù)據(jù)量、檢 測病原微生物列表、檢出病原特異序列數(shù)量、檢測病原范圍、測序數(shù)據(jù)質(zhì)量、檢測方法及檢 測技術(shù)說明。同時(shí)對相關(guān)專業(yè)術(shù)語進(jìn)行解釋說明，并注明檢

52、測方法的局限性、檢測的靈敏度 和特異性以及疑似背景微生物等。由于測序可檢出以往罕見的病原菌，需解釋物種來源、致 病性、流行病學(xué)特點(diǎn)及最新研究結(jié)論等8?？蒲衜NGS報(bào)告應(yīng)滿足用戶要求。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保留 所有檢出的微生物參數(shù)，包括但不限于比對序列數(shù)、相對豐度、基因組覆蓋度和測序深度等。2 .報(bào)告單的使用：從技術(shù)角度講，mNGS陽性或陰性結(jié)果不能作為臨床診療決策的唯一依據(jù)， 即使無菌部位標(biāo)本的mNGS結(jié)果也需結(jié)合臨床表現(xiàn)或其他檢查結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。mNGS檢出 或未檢出某物種的核酸片段，提示患者標(biāo)本中含有或不含有該物種核酸，但不能明確該物種 與感染的關(guān)系，即mNGS陽性不一定是病原微生物。另一方面，受取

53、樣及病程變化、測序策 略本身的靈敏度局限、實(shí)驗(yàn)室檢測能力和生物信息學(xué)分析水平的影響，mNGS檢測陰性結(jié)果 也需結(jié)合臨床進(jìn)行判定。從法律角度講，無認(rèn)證實(shí)驗(yàn)室的檢測結(jié)果不能成為診斷依據(jù)，僅做 研究所用。因此，目前國內(nèi)任何實(shí)驗(yàn)室出具的mNGS微生物檢測報(bào)告均不可直接用于臨床診 斷，也不應(yīng)成為醫(yī)療文書”二建議9用于臨床輔助診斷的mNGS報(bào)告應(yīng)包括測序總序列數(shù)、檢測病原微生物列表、檢出病 原特異序列數(shù)量、檢測病原范圍、覆蓋度、測序深度、檢測方法及檢測技術(shù)說明。mNGS結(jié) 果的本質(zhì)與PCR相似，代表臨床標(biāo)本中檢出或未檢出某微生物的核酸片段，不能明確該物 種與感染的關(guān)系，即使陰性結(jié)果也需結(jié)合臨床表現(xiàn)及其他檢

54、查結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。四、性能確認(rèn)優(yōu)先選擇NMPA批準(zhǔn)的儀器與試劑，如果改變獲批試劑制定的預(yù)期用途、試劑組分、操作流 程等，則按照LDT試劑要求進(jìn)行管理，在開展臨床服務(wù)之前所有與mNGS有關(guān)的儀器、試 劑、檢測流程、數(shù)據(jù)庫及分析軟件均需進(jìn)行性能確認(rèn)。（-）測序平臺(tái)的性能確認(rèn)依據(jù)檢測項(xiàng)目及臨床預(yù)期用途，綜合考慮測序讀長和通量、測序準(zhǔn)確率、運(yùn)行時(shí)間、測序成 本等選擇測序平臺(tái)。安裝時(shí)，由廠方工程師按照說明書所注明的儀器性能指標(biāo)逐項(xiàng)驗(yàn)證，達(dá) 到廠方聲稱的指標(biāo)并滿足臨床預(yù)期用途為合格。（二）生物信息分析平臺(tái)的性能確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室可以選擇商業(yè)化的自動(dòng)分析系統(tǒng)，也可需根據(jù)檢測項(xiàng)目和預(yù)期用途選擇合適的算法和 軟件，搭

55、建本實(shí)驗(yàn)室的生物信息學(xué)分析流程，并進(jìn)行必要的性能確認(rèn)，以保證對病原微生物 檢測的準(zhǔn)確性。性能確認(rèn)包括但不限于最低測序數(shù)據(jù)量及堿基識(shí)別質(zhì)量值等，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù) 國際上本領(lǐng)域發(fā)展不斷優(yōu)化分析平臺(tái)。臨床標(biāo)本的測序數(shù)據(jù)是進(jìn)行性能確認(rèn)時(shí)最重要的數(shù) 據(jù)，即臨床標(biāo)本mNGS全流程檢測后得到的測序數(shù)據(jù)。計(jì)算機(jī)模擬的測序數(shù)據(jù)可通過數(shù)據(jù)模 擬軟件ART等軟件生成”。但是計(jì)算機(jī)模擬和參考物質(zhì)的測序數(shù)據(jù)只能作為補(bǔ)充數(shù)據(jù)，不 能完全替代臨床標(biāo)本測序數(shù)據(jù)。（三）分析性能確認(rèn)分析性能確認(rèn)包括從臨床樣本前處理到生物信息學(xué)分析的全過程，觀察指標(biāo)至少應(yīng)包含精密 度、準(zhǔn)確度、可報(bào)告范圍、分析敏感性、分析特異性等。1 .精密度：指在規(guī)

