發(fā)酵工程實驗報告之果汁澄清

1、發(fā)酵工程學(xué)實驗組號： 7-8節(jié)第七小組 學(xué)號： 124120434 學(xué)院： 生命科學(xué)學(xué)院 專業(yè)、班級： 12生物技術(shù) 實驗課程名稱 發(fā)酵工程實驗 指導(dǎo)教師及職稱 唐湘華 開課學(xué)期 2014 至 2015 學(xué)年 下 學(xué)期 云南師范大學(xué)教務(wù)處編印實驗名稱：（一）特定產(chǎn)物工業(yè)生產(chǎn)菌種發(fā)酵及應(yīng)用性質(zhì)研究實驗時間第十三周實驗室睿智3-121小組合組是小組成員高勝全 李朝和 劉云謠 羅光洪 張志豪一、 實驗?zāi)康模?、掌握菌種選育、菌種發(fā)酵條件的優(yōu)化和微生物酶制劑酶活測定的基本方法；2、了解酶學(xué)性質(zhì)的研究.二、 實驗原理：1、理論依據(jù)（1）、果膠酶概況（2）、果膠酶的酶活測定方法（3）、微生物發(fā)酵生產(chǎn)特定產(chǎn)

2、物受培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件和附加條件等的制約（4）、酶催化反應(yīng)的進行受多種因素的影響2、果膠酶概況果膠質(zhì)：是高等植物細胞壁內(nèi)及細胞壁間的結(jié)構(gòu)性多糖，是一類高分子碳水化合物，它的存在往往給果蔬加工等工藝帶來許多麻煩和損失。果膠酶：是指能分解果膠質(zhì)的多種酶的總稱，廣泛存在于高等植物和微生物中。產(chǎn)生果膠酶的微生物：細菌、放線菌、酵母和霉菌，但目前商品果膠酶多數(shù)來自霉菌。果膠酶的應(yīng)用：主要是用于果膠的分解，在水果加工、葡萄酒生產(chǎn)、麻類脫膠和飼料等方面有著廣泛的應(yīng)用。3、 果膠酶的酶活測定方法 粘度降低法：利用粘度計測量在一定溫度、酶濃度和一定反應(yīng)時間內(nèi)，標準果膠溶液的粘度降低值。 脫膠作用時間法：以脫膠

3、作用的時間來測定果膠酶的酶活力。 次亞碘酸法：用滴定法定量測定半乳糖醛酸的生成量，以表示果膠酶的活力。 還原糖法（DNS法）：測定在一定溫度、酶濃度和一定反應(yīng)時間內(nèi)，水解果膠產(chǎn)生的還原糖的量。 DNS法：根據(jù)果膠酶水解果膠生成半乳糖醛酸，后者是一種還原糖，與3，5 -二硝基水楊酸共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定的范圍內(nèi)，還原糖的量和反應(yīng)液的顏色呈比例關(guān)系，可利用比色法在540nm進行測定。4、 微生物發(fā)酵生產(chǎn)產(chǎn)品受以下條件制約：培養(yǎng)基成分：C源、N源、無機鹽、水和生長因子培養(yǎng)條件：溫度、pH、溶解氧等附加條件：誘導(dǎo)物、表面活性劑等5、酶催化反應(yīng)的進行受多種因素的影響 底物濃度 酶濃度

4、溫度 pH 激活劑 抑制劑三、 實驗材料（一）試劑 1、酶活測定用試劑和DNS 2、新鮮果汁（二）儀器燒杯、三角瓶、試管、移液管、洗耳球、量筒、容量瓶、試劑瓶、研缽等；天平、滅菌鍋、超凈工作臺、培養(yǎng)箱、電爐、恒溫水浴鍋、記時器（精確到秒）、分光光度計等。（三）培養(yǎng)基1、菌種篩選使用2、黑曲霉Asp-2固體發(fā)酵用1、菌種篩選使用培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基: 果膠 1% ，磷酸氫二鈉0.5%，蛋白胨1%，pH4.5，瓊脂 2.0%。分離培養(yǎng)基果膠 0.5%，磷酸氫二鈉0.5%，瓊脂2.0%，pH4.5（3）發(fā)酵培養(yǎng)基果膠 1% ，磷酸氫二鈉0.5%，蛋白胨1%，pH4.5。2、 黑曲霉Asp-2固體發(fā)酵培

