美國(guó)專利全文翻譯

1、采血裝置改進(jìn)核酸調(diào)控領(lǐng)域的發(fā)明摘要方法和裝置用于穩(wěn)定的生物樣品分析，包括通過(guò)樣品采集裝置從受試者獲得生物樣品的步驟;這個(gè)生物樣品包括從受試者獲得的至少一個(gè)循環(huán)游離第一核酸。該方法可包括當(dāng)樣品收集裝置具有保護(hù)組合物包括防腐劑，一個(gè)可選擇的抗凝血?jiǎng)┖外鐒?，以形成包括所述保護(hù)劑組合物和樣品的混合物接觸生物樣品的步驟。1. 本文的教導(dǎo)涉及的裝置和方法用于穩(wěn)定和保持游離的DNA ，而不會(huì)損壞DNA完整性的改進(jìn)保護(hù)和調(diào)控核酸物質(zhì)在收集，儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中。背景介紹2. 游離的DNA （ cfDNA ）天然存在于血并已在很大程度上歸因于凋亡和壞死的過(guò)程。而血液中的cfDNA在1948年被發(fā)現(xiàn)。其在臨床醫(yī)學(xué)

2、方面的影響并未實(shí)現(xiàn)超過(guò)二十年。具體地的說(shuō)，cfDNA被證明存在于系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的血清中，cfDNA水平在癌癥患者的血清中被提高。這些調(diào)查結(jié)果激發(fā)cfDNA在疾病診斷的潛在的興趣。調(diào)查進(jìn)行了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，大腸癌，乳腺癌，胰腺癌，頭頸部癌癥患者都顯示cfDNA濃度明顯上升。該cfDNA提取自癌癥患者的血漿或血清，呈現(xiàn)出典型特征的腫瘤DNA ，并且可以充當(dāng)非侵入性生物標(biāo)記用于癌癥檢測(cè)和管理。3. 有日益增長(zhǎng)的興趣在游離胎兒核酸的產(chǎn)前診斷的潛在用途。Lancet是第一個(gè)展示出懷孕的供體血液樣本具有較高的產(chǎn)婦cfDNA濃度也證明了胎兒cfDNA在孕婦血漿中的存在。臨床應(yīng)用涉及了胎兒cfDNA分析，包

3、括了性別判定， 單基因紊亂，妊娠相關(guān)疾病和非整倍體檢測(cè)。4. 從那時(shí)候開始，研究累積體內(nèi)確定cfDNA是多種致病條件的預(yù)測(cè)和診斷指示燈; 如癌癥相關(guān)遺傳和表觀遺傳改變，胎兒DNA突變和產(chǎn)前診斷，和病毒感染-通過(guò)檢測(cè)人體血液中的病毒DNA。因此。精確檢測(cè)cfDNA人類生物標(biāo)本正在成為主流，非侵入性的途徑允許評(píng)估，審查和疾病分類和監(jiān)測(cè)臨床分析。5. cfDNA歸因于DNA片段的可檢測(cè)的多種體液。血漿或血清最常用于此目的，但是，存在的cfDNA在尿液，唾液，糞便，滑液，腦脊髓液和腹腔液中被檢測(cè)出來(lái)。健康人的cfDNA的平均循環(huán)濃度是30ng/ml，cfDNA通常來(lái)說(shuō)是雙鏈的，大約為180-210個(gè)堿

4、基大小。CfDNA的檢測(cè)具有顯著挑戰(zhàn)是因?yàn)橐幌碌脑颍?.在產(chǎn)前檢測(cè)的過(guò)程中，主要的產(chǎn)婦細(xì)胞材料可干擾胎兒cfDNA檢測(cè)，2.樣品在抽取后加工可以導(dǎo)致細(xì)胞裂解，導(dǎo)致異常增加循環(huán)cfDNA的量。3. 相關(guān)的低水平的cfDNA強(qiáng)調(diào)潛在的風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)生假陰性的結(jié)果由于缺少目標(biāo)cfDNA序列由于樣品不穩(wěn)定或不恰當(dāng)?shù)募庸?。為此，盡量減少污染的細(xì)胞DNA和維護(hù)cfDNA已包含的各種預(yù)分析因素，如血液收集管的類型，樣品儲(chǔ)存條件，以及離心協(xié)議。例如抗凝血?jiǎng)┤鏓DTA，肝素，檸檬酸鹽和預(yù)防的全血凝血細(xì)胞，通過(guò)減少?gòu)陌准?xì)胞的細(xì)胞群的DNA釋放。另外，離心分離條件的優(yōu)化是必需的，以防止裂解而充分從不含細(xì)胞的血漿分離單獨(dú)的

5、完整的細(xì)胞。6. 由于cfDNA生物標(biāo)記的低數(shù)量，建議的基因組DNA（gDNA）的背景水平被最小化，以提供精確的測(cè)量cfDNA水平。它是進(jìn)一步有利的cfDNA的結(jié)構(gòu)完整性被保持，由于最小金額可用于分析。因此，有必要解決幾個(gè)預(yù)先分析的問(wèn)題出現(xiàn)在抽血和隨后的DNA提取的過(guò)程中。這些問(wèn)題包括延遲血液處理，血液儲(chǔ)藏溫度和在運(yùn)輸過(guò)程中震蕩樣品。這樣的條件可能改變血漿DNA（質(zhì)粒DNA ）水平通過(guò)引起裂解核血細(xì)胞釋放基因組DNA和混淆真正的cfDNA。因此，它對(duì)于考慮血液采集裝置的類型和cfDNA樣品工作后放血條件是很重要的。7. 以前的努力都集中在化學(xué)方法，如使用甲醛基固定使cfDNA的分?jǐn)?shù)濃度變大和延