56、定條件下所獲得的多次獨(dú)立檢測結(jié)果的一致度，評價(jià)檢測方法的重復(fù)性。 包括對同一批樣本在同一條件下（相同的環(huán)境、操作人員及儀器）至少進(jìn)行3次以上檢測, 評價(jià)重復(fù)精密度，以及不同日間、不同人員、不同儀器（相同型號）至少進(jìn)行3次以上檢測， 評價(jià)再現(xiàn)性精密度。可選擇高、低2個(gè)不同梯度的參考品進(jìn)行驗(yàn)證，精密度應(yīng)90國，。2 .準(zhǔn)確度：是指與真陽樣本、真陰樣本結(jié)果或金標(biāo)準(zhǔn)方法檢測結(jié)果的符合率。對準(zhǔn)確度的評 價(jià)可通過兩部分進(jìn)行。通過臨床樣本驗(yàn)證：選另一 NMPA已獲批或被普遍接受的金標(biāo)準(zhǔn)方法與mNGS同時(shí)檢測臨床 樣本，比較mNGS與金標(biāo)準(zhǔn)方法之間的差異，不一致的結(jié)果再用第3種方法進(jìn)一步確認(rèn)，通 過陽性符合率

57、和陰性符合率評價(jià)定性測定的準(zhǔn)確度唧通過參考品驗(yàn)證：mNGS目前尚無國際或國家參考品，實(shí)驗(yàn)室可自制企業(yè)參考品進(jìn)行驗(yàn)證。 如在明確陰性或健康人標(biāo)本中摻入不同類型病原體的標(biāo)準(zhǔn)參考品（如病毒、細(xì)菌、真菌、寄 生蟲等）制備模擬陽性樣本，建議使用810種病原微生物（包括RNA病毒）驗(yàn)證檢測的準(zhǔn) 確度。樣本數(shù)量不少于20例，濃度范圍應(yīng)覆蓋高、中、低，一致率應(yīng)大于90% ” ”。3 .最低檢測限（limit of detection, LoD）：用于描述測序方法的分析敏感性，它是指能 夠通過測序獲得準(zhǔn)確目標(biāo)微生物的最低濃度，一般要求可信度295$?？筛鶕?jù)預(yù)期用途、標(biāo) 本類型等，選擇含有代表物種的混合參考品，1

58、0倍梯度稀釋進(jìn)行檢測，每個(gè)梯度至少3個(gè) 重復(fù)，計(jì)算出LoD值，并在該LoD濃度進(jìn)行20次以上重復(fù)，確保95舟的檢出。實(shí)驗(yàn)室需要 建立不同樣本類型、不同代表物種的LoD："。4 .分析特異性：分析特異性主要評價(jià)樣本中潛在干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響。mNGS最大的 干擾物是人源核酸，高濃度的宿主背景可嚴(yán)重降低檢測靈敏度。痰標(biāo)本需增加黏蛋白對結(jié)果 干擾程度的評估。血液標(biāo)本需增加血紅蛋白干擾程度評估。應(yīng)使用接近臨床真值的干擾物濃 度進(jìn)行驗(yàn)證，建議包含每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度?？蓪⒉煌康母蓴_物質(zhì)分別添加到 陽性樣本中，以評估干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果的干擾程度。mNGS分析特異性還需考慮近源物種

59、的交叉反應(yīng)，即鑒別不同亞種、亞型的能力.5 .可報(bào)告范闈：mNGS的可報(bào)告范圍理論上應(yīng)為參考數(shù)據(jù)庫中包含的所有微生物，在對參考 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行更新升級時(shí)，可報(bào)告范闈也相應(yīng)發(fā)生變化。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)在數(shù)據(jù)庫升級時(shí)對可報(bào)告范 闈和上述各項(xiàng)性能指標(biāo)重新進(jìn)行確認(rèn)。在準(zhǔn)確度驗(yàn)證中，應(yīng)確認(rèn)可報(bào)告范圍，實(shí)驗(yàn)室在日常 檢測中，應(yīng)對可報(bào)告范圍持續(xù)關(guān)注和確認(rèn)&。（四）性能確認(rèn)的樣本要求1 .代表性：涵蓋不同類型微生物的各類感染標(biāo)本是理想的性能驗(yàn)證樣本。未經(jīng)性能驗(yàn)證的標(biāo) 本類型應(yīng)被視為無法準(zhǔn)確得到結(jié)果的樣本。如果缺少具有代表性的病原微生物，可使用模擬 樣本代替。不同類型微生物應(yīng)特別強(qiáng)調(diào)結(jié)核分枝桿菌、絲狀真菌、RNA病毒及寄生蟲。不同 類型的臨床標(biāo)本特別強(qiáng)調(diào)血液、CSF、BALF、組織標(biāo)本和關(guān)節(jié)液及胸腔枳液。2 .樣本量