WB注意事項及常見問題

1、WB 注意事項及常見問題注意事項1、 樣本收集1. 組織樣本原則上要求客戶或我們的技術(shù)員把組織分切剪碎至研磨管 （根據(jù)實驗的需要告知他們?nèi)《嗌俳M織） ，并加入適量裂解液和研磨珠，然后放置于 -80保存。具體詳情參照 “組織樣本收集注意事項 .doc ”；2. 細(xì)胞樣品原則上要求客戶或我們的技術(shù)員不要用胰酶把細(xì)胞消化下來， 特別是分選對象是膜蛋白時，具體詳情參照 “細(xì)胞樣品收集注意事項.doc” ；2、 總蛋白提取1. 組織樣品具體詳情參照 “組織樣本收集注意事項 .doc ”； 記得加入蛋白酶抑制劑，如果分選對象是磷酸化蛋白時，記得加入磷酸化酶抑制劑；2. 細(xì)胞樣品具體詳情參照 “細(xì)胞樣品收集

2、注意事項.doc” ；記得加入蛋白酶抑制劑，如果分選對象是磷酸化蛋白時，記得加入磷酸化酶抑制劑；3、 蛋白樣本保存裂解細(xì)胞或組織提取總蛋白時，細(xì)胞碎片沉淀一般-20 保存以防萬一，提取好的蛋白樣品分裝 2 份，一份加入上樣緩沖液變性后-20保存，一份直接-20保存；4、 蛋白變性提取好的總蛋白取一部分（不是全部）加入上樣緩沖液進行加熱變性（100，5min ） ，變性好的蛋白應(yīng)該-20保存，凍融后不再需要加熱變性；5、 SDS-PAGE1. 濃縮膠的膠濃度一般為5%，用于壓沉樣品；2. 分離膠的膠濃度取決于分析對象的分子量大小， 詳情見 Western Blotting 全攻略.pdf第4頁；

3、3. 分離膠和濃縮膠的高度比為 8:3；4. 電泳結(jié)束后，應(yīng)及時用清洗干凈玻璃板，清洗時應(yīng)使用海綿擦布，切勿使用刷子，以免刮花玻璃板；5. 電泳結(jié)束后，應(yīng)及時沖洗電泳槽，以免鹽離子沉積，導(dǎo)致電泳絲腐蝕；6. 清洗電泳芯時，一定要注意別弄段電泳絲；6、 轉(zhuǎn)膜1. 注意海綿墊，濾紙（轉(zhuǎn)膜專用濾紙） ，轉(zhuǎn)印膜，膠的疊放位置，以保證正確的轉(zhuǎn)印方向；2. 注意海綿墊， 濾紙 （轉(zhuǎn)膜專用濾紙） ， 轉(zhuǎn)印膜， 膠的相對大小， 以免造成短路；3. 轉(zhuǎn)印結(jié)束后，應(yīng)及時取出轉(zhuǎn)印膜，并立即用 TBST 漂洗 1-2 遍，并立即加入封閉液，這樣可以避免膜上的雜質(zhì)殘留或膜變干導(dǎo)致背景高的問題；4. 轉(zhuǎn)印結(jié)束后，應(yīng)及時沖

4、洗轉(zhuǎn)印槽和轉(zhuǎn)印芯，以免鹽離子沉積，導(dǎo)致電泳絲腐蝕；5. 轉(zhuǎn)印結(jié)束后，應(yīng)及時用水泡洗海綿墊和濾紙，以免鹽離子沉積，導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜時短路，并放在籃子上晾干，如果海綿墊和濾紙不及時晾干，容易導(dǎo)致海綿墊和濾紙內(nèi)部的結(jié)構(gòu)破壞；7、 封閉1. 進行封閉時，應(yīng)加入足量的封閉液（以完全覆蓋膜為底限） ，并保證整個封閉過程中，膜與封閉液充分接觸，避免長時間離開封閉液，特別進行4靜止封閉過夜時， 一定要加入足量的封閉液和保證平坦放置；上述注意事項主要為了避免膜變干，導(dǎo)致背景升高；8、 一抗雜交1. 一抗的稀釋比例：第一次使用時參考具體抗體說明書建議的稀釋比例，并根據(jù)實際的實驗結(jié)果進行調(diào)整；2. 雜交條件：如果是室溫孵育