6、長(zhǎng)的后靜脈穿刺的時(shí)間，一個(gè)樣品可以被有效的分析。但是研究探討甲醛的有效性保存全血進(jìn)行的延長(zhǎng)性分析cfDNA濃度在生物樣品中已經(jīng)提供了統(tǒng)計(jì)不一致，例如，已經(jīng)證明，與甲醛一起治療血液樣品后立即抽血對(duì)保護(hù)胎兒cfDNA在材料中的比例不具有有利影響。8. 因此，有必要需要方法去穩(wěn)定和保護(hù)cfDNA，由此結(jié)構(gòu)完整性被維持和基因組背景DNA被最小化。使運(yùn)輸和儲(chǔ)存可能使cfDNA影響最小。有進(jìn)一步需要這樣的方法，其中醛固定的不利影響被避免。發(fā)明總結(jié)9. 使用本文的教導(dǎo)使用協(xié)議使用獨(dú)特的保護(hù)劑組合物成功地保留樣品，同時(shí)使用多種分析技術(shù)在一段長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)完全穩(wěn)定DNA。本教導(dǎo)提供了一個(gè)一致并有效的方法在血漿里保存D

7、NA。數(shù)據(jù)展示介紹了一種方法，可降低血細(xì)胞裂解，核酸酶的活性，并允許準(zhǔn)確和精確的解析分析靠保存的隨著時(shí)間的推移恢復(fù)cfDNA的最后濃度，在這樣做時(shí)，本教導(dǎo)提供了一種新的方法，提高了cfDNA血漿下游臨床分析。本發(fā)明防止污染血漿cfDNA 與細(xì)胞DNA，這是由內(nèi)穩(wěn)定的血細(xì)胞從受損細(xì)胞釋放的一個(gè)樣本。10. 本教導(dǎo)的描述通過(guò)含抑制脫氧核糖核酸酶的活性血漿保護(hù)cfDNA。作為有核血細(xì)胞的穩(wěn)定的結(jié)果，它不再需要在靜脈穿刺后立即分離血漿。此外，樣品可以在室溫下儲(chǔ)存達(dá)14天沒有對(duì)樣品的完整性的有害影響，這消除了需要對(duì)血漿樣品進(jìn)行冷凍儲(chǔ)存。11. 本教導(dǎo)進(jìn)一步提供了血液收集裝置在血漿中減少gDNA的背景水平

8、，當(dāng)樣品受儲(chǔ)存和運(yùn)輸條件發(fā)生的情況。在一方面，本教導(dǎo)考慮一個(gè)方法關(guān)于了血液樣本的治療包括定位的保護(hù)劑進(jìn)入血液采集設(shè)備。這個(gè)保護(hù)劑可以包含防腐劑。一個(gè)血液樣品被抽取到血液采集裝置后，血液樣品具有第一pDNA濃度。血液采集裝置接觸血液樣品后可能被運(yùn)輸從第一位置到第二位置，至少一部分所述輸送發(fā)生在溫度高于0，抽血后最少24小時(shí)才可分離游離DNA，樣本具有第二質(zhì)粒DNA 濃度，其特征在于，在任意統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著值方面，所述的第二質(zhì)粒DNA濃度不大于第一質(zhì)粒DNA濃度。12. 這里的教導(dǎo)還包括防腐劑可以從重氮烷基脲和咪唑烷基脲中選擇。防腐劑在接觸步驟之前的濃度為0.1g-3g/ml，游離DNA可以是抽血后至少

9、3天從樣品中分離，細(xì)胞DNA可以是抽血后至少7天從樣品中分離，細(xì)胞DNA可以是抽血后至少14天從樣品中分離. 樣品在抽血后具有第一基因組DNA濃度和運(yùn)輸之后具有第二基因組DNA濃度，在任意統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著值方面，第二基因組DNA的濃度不大于第一基因組DNA。在輸送過(guò)程中沒有發(fā)生血液樣本凍結(jié)，溫度要低于-30。保護(hù)劑接觸游離DNA，所以在抽血后最少為期7天的時(shí)間內(nèi)游離DNA的含量要占抽血后血液樣品中游離DNA的含量的90%。保護(hù)劑接觸游離DNA，所以在抽血后最少為期7天的時(shí)間內(nèi)樣品中存在的游離DNA的含量要占抽血后血液樣品中存在的游離DNA的含量的100%。13. 本文的教導(dǎo)，設(shè)想提高保護(hù)劑組合物，和

10、穩(wěn)定用于分析生物樣品的方法。保護(hù)劑組合物一般包括防腐劑，猝滅劑用來(lái)和樣品內(nèi)的DNA反應(yīng)大幅度降低自由醛，這樣的方法可以包括的步驟從血液收集裝置中獲得生物樣品。這個(gè)方法可能包括步驟關(guān)于接觸生物樣品當(dāng)血液收集裝置具有保護(hù)劑組合物包括了防腐劑，一個(gè)可選的抗凝血?jiǎng)?，一個(gè)猝滅劑去形成一個(gè)混合物包括了保護(hù)劑組合物和樣品。這個(gè)方法可能包括一個(gè)步驟關(guān)于猝滅任何自由甲醛，可能存在從保護(hù)劑組合物中得到的猝滅劑。因此自由甲醛反應(yīng)生成反應(yīng)產(chǎn)物使生物樣品中的cfDNA變得惰性。最終得到的混合物可能完全不含有任何醛，使樣品內(nèi)的核酸適用于聚合酶鏈反應(yīng)和DNA測(cè)序。并且基本上沒有醛誘導(dǎo)（ I）核酸（如DNA）的蛋白質(zhì)交聯(lián)，（