5、養(yǎng)基菌種斜面培養(yǎng)基（查氏培養(yǎng)基） NaNO3 0.2% K2HPO4 0.1% KCl 0.05% MgSO4 0.05%FeSO4 0.001% 蔗糖 3%瓊脂 2.5% 自然pH種子培養(yǎng)基 麩皮 3.0% ，橘子粉 2.0% ，硫酸銨0.5%,葡萄糖 1% ，KH2PO4 0.1% pH4.5固體發(fā)酵培養(yǎng)基：5瓶 / 組麩皮 10g，橘子粉 2.5g，(NH4)SO4 0.1g（0.8%干料計）葡萄糖 0.125g（1%干料計），水 15ml 要求：按組統(tǒng)一配制后分裝三角瓶先將(NH4)SO4 、葡萄糖用水溶解，再加其它。四、 實驗方法、步驟及注意事項：（1） 固體發(fā)酵果膠酶1、 菌種準備

6、菌種活化：試管保存菌種斜面活化30培養(yǎng)約60h液體培養(yǎng)：將菌種接種入裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶內(nèi)，30，200rpm，培養(yǎng)約40h，備用。2、 氮源的選擇和選擇的氮源添加量對產(chǎn)酶的影響(第一組）選擇硫酸銨、蛋白胨、牛肉膏按照1%濃度替換發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白胨，接種5%液體種子，培養(yǎng)48小時，測定酶活。在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5% （按干料計）濃度的已選擇的氮源，保持培養(yǎng)基的其它成分不變，在相同接種量（約5%，即1.5ml）相同培養(yǎng)條件下（30，60h）發(fā)酵，測定酶活。3、 碳源的選擇和選擇的碳源添加量對產(chǎn)酶的影響 (第二組)選擇果膠、葡萄糖

7、、橘子粉按照1%濃度替換發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白胨，接種5%液體種子，培養(yǎng)48小時，測定酶活。在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0、0.5%、1.0、2%、3.% 的選擇的碳源，保持培養(yǎng)基的其它成分不變，在相同條件下接種液體種子（約5%，即1.5ml），相同培養(yǎng)條件下，30，發(fā)酵60h ，測定酶活。4、 培養(yǎng)基含水量對產(chǎn)酶的影響(第三組）在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入蒸餾水，使培養(yǎng)基中的含水量分別約為50%、55%、60%、65%和70%；保持培養(yǎng)基的其它成分不變，在相同接種量（5% ，即1.5ml ）相同培養(yǎng)條件下（30，4860h）發(fā)酵，測定酶活。5、 接種量對產(chǎn)酶的影響 (第三組）分別以4%、5%、6%、7%和8

8、%的接種量接種果膠酶產(chǎn)生菌于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在相同的培養(yǎng)條件下（30，4860h）發(fā)酵，測定酶活。注意：由于接種的是液體菌種，所以在配制培養(yǎng)基時要將接種時多出的水分去掉。6、 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響 （第四組）在相同的培養(yǎng)基、相同的接種量（5%，即1.5ml ）和相同培養(yǎng)條件下（30）分別發(fā)酵36、48、60、72和84h ，測定酶活。注意：精確計算時間，準時取出發(fā)酵產(chǎn)物。7、 發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響 （第五組）保持培養(yǎng)基成分和接種量（5%，即1.5ml ）不變，分別在室溫、30、37和45的溫度條件下發(fā)酵4860h ，測定酶活。先把培養(yǎng)箱調(diào)到相應(yīng)的溫度！8、果膠酶酶活的測定（1） 待測酶液的制備烘

9、干：把發(fā)酵產(chǎn)物倒于平皿中，45烘干過夜；制備酶粉：將烘干的發(fā)酵產(chǎn)物用研缽研磨成粉狀（盡量磨細），裝于塑料袋中備用；制備酶液：稱取0.1g酶粉，充分溶解于10mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（稀釋100倍），紗布（4層）過濾去除雜質(zhì)；如果測定所得OD值不在有效值（0.2-0.6）范圍內(nèi)，則相應(yīng)地降低或增大稀釋倍數(shù)后再進行測定。（2）果膠酶酶活測定方法OD =（A+B）/ 2酶活定義：在pH3.0、 37條件下，每分鐘內(nèi)從底物溶液中分解釋放1mol半乳糖醛酸所需要的酶量為一個酶活單位U/g。酶活計算公式 酶活（U/g）=A×5×K×N×1000/（T×W

10、×M） A: 樣品的OD值 （平均值） K: 標準曲線的斜率 N: 稀釋倍數(shù) 5： 0.2毫升反應(yīng)液轉(zhuǎn)換為1毫升體積 T: 反應(yīng)時間（min） 1000：轉(zhuǎn)換因子1mmol=1000mol W: 半乳糖醛酸的分子量（212.16g/mol） M: 稱取酶粉克數(shù)(g)繪制標準曲線的方法先配制一系列濃度不同的標準溶液，用選定的顯色劑進行顯色，在一定波長下分別測定它們的吸光度A。以A為橫坐標，濃度c為縱坐標，則得到一條擬合度較好的直線，稱為標準曲線。然后使用用完全相同的方法和步驟測定被測溶液的吸光度，便可從標準曲線上找出對應(yīng)的被測溶液濃度或含量。半乳糖醛酸標準曲線的制作 精確稱取0.100