5、，至少保證孵育1-2 小時，并放置脫色搖床上進行搖晃，如果是4孵育，應(yīng)孵育過夜，可靜止亦可放置脫色搖床上進行搖晃；3. 應(yīng)使用專用的一抗稀釋液進行稀釋，使用后進行回收并4保存，如果回收的稀釋抗體用沉淀或長菌，應(yīng)丟棄；9、 一抗雜交后洗膜1. 一般使用標(biāo)準(zhǔn)的 TBST 緩沖液， 如果判斷因為是一抗的原因?qū)е碌谋尘斑^高，可以把 NaCl 的濃度提高到 500 nM （標(biāo)準(zhǔn)的為150nM）;2. 一般洗滌 3 次，每次 10min ，如果判斷因為是一抗的原因?qū)е碌谋尘斑^高，可以把洗滌次數(shù)提高到 4-6 次；十、 二抗雜交1. 二抗的稀釋比例：第一次使用時參考具體抗體說明書建議的稀釋比例，并根據(jù)實際的

6、實驗結(jié)果進行調(diào)整；2. 雜交條件：一般室溫孵育，孵育 1 小時即可（時間延長會產(chǎn)生非特異雜交，從而導(dǎo)致背景過高） ，并放置脫色搖床上進行搖晃（一定要避免膜變干，否則背景其高） ；3. 應(yīng)使用封閉液進行稀釋，使用后進行不回收；十一、 二抗雜交后洗膜1. 一般使用標(biāo)準(zhǔn)的 TBST 緩沖液， 如果判斷因為是一抗的原因?qū)е碌谋尘斑^高，可以把 NaCl 的濃度提高到 500 nM （標(biāo)準(zhǔn)的為150nM）;2. 一般洗滌3次，每次10min,如果判斷因為是一抗的原因?qū)е碌谋尘斑^高，可以把洗滌次數(shù)提高到 4-6 次；十二、 拍照1. 注意選擇曝光時間，同時兼顧工作效率，因選擇連續(xù)拍照模式 ，這樣總有一個何時

7、曝光時間；十三、 報告單整理1. 原始圖片；2. 對比度和亮度調(diào)整的圖片；3. 圖片說明：上樣順序；4. 灰度值：原始值， 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化（同一個樣品的目標(biāo)蛋白的灰度值除以內(nèi)參蛋白的灰度值） ， 相對表達量 （實驗樣品的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化比值除以參照樣品 （問客戶）的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化比值） ，參照樣品的相對表達量一定為 1；5. 實驗方法：準(zhǔn)確的一抗，二抗，稀釋比例；常見問題1、 沒信號1. 膜一片空白， 沒有任何條帶， 陽性對照樣品也無條帶： 實驗失?。靠贵w失效？；重新進行實驗，重新稀釋抗體；2. 膜一片空白，沒有任何條帶，陽性對照樣品有條帶：實驗樣品降解？實驗樣品無該蛋白的表達？轉(zhuǎn)膜效率過低？；重新進行實驗

8、，復(fù)核查找上述原因，以尋找對策；2、 背景過高1. 目的條帶以外的區(qū)域有信號，如果是片狀，甚至整塊膜，一般是封閉不好，膜變干，一抗非特異雜交或二抗的非特異雜交導(dǎo)致；如果是條紋狀，一般是由于膜上有壓痕導(dǎo)致，如果是點狀，一般是膜上有雜質(zhì)，或泡膜時膜沒有充分浸泡；3、 雜帶1. 目的帶以外的信號條帶為雜帶，一般由于一抗的特異性不好所導(dǎo)致，如果目的帶比雜帶信號強，可通過減低一抗的稀釋比例，并縮短雜交時間解決；如果目的帶比雜帶信號弱， 在不減低一抗的稀釋比例的前提下， 縮短雜交時間；并提高 TBST 緩沖液的 NaCl 的濃度提高到 500 nM ；2. 雜帶如果與目的帶的位置相距較遠，可以不優(yōu)化實驗，直接裁剪即可，雜帶如果與目的帶的位置相距較進，應(yīng)調(diào)整膠濃度，并延長電泳時間，已經(jīng)采取上述解決方法；4、 目的帶弱1. 一抗效價