11、）核酸（如DNA）與核酸酸（如DNA）分子內(nèi)和/或分子間交聯(lián);或者（i ）和（ ii）都有，從而形成樣品，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），和DNA測(cè)序擴(kuò)增，由可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析法分析（VNTR），或者兩者皆有。14. 從血液中得到樣品后，可能有一個(gè)從病人抽血到血液收集裝置，有保護(hù)劑組合物在抽血步驟前被裝在其中。這個(gè)方法可能包括步驟關(guān)于運(yùn)輸樣品當(dāng)其接觸保護(hù)劑組合物從血液抽取的地方到臨床實(shí)驗(yàn)室，這將產(chǎn)生一個(gè)樣品分析。猝滅發(fā)生在接觸步驟之前或幾乎同時(shí)發(fā)生。這個(gè)方法可能包括步驟關(guān)于從樣品中分離游離DNA。這個(gè)方法可能是樣品不含任何離心步驟，這個(gè)方法可能是不含任何從母血中分離游離胎兒DNA的步驟，這個(gè)

12、方法可能是不含任何冷卻樣品的步驟在接觸保護(hù)劑組合物之后。15. 如可以從上面所理解的，本教導(dǎo)所提供的含DNA的樣品的有利治療和提供穩(wěn)定樣品那是基本基本上不含可檢測(cè)的共價(jià)修飾抑制PCR擴(kuò)增，如通過(guò)抑制聚合酶結(jié)合和伸長(zhǎng)率，引物退火和/或DNA染色體嵌入。任何修飾的核酸（例如， DNA ），其可以抑制準(zhǔn)確的PCR檢測(cè)和DNA測(cè)序作為保護(hù)劑組合物的處理關(guān)于目前教導(dǎo)是被延遲至少24，48，或96小時(shí)，一周甚至兩周的結(jié)果。本教導(dǎo)能夠取得更大的可預(yù)測(cè)性，有助于確保任何DNA序列是待擴(kuò)增或測(cè)序也不會(huì)被損壞。這提供了一個(gè)優(yōu)勢(shì)治療的DNA與甲醛。這就是認(rèn)為甲醛改性會(huì)立即阻止某些基因的擴(kuò)增和基因數(shù)不隨時(shí)間的增加而擴(kuò)

13、增。沒有預(yù)測(cè)哪些基因?qū)⒈坏谝粋€(gè)修改。因此，臨床醫(yī)生可能無(wú)法檢測(cè)某些特定的生物標(biāo)志物，和/或其他基因表征（如臨界基因突變或缺失而影響胎兒的發(fā)育，在游離胎兒DNA的分析的情況下）插圖的簡(jiǎn)單描述16. 圖1a顯示保護(hù)劑組合物在抽血3和6小時(shí)對(duì)pDNA檢測(cè)的影響17. 圖1b顯示根據(jù)本文的教導(dǎo)，保護(hù)劑組合物在抽血7和14天之后對(duì)pDNA檢測(cè)的影響。18. 圖2a顯示了在血漿中升高背景gDNA對(duì)罕見DNA序列檢測(cè)的影響19. 圖2b顯示了在血漿中升高背景gDNA對(duì)罕見DNA序列檢測(cè)的影響以及根據(jù)本文教導(dǎo)的示例性保護(hù)劑組合物的影響。20. 圖3a和3b顯示了震動(dòng)和運(yùn)輸對(duì)血液中pDNA濃度的影響，包括了根據(jù)

14、本文教導(dǎo)的在標(biāo)準(zhǔn)K3EDTA管中用示例性保護(hù)劑組合物對(duì)血液采集裝置中血液樣品進(jìn)行處理。21. 圖4a和4b顯示了存儲(chǔ)溫度對(duì)血樣中pDNA濃度的影響，包括了根據(jù)本文教導(dǎo)的在標(biāo)準(zhǔn)K3EDTA管中用示例性保護(hù)劑組合物對(duì)血液采集裝置中血液樣品進(jìn)行處理。 22. 圖5是原理圖描述說(shuō)明潛在的醛（例如甲醛）和基因組DNA樣本之間的相互作用。23. 圖6a和6b顯示了幾種模式中的一種的DNA-DNA的交聯(lián)反應(yīng)和幾種模式中的一種的DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)。24. 圖7a是核磁共振（NMR）讀出本文指導(dǎo)的用示例性保護(hù)劑組合物對(duì)血液采集裝置中血液樣品進(jìn)行處理，在82 ppm沒有任何的峰，支持了處理的樣品中是不含任何游

15、離甲醛的。25. 圖7b是一個(gè)核磁共振的甲醛樣品比較圖，在82ppm處有一個(gè)特征峰。26. 圖8a是一個(gè)系列的熒光光譜強(qiáng)度譜線比較DNA包含控制樣本(DNA(控制)和DNA接觸被保護(hù)劑組合物處理過(guò)的樣品（“DNA + CF DNA-1”)根據(jù)本指導(dǎo),甲醛（“DNA +0.1% form”)或戊二醛（“DNA + 0.1% 過(guò)剩”)， 該系列顯示樣品后在室溫下七天(最上一張圖 'RT 7天”),在室溫下樣品后七天之后加熱一小時(shí)在60度(中間的圖:),和樣品在室溫下放置七天之后加熱兩分鐘在90度(最下的圖)。27. 圖8b是一個(gè)系列的熒光光譜強(qiáng)度譜線比較DNA包含控制樣本(DNA(控制)和