11、g半乳糖醛酸，用緩沖溶液定容至100ml，制得濃度為1mg/ml的半乳糖醛酸的標準溶液。標準曲線如下圖表所示（3）注意事項試管上編號：貼上用圓珠筆寫上編號的膠布，以防止保溫或沸水加熱時脫落；移液槍的使用：向試管內(nèi)加入待測酶液或DNS時，槍頭不要觸碰管壁，也不要伸入液面下，連續(xù)吸取同一種溶液時可以不用更換槍頭！精確記時：每一管加入酶液的時間要做記錄，每管之間間隔的時間要合理；避免試管進水：煮沸和用流水沖洗時；實驗結(jié)果的記錄與分析9、儀器的使用恒溫水浴鍋分光光度計烘箱移液槍UV2000型分光光度計的使用注意提前半小時接通電源，打開機器開關(guān)使儀器通電，自檢；將對照液及測定液分別裝入比色杯3/4體積并

12、用鏡頭紙擦干外壁，放入樣品室；調(diào)節(jié)測定所用波長；讀數(shù)完畢，打開儀器蓋板，關(guān)閉開關(guān)，將比色杯沖洗干凈、浸泡于30酒精中。注意事項1、接種接種方式是液體固體，用滅菌的移液管或10ml量筒接種或大槍頭；接種后振蕩接種瓶，使菌種充分與固體培養(yǎng)基混合。2、水浴鍋的使用：水量（蒸餾水）要超過試管中的液面3、分光光度計使用時注意：測定OD在540nm、以對照為參比、測定吸光值4、及時清洗用過的槍頭實驗準備內(nèi)容（1）黑曲霉Asp-2固體發(fā)酵用的培養(yǎng)基固體發(fā)酵培養(yǎng)基：5瓶/組注意配方等的不同，做好標記?。?） 滅菌培養(yǎng)基其它：10ml量筒（紗布和報紙包口）、移液管（塞棉花）等時間：滅菌45min注意事項1、酶粉

13、的選擇：同一大組采用同一酶粉進行應(yīng)用性質(zhì)的實驗！2、水浴鍋的使用水浴鍋的水量（蒸餾水）要超過試管中的液面各大組“處理時間”這項實驗共同在1個水浴鍋中進行3、分光光度計使用時注意OD660nm以蒸餾水為參比測定透光率五、 實驗報告（一）、實驗結(jié)果本次實驗在菌種分離時，已經(jīng)分離到能產(chǎn)生果膠酶的菌株，但是在后期的培養(yǎng)過程中，發(fā)生一點點的錯誤，導(dǎo)致培養(yǎng)出來的菌種沒有酶活，也就是實驗失敗。（二）結(jié)果分析從培養(yǎng)的初期來看，實驗?zāi)艿玫骄N，說明實驗有成功的契機，但是在經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)之后，菌株沒有酶活，也就是在發(fā)酵培養(yǎng)時出現(xiàn)意外，本次試驗提醒我們做實驗和做事要仔細認真，步步為營。實驗名稱：（二）應(yīng)用發(fā)酵制備的酶

14、液進行果汁澄清的應(yīng)用實驗實驗時間第十四周實驗室睿智3-121小組合組是小組成員高勝全 李朝和 劉云謠 羅光洪 張志豪六、 實驗?zāi)康模毫私庥绊懝z酶對果汁澄清效果的各種因素七、 實驗原理：1、果膠酶的應(yīng)用：主要是用于果膠的分解，在水果加工、葡萄酒生產(chǎn)、麻類脫膠和飼料等方面有著廣泛的應(yīng)用。 2、脫膠作用時間法：以脫膠作用的時間來測定果膠酶的酶活力。3、次亞碘酸法：用滴定法定量測定半乳糖醛酸的生成量，以表示果膠酶的活力。4、還原糖法（DNS法）：測定在一定溫度、酶濃度和一定反應(yīng)時間內(nèi)，水解果膠產(chǎn)生的還原糖的量。八、 實驗材料1、儀器設(shè)備：燒杯、三角瓶、試管、移液管、洗耳球、量筒、容量瓶、試劑瓶、研缽

15、等；天平、滅菌鍋、超凈工作臺、培養(yǎng)箱、電爐、恒溫水浴鍋、記時器（精確到秒）、分光光度計等。2、材料：新鮮果汁、NAOH溶液 、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖、DNS試劑等等。九、 實驗方法、步驟及注意事項：（一）待測酶液的制備1、制備酶液：稱取1g酶粉，充分溶解于10mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（稀釋10倍），高速冷凍離心（10000轉(zhuǎn)、5min）去除雜質(zhì)；2、根據(jù)發(fā)酵條件優(yōu)化實驗中測定所得OD值大小，選擇酶活最高的酶粉制備酶液。（二）果汁的制備1、水果清洗破碎榨汁2、稀釋：用pH3.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液稀釋至10倍（三）果膠酶的應(yīng)用性實驗果汁澄清實驗 1、果汁澄清的基本方法步驟樣品A管樣品 B管空