16、DNA接觸被保護(hù)劑組合物處理過(guò)的樣品（“DNA + CF DNA-1”)根據(jù)本指導(dǎo),甲醛（“DNA +0.1% form”)或戊二醛（“DNA + 0.1% 過(guò)?！?， 該系列顯示樣品后在室溫下14天(最上一張圖 'RT 14天),在室溫下樣品后14天之后加熱一小時(shí)在60度(中間的圖:),和樣品在室溫下放置14天之后加熱兩分鐘在90度(最下的圖)。28. 圖9a-9c是凝膠電泳圖像說(shuō)明和比較PCR擴(kuò)增未經(jīng)處理的DNA（控制DNA）；根據(jù)本文所教導(dǎo)的處理DNA樣品（簡(jiǎn)記為DNA + CF - dna-bct），采用甲醛處理過(guò)的DNA樣品（DNA +形式表示）和用戊二醛處理過(guò)的DNA樣品（

17、DNA +過(guò)剩表示）。29. 圖10a-10d顯示了定量分析結(jié)果表明實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增DNA樣品通過(guò)保護(hù)劑組合物（DNA+ cfDNA BCT”）處理，并根據(jù)本指導(dǎo)把樣品抽取進(jìn)一個(gè)裝有保護(hù)劑組合物的血液采集裝置。甲醛（“DNA + 0.1% 組成”）或戊二醛（“DNA + 0.1%過(guò)剩），和比較與未經(jīng)處理的DNA控制樣品（“DNA控制”）。30. 圖11顯示了定量分析結(jié)果表明實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增DNA樣品通過(guò)保護(hù)劑組合物（DNA+ cfDNA BCT”）處理，并根據(jù)本指導(dǎo)把樣品抽取進(jìn)一個(gè)裝有保護(hù)劑組合物的血液采集裝置。甲醛（“DNA + 0.1% 組成”）或戊二醛（“DN

18、A + 0.1%過(guò)剩），和比較與未經(jīng)處理的DNA控制樣品（“DNA控制”）。31. 圖12a和12b顯示了圓二色光譜說(shuō)明圖天然DNA控制，DNA樣品根據(jù)本指導(dǎo)被處理，和被甲醛處理過(guò)的DNA樣品32. 圖13a-13d顯示了凝膠電泳圖片說(shuō)明一些平行線和比較未經(jīng)處理的對(duì)照樣品（記為'自然 DNA”）1，2，8和9）根據(jù)本教導(dǎo)用保護(hù)劑處理的DNA樣本（記為“DNA + cfDNA”；線3，4，10和11）DNA通過(guò)IDU處理（記為“DNA + IDU”；線5和12）樣品經(jīng)過(guò)甲醛處理（記為DNA + 0.1%”；線6和13），經(jīng)過(guò)戊二醛處理過(guò)的樣品（記作DNA + 0.1%過(guò)剩”；線7和14）

19、33. 圖14顯示了DNA酶處理血漿對(duì)cfDNA濃度的影響34. 圖15顯示在K3EDTA管儲(chǔ)存樣品對(duì)cfDNA濃度的影響。35. 圖16顯示了存儲(chǔ)在根據(jù)本發(fā)明的收集裝置儲(chǔ)存樣品對(duì)cfDNA濃度的影響36. 圖17顯示了猝滅步驟的化學(xué)方程式。37. 圖18顯示了一個(gè)額外的 猝滅步驟的化學(xué)方程式。38. 圖19顯示了甲醛的釋放和通過(guò)不同的猝滅劑猝滅。 39. 圖20顯示了水合甲醛存在不同的淬火劑。40. 圖21顯示了在不同猝滅劑中的甲醛濃度。 41. 圖22顯示了水合甲醛釋放的化學(xué)方程式。 42. 圖23顯示了甘氨酸/醛混合物的化學(xué)形式存在 43. 圖24顯示了甘氨酸和甲醛在室溫下的反應(yīng)化學(xué)方程

20、式 44. 圖25顯示了甘氨酸和甲醛在50下反應(yīng)4天的反應(yīng)化學(xué)方程式 45. 圖26顯示了甲醛的釋放和隨后的甲醛/甘氨酸反應(yīng)化學(xué)方程式46. 圖27顯示了猝滅劑和甲醛反應(yīng)的化學(xué)方程式。細(xì)節(jié)描述47. 除非有別的說(shuō)明，本文出現(xiàn)的百分?jǐn)?shù)是重量百分比。另外，除非討論的背景明確做出相反，引用核酸可包括核糖核酸（RNA ），脫氧核糖核酸酸（DNA） ，或各自的片段。比如，討論游離DNA（cfDNA）不止是指游離DNA，還指DNA片段。48. 本教導(dǎo)考慮非侵入性基因篩選方法來(lái)鑒定DNA序列表征，那可能指示各種潛在的病理狀況。包括但不限于癌癥，神經(jīng)遺傳學(xué)疾病，精神障礙，病毒感染，產(chǎn)前診斷，自身免疫性疾病，微

21、嵌合，急性心肌梗死。中風(fēng)。腸系膜缺血和胰腺炎。本指導(dǎo)不僅保留任何細(xì)胞在樣品中的形態(tài)，還保護(hù)游離DNA不受脫氧核糖核酸酶的活性的影響。該教導(dǎo)的方法通常包括以下步驟接觸生物樣本和不含醛的保護(hù)劑組合物在一定的數(shù)量和時(shí)間，這足以防止1.釋放基因組DNA進(jìn)入到血液樣品和2.脫氧核糖核酸活性降解樣品內(nèi)的游離核酸。這個(gè)處理充分防止了任何游離醛和樣品內(nèi)的游離核酸反應(yīng)。核酸的完整性充分保持在其基本狀態(tài)以避免任何醛的有害影響。因此精確分析樣品中的核酸可以被實(shí)現(xiàn)。這個(gè)方法還包括樣品中核酸的分析步驟已按照以上處理?；蚰切┯捎诜N種原因一直接觸的保護(hù)劑組合物和猝滅劑在其中。如前所述。本教導(dǎo)允許鑒定cfDNA特性在臨床上用

22、于預(yù)測(cè)和診斷應(yīng)用各種病理的條件。49. 醛基化學(xué)品。如甲醛和戊二醛，與各種親核的細(xì)胞成分反應(yīng)，成型， 例如，羥甲基衍生物的谷胱甘肽的硫醇基和RNA，DNA和蛋白質(zhì)的氨基。此外。這些醛作為交聯(lián)劑產(chǎn)生DNA -蛋白質(zhì)和DNA分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)，結(jié)合的甲醛誘導(dǎo)的DNA在上面修飾可以影響DNA的熔化，DNA 擴(kuò)大通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）及DNA序列分析。用于遺傳研究設(shè)計(jì)在PCR，這可以導(dǎo)致減少cfDNA濃度和阻礙在甲醛長(zhǎng)期固定后，除了荃基固定物在PCR基分析DNA的不利影響外，熒光發(fā)射光譜在甲醛固定的非均質(zhì)性DNA樣本，這表現(xiàn)在較低的總熒光信號(hào)和偽數(shù)據(jù)。總體而言，這個(gè)工作的主體表明，甲醛可以成功作

23、為一個(gè)單元保存而不利于下游分析測(cè)量精確cfDNA含量。檢測(cè)少量的的DNA目標(biāo)和DNA測(cè)序，可能從不利的化學(xué)修飾一致的長(zhǎng)期固定的生物分子，因此，提高cfDNA濃度的定性和定量在人類的生物流體中，有一個(gè)明確的需求關(guān)于時(shí)間和成本效益的方法，是不含甲醛、保存生物樣品的同時(shí)保持樣品完整性，質(zhì)量，和cfDNA的特異性分析。50. 本指導(dǎo)預(yù)想單一的保護(hù)劑組合物可能被使用，包括了防腐劑組合物和猝滅劑。例如保護(hù)劑組合物可能被預(yù)先裝入樣品采集裝置內(nèi)，如血液收集管。因此，它可能是從主體直接進(jìn)入血液收集裝置，然后有可能接觸保護(hù)劑組合物。也可能是從第一個(gè)轉(zhuǎn)移到第二個(gè)容器，保護(hù)劑組合物是現(xiàn)存的。51. 無(wú)醛（例如，無(wú)甲醛

24、）保護(hù)劑組合物可以包括防腐劑等成分可以從以下組中選擇：抗氧化劑尿素，咪唑烷基脲，dimethoylol-5,5dimethylhydantoin，二乙基脲，2 -溴- 2- nitropropane-l，二醇。惡唑烷，羥甲基甘氨酸鈉，5 hydroxymethoxymethyl-l - laza-3。7-dioxabicyclo 3，0，3辛烷，5-hydroxymethyl-l-laza-3,7-dioxabicyclo 3.3.0辛烷，5 hydroxypoly methyleneoxy methyl-l - laza-3。7-dioxabicyclo 3.3 .0辛烷或他們的組合。雖然無(wú)

25、醛（例如，無(wú)甲醛）保護(hù)劑組合物可以釋放醛（例如，甲醛）本教導(dǎo)的設(shè)想一個(gè)具體步驟的淬滅醛使其對(duì)cfDNA呈現(xiàn)惰性。52. 防腐劑組合物結(jié)合猝滅劑有助于保證核酸在樣品里避免和自由醛反應(yīng)，這會(huì)造成一個(gè)或多個(gè)對(duì)核酸有害的影響，本指導(dǎo)至少使用一個(gè)醛淬滅劑，這是在一個(gè)量，足以使任何游離醛（例如，甲醛）從保護(hù)劑組合物釋放反應(yīng)形成的反應(yīng)產(chǎn)物是對(duì)生物樣品的核酸惰性的。所得的混合物沒有任何的醛，樣品中的核酸適用于聚合酶鏈反應(yīng)和DNA排序，并與自然核酸相比保持結(jié)構(gòu)完整性53. 該防腐劑劑成分的濃度在與樣品接觸之前可以在這一濃度的DNA和DNA的交聯(lián)和DNA與蛋白質(zhì)的交聯(lián)，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳顯示。防腐劑成分的濃度在

26、接觸樣品后大于20mg/ml,10mg/ml,5mg/ml,2mg/ml,或者少于0.8mg/ml在保護(hù)劑組合物和生物樣品（血液）組成的混合物中。防腐劑的濃度在接觸樣品之前或之后可能改性取決于診斷程序樣品可以接受。例如，濃度可能被改性經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀分析，更具體地說(shuō)，濃度可能增加進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析后。因此，防腐劑成分的濃度在接觸樣品后可能大于15mg/ml，25mg/ml，或30mg/ml。保護(hù)劑組合物的配方可以被改性如樣品在經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀分析可以包括DU.保護(hù)劑組合物可能包括猝滅劑，保護(hù)劑組合物可能包括EDTA。54. 使用的淬滅劑的化合物，包括至少一個(gè)官能團(tuán)能夠與甲醛的缺電子性官能團(tuán)反應(yīng)，如