16、白管步驟1吸取稀釋果汁10毫升吸取稀釋果汁10毫升吸取稀釋果汁10毫升步驟245保溫5min45保溫5min45保溫5min步驟3稀釋酶液1mL稀釋酶液1mL不加步驟445精確保溫30min45精確保溫30min45精確保溫30min步驟5離心（5000轉(zhuǎn)，5分鐘）離心（5000轉(zhuǎn)，5分鐘）離心（5000轉(zhuǎn)，5分鐘）步驟6以蒸餾水為參比，660nm測定透光率以蒸餾水為參比，660nm測定透光率以蒸餾水為參比，660nm測定透光率T（透光率） =（A+B）/ 2 TTT0空白為T02、果膠酶添加量對澄清效果的影響（1，2組）（1）在反應(yīng)體系中分別加入0.2、0.5 、1.0、1.5和2.0ml的

17、果膠酶液（2）在相同的反應(yīng)條件（pH3.0，45）下處理30min，以蒸餾水為參比分別測定透光率。3、果汁pH對澄清效果的影響（3，4組）（1）用0.25mol/L H2SO4 和3mol/L NaOH 分別調(diào)節(jié)果汁的pH至1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0；（2）在反應(yīng)體系中加入1.0ml的果膠酶液，相同的反應(yīng)條件（45）下處理30min，以蒸餾水為參比分別測定透光率。4、果汁溫度對澄清效果的影響（5，6組）（1）保持反應(yīng)體系的其它條件（1.0ml的果膠酶液、pH3.0，30min）不變，分別在室溫（溫度計測定）、37、45、 50、55條件下進行反應(yīng)30Min;

18、（2）以蒸餾水為參比分別測定透光率。（四）注意事項1、水浴鍋的使用（1）水浴鍋的水量（蒸餾水）要超過試管中的液面（2）各大組“處理時間”這項實驗共同在1個水浴鍋中進行2、分光光度計使用時注意（1）OD660nm（2）以蒸餾水為參比（3）測定透光率十、 實驗結(jié)果及分析1、對不同的實驗組添加不同的果膠酶的量后得到的結(jié)果如下:（表一）果膠酶添加量對果汁澄清的影響酶液量（ml）OD660平均值(T)空白(TO)TTT0A管B管0.2 45.90%74.00%59.95%11.60%48.35%0.5 39.10%42.70%40.90%12.10%28.80%1.0 54.30%37.40%45.85

19、%11.40%34.45%1.5 21.80%9.30%15.55%11.90%3.65%2.0 47.30%48.90%48.10%12.00%36.10%根據(jù)上表格做出的折線圖（圖一）如下：【透光率之差（TTT0）】分析：根據(jù)表格數(shù)據(jù)及折線圖中的信息可以看出T隨著酶量的增加逐漸下降，到酶量為1.5ML時突然上升。但是根據(jù)理論分析隨著酶量的增加T的值應(yīng)該是逐漸上升，直到某一濃度之后不再增加。出現(xiàn)上圖的結(jié)果說明實驗沒有成功，可能的原因有：（1）可能是測OD值時把管號弄混了；（2）可能是加酶時出現(xiàn)漏加現(xiàn)象；（3）從表一中A、B管數(shù)據(jù)的分布來看，該實驗數(shù)據(jù)的準確性太低，波動大，可信度低。由于種種原

20、因，本次實驗未能找出最適加酶量。2、不同PH的果汁對果汁澄清效果有影響的實驗結(jié)果如下（表二）果汁PH對澄清效果的影響PH管號OD660平均值(T)空白管(TO)TTT01.5 A19.60%19.50%20.60%1.10%B19.10%2.0 A12.10%23.50%20.60%2.90%B35.00%2.5 A61.80%64.00%20.60%43.40%B66.10%3.0 A74.60%65.50%20.60%44.90%B66.30%3.5 A80.40%80.50%20.60%59.90%B80.80%4.0 A91.90%93.50%20.60%72.90%B95.00%4.5 A64.40%63.00%20.60%42.40%B61.80%5.0 A36.40%28.00%20.60%7.40%B20.30%根據(jù)表二做出折線圖（圖二）如下：【透光率之差（TTT0）】分析：從表二中的數(shù)據(jù)來看，A、B兩管的數(shù)值差距不大，可信度較高，從圖二可以看出隨著PH的升高T不斷的升高，當達到一定的高度之后，T又逐漸下降，在PH=4時T的值達到最高為72.90%。也就是說當果汁的PH=4時果汁澄清的效果最好，即