27、胺類化合物與甲醛反應(yīng)生成羥甲基和/ 或亞胺席夫堿或順式二醇化合物與甲醛反應(yīng)，形成一個(gè)環(huán)狀縮醛。淬滅劑可以選自氨基酸，烷基胺，多胺，伯胺，仲胺，銨鹽或任意組合。淬火劑可以選自甘氨酸，賴氨酸，乙二胺，精氨酸，尿素，鳥嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶：亞精胺?；蚱淙魏谓M合55. 淬滅劑的濃度是一個(gè)量足夠大，接觸樣品后隨著保護(hù)劑組合物。沒有游離醛。但是，猝滅劑的濃度是足夠小，稀釋的樣品將不會(huì)對(duì)任何樣品特性的分析產(chǎn)生重大影響的。猝滅劑濃度在接觸樣品之后可以是高于0.001g/ml,0.002g/ml,0.004g/ml,也可以是低于0.03g/ml,0.01g/ml，或0.008g/ml在保護(hù)劑組合物和生物樣品（

28、血液）組成的混合物中。56. 本指導(dǎo)假設(shè)使用的猝滅劑是甘氨酸與一個(gè)或其他猝滅劑的組合物，或者猝滅劑的類型和量的描述和甘氨酸不一樣。如猝滅劑可以是任意抗凝血?jiǎng)┖头栏瘎┏煞值慕M合物用于治療任何樣品中可能含有的游離DNA。(如胎兒游離DNA)57. 在接觸一個(gè)樣品形成的樣品和保護(hù)劑組成的混合物，保護(hù)劑組合物可能會(huì)出現(xiàn)在混合物體積的一小部分。在總體積中存在的量應(yīng)該少于5%，2%，0.5%甚至少于0.3%。保護(hù)劑的體積的量在1：20到1：300對(duì)應(yīng)于總混合物。58. 至少在接觸步驟中，保護(hù)劑的體積的量在1：20到1：300對(duì)應(yīng)于總混合物。比如在接觸步驟中，保護(hù)劑的體積的量在1：100到1：200對(duì)應(yīng)于總

29、混合物。59. 保護(hù)劑組合物可能包括至少一種保護(hù)劑組合物從重氮烷基脲，咪唑烷基脲dimethoylol-5,5dimethylhydantoin，二乙基脲，2 -溴- 2- nitropropane-l，二醇。惡唑烷，羥甲基甘氨酸鈉，5 hydroxymethoxymethyl-l - laza-3。7-dioxabicyclo 3，0，3辛烷，5-hydroxymethyl-l-laza-3,7-dioxabicyclo 3.3.0辛烷，5 hydroxypoly methyleneoxy methyl-l - laza-3。7-dioxabicyclo 3.3 .0辛烷中選擇。接觸步驟包括

30、采用的保護(hù)劑組合物，組合物包括IDU占混合物總重量的0.1%-2.0，可選擇的EDTA的量占混合物總重量的約0.05%-0.75，猝滅劑的量足以和任何游離的醛反應(yīng)，醛的量可能上升從IDU，去形成反應(yīng)產(chǎn)物生物樣品中的任何蛋白質(zhì)反應(yīng)。保護(hù)劑組合物可以包括20%-60%的咪唑烷基脲，大約1%-10%的猝滅劑，大約1%-20%的EDTA60. 每一個(gè)管包含50-400µl的保護(hù)劑組合物，每一個(gè)管包含100-300µl的保護(hù)劑組合物，每一個(gè)管包含150-250µl的保護(hù)劑組合物，保護(hù)劑組合物包含80-100mg的保護(hù)劑組合物，1-15mg的猝滅劑，10-25mg的EDTA。

31、在保護(hù)劑組合物中，可能包括10份重量的保護(hù)劑組合物對(duì)應(yīng)一份重量的猝滅劑，淬滅劑包括至少一個(gè)官能團(tuán)能夠與甲醛的缺電子性官能團(tuán)反應(yīng)。猝滅劑的成分從氨基酸，烷基胺，多胺，伯胺，仲胺，銨鹽或它們的組合中選擇。猝滅劑的成分從甘氨酸，賴氨酸，乙二胺，精氨酸，尿素，鳥嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶，亞精胺，或任何它們的組合中選擇，猝滅劑的成分從甘氨酸，賴氨酸，乙二胺，尿素或任何它們的組合中選擇。61. 從血漿中分離的cfDNA可能包括分離cfDNA沒有任何細(xì)胞。分離或分析步驟發(fā)生在靜脈穿刺至少2小時(shí)，7天，14天后。在分離或分析步驟的時(shí)候，溫度要低于-30，且樣品和其組分不能發(fā)生凍結(jié)。62. 保護(hù)劑組合物可選擇包括

32、核酸酶抑制劑從以下組分里面選擇：焦碳酸二乙酯，乙醇。鋁酸（ATA），甲酰胺，氧釩核糖核苷復(fù)合物，硅藻土，乙二胺四乙酸（EDTA），蛋白酶K，肝素，羥胺-氧銅離子，膨潤(rùn)土，二硫蘇糖醇（DTT）、-巰基乙醇（BME），半胱氨酸，二硫赤蘚糖醇，三（2 -羧乙基）光幻視鹽酸鹽。二價(jià)陽(yáng)離子，如Mg2 +, Mr12 +，2r12+，F(xiàn)e2+, Ca2 +,Cu2+和其任何組合，保護(hù)劑組合物可以包括一種防腐劑組成，醛淬滅劑，和抗凝血藥。保護(hù)劑組合物可以包括咪唑烷基脲，甘氨酸，乙二胺四乙酸63. 該組合物和方法在此盡可能避免任何在樣品中的游離甲醛（或其他的醛），從而有助于避免任何這樣的游離甲醛的潛在對(duì)核酸的

33、有害影響，該組合物和方法在此可以擴(kuò)增核酸（例如DNA）根據(jù)本教導(dǎo)處理。64. 確定了那一個(gè)組合物基本上不含游離醛，尤其是沒有的任何游離甲醛（可能是水合甲醛）和/或亞甲基二醇可以使用已知的技術(shù)，如通過(guò)13C核磁共振（NMR）。組合物本質(zhì)上完全不含自由醛和/或亞甲基二醇典型的在NMR光譜82-85ppm中沒有特征峰。65. 不同濃度的防腐劑組合物淬滅劑可能包含在保護(hù)劑組合物可以分析使用13C核磁共振測(cè)定減少大量所需游離醛的濃度。更具體地說(shuō)，各種防腐劑組合物（包括咪唑烷基脲（IDU），（DU），甲醇，甲醛，和oxaban-a（4,4-dimethyl-1,3 -惡唑烷）在不同濃度組合不同濃度的猝滅劑

34、。比如16.7毫克的Gd-DTPA轉(zhuǎn)移到一個(gè)空瓶和3.5毫升D2O加入到小瓶。每個(gè)樣品制備稱量15 - 17µl的四氫呋喃轉(zhuǎn)移到空管和四氫呋喃加上管的重量被記錄。300µl的樣品溶液在水中轉(zhuǎn)移通過(guò)添加200µl GD-DTPA / D2O溶液。13C NMR光譜可以捕獲。表一是結(jié)果。66. 任何確定的化學(xué)變化關(guān)于DNA雙螺旋的形成會(huì)發(fā)生同樣表現(xiàn)使用已知的技術(shù)，如光譜法，它可以用于探測(cè)的光學(xué)現(xiàn)象如熒光。用這個(gè)方法，控制樣品中的DNA可以被測(cè)量跟比較處理過(guò)的DNA樣品為了確定任何螺旋構(gòu)象的影響，使用圓二色譜（CD）光譜，根據(jù)預(yù)測(cè)，處理過(guò)的樣品表現(xiàn)出的CD光譜，與本地的

35、DNA一致。二級(jí)結(jié)構(gòu)沒有改變的跡象。67. 由此產(chǎn)生的混合物，可以被處理包括一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物包括羥甲基，席夫堿。一個(gè)席夫堿猝滅劑交聯(lián)結(jié)構(gòu)，或一個(gè)希夫堿二聚體。對(duì)于一個(gè)說(shuō)明性組合物，本指導(dǎo)考慮組成兩個(gè)或更多的IDU，IDU甘氨酸反應(yīng)產(chǎn)品，甘氨酸，甘氨酸羥甲基， 甘氨酸希夫堿，甘氨酸交聯(lián)希夫堿，或希夫堿二聚體。68. 根據(jù)本教導(dǎo)處理混合物，可能包括血液細(xì)胞沒有細(xì)胞蛋白質(zhì)的變性。產(chǎn)生的細(xì)胞膜膜內(nèi)的細(xì)胞能夠被加工和運(yùn)輸,沒有檢測(cè)到泄漏。因此,樣品可能足夠完整，游離液體真正準(zhǔn)確地代表細(xì)胞外流體。進(jìn)一步說(shuō)，盡管和一些蛋白(不是核酸)的結(jié)合可能發(fā)生。結(jié)合不是不可逆的,而是通過(guò)加熱去除,溫度可以達(dá)到600度

36、到900度。因此本教導(dǎo)也考慮一個(gè)可選的步驟的加熱處理樣品一段時(shí)間，溫度足以分離蛋白質(zhì)(比如大約600度到900度)。文中所述加熱步驟可以用于凈化核酸樣本和去除任何核酸樣品污染。這樣的加熱步驟可能是結(jié)合使用的蛋白酶可能是絲氨酸蛋白酶,如蛋白酶K。69. 在一個(gè)方面:本專利對(duì)于變量數(shù)據(jù)串聯(lián)重復(fù)(VNTR)的分析特別有用。這使得本教導(dǎo)適用于犯罪現(xiàn)場(chǎng)分析,或其他法醫(yī)DNA分析。在這種情況下,這樣的方法成為可能：采用抽取血液樣本到一個(gè)空的血液收集管中,其中根據(jù)本指導(dǎo)包含一個(gè)保護(hù)劑組合物。相應(yīng)的血液細(xì)胞可以穩(wěn)定防止其釋放核酸,以及猝滅任何自由醛(如。甲醛)。游離DNA可以分離和可選地暴露于一個(gè)或多個(gè)合適的

37、酶切割DNA區(qū)域在VNTRS周圍。VNTRS。可以從犯罪現(xiàn)場(chǎng)收集DNA來(lái)分析和比較。在親子鑒定案例測(cè)試中，血液抽取方法如上所述可能用于后代和潛在父親。 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)可以用于放大一個(gè)樣本。產(chǎn)生的放大樣品可以被分析,例如，通過(guò)合適的光學(xué)技術(shù)解析樣本的光譜。例如,短串聯(lián)重復(fù)(STR)基因座可能是多路復(fù)用。還被認(rèn)定大量的樣品未受到保護(hù)劑成分的影響。證明存在的缺失變性的STR基因座和交聯(lián)的缺失位點(diǎn)。此外,由于對(duì)組合物長(zhǎng)期穩(wěn)定的影響 (如至少1周，2周，4周或更長(zhǎng)時(shí)間),它可以在相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間使用樣品。并避免需要抽取多個(gè)血液樣本。70. 71. 72. 本指導(dǎo)所考慮的其他應(yīng)用。包括但不限于提取

38、游離DNA用于檢測(cè)癌癥(包括但不限于癌、白血病或淋巴瘤)。例如,這里的教導(dǎo)也許可以用于檢測(cè)乳腺癌的異常甲基化,前列腺癌癥、胃癌、卵巢癌。結(jié)直腸癌。膀胱癌,睪丸癌。食道癌。黑色素瘤或其他癌癥。73. 按照本指導(dǎo),血液樣本可以包含一個(gè)保護(hù)劑組合物,任何醛可以被猝滅, 提取產(chǎn)生的DNA進(jìn)行分析。分析包括分析DNA的甲基化模式。分析可能是用于確定(如甲基化生物標(biāo)志物，與一個(gè)或多個(gè)相關(guān)的癌癥。神經(jīng)變性紊亂和/或精神紊亂(如精神分裂癥、抑郁癥或其他)。例如,分析可能是用于識(shí)別發(fā)生甲基化胞嘧啶。分析可能是用于檢測(cè)和/或監(jiān)測(cè)病毒感染、自身免疫性疾病、微嵌合體,急性心肌梗塞、中風(fēng)、腸系膜缺血和胰腺炎。當(dāng)然,分析

39、也可能用于產(chǎn)前診斷74. 分析可能采用PCR擴(kuò)增和檢測(cè),質(zhì)譜分析,并行DNA測(cè)序或其他合適的分析技術(shù)的一種來(lái)檢測(cè)，,診斷,治療和/或監(jiān)控疾病狀態(tài)或條件。75. 本教導(dǎo)也可能采取措施監(jiān)測(cè)治療病人的一些治療的反應(yīng)(如輻射和/或藥物治療)。血液樣本可以在第一時(shí)間獲取，根據(jù)教義處理和DNA分析。血液樣本可以在第一時(shí)間后一次或多次獲取，根據(jù)教義處理和DNA分析。各自的分析的結(jié)果可能會(huì)被比較,治療可能會(huì)改變根據(jù)結(jié)果的比較。76. 本指導(dǎo)可能進(jìn)一步被用來(lái)保護(hù)生物樣品在運(yùn)輸和貯藏。運(yùn)輸血液樣本從靜脈穿刺的地方到另一個(gè)設(shè)備，通常所需的分子診斷檢測(cè)。正如文中所討論的,一些預(yù)分析變量可能影響cfDNA測(cè)量準(zhǔn)確性,包

40、括血液采集設(shè)備的選擇和樣品儲(chǔ)存和運(yùn)輸條件。這些參數(shù)影響的有核血細(xì)胞在靜脈穿刺后裂解。有核細(xì)胞裂解導(dǎo)致釋放gDNA，提升pDNA背景和壓制真正cfDNA測(cè)量。因此應(yīng)該盡量減少背景gDNA增加,通常發(fā)生在運(yùn)輸和存儲(chǔ)是基于樣本的移動(dòng)和溫度變化。77. 在運(yùn)輸期間,震動(dòng)可能會(huì)擾亂有核血細(xì)胞準(zhǔn)確性完整性和妥協(xié),如上所述。在模擬運(yùn)輸條件(使用軌道振動(dòng)器)在24小時(shí)內(nèi),血液樣本置于K3EDTA和具有保護(hù)劑組合物血液采集裝置進(jìn)行比較。在K3EDTA血樣觀察到在6和24小時(shí)pDNA濃度增加。用保護(hù)劑組合物穩(wěn)定的血細(xì)胞的pDNA在震動(dòng)條件下沒有表現(xiàn)出相當(dāng)大的增加。78. 樣品運(yùn)輸時(shí),也觀察到類似的趨勢(shì),當(dāng)樣品被震

41、動(dòng)。樣本運(yùn)送K3EDTA或保護(hù)劑組成血液采集設(shè)備比較兩管之間pDNA濃度的結(jié)果。在運(yùn)輸前后保護(hù)劑組合物樣本顯示穩(wěn)定pDNA濃度,而K3EDTA顯示在運(yùn)輸條件下，pDNA濃度增加。這表明有核細(xì)胞裂解導(dǎo)致gDNA釋放發(fā)生在K3EDTA中的血液樣本中, 但這并沒有發(fā)生在保護(hù)劑組合物的樣本中。79. 在當(dāng)前的實(shí)踐中,血液樣本通常用離心來(lái)分離血漿和冷凍來(lái)防止gDNA污染cfDNA在樣品的處理、運(yùn)輸和儲(chǔ)存過(guò)程中。穩(wěn)定化學(xué)保護(hù)劑組合物防gDNA在靜脈穿刺0到14天后釋放到血漿中。使用血液采集設(shè)備透露,來(lái)自體內(nèi)的儲(chǔ)存在室溫下成為可能，允許靈活裝置外抽血送到中央實(shí)驗(yàn)室下游分析cfDNA沒有初步離心或冷凍保存。8

42、0. 在當(dāng)前的實(shí)踐中,血液樣本通常通過(guò)離心來(lái)分離樣本可能來(lái)自最初的一個(gè)或多個(gè)生物物質(zhì)形式。樣品可能包括細(xì)胞，也可能是不含細(xì)胞。一般情況下，樣品預(yù)計(jì)將有一些初步的游離DNA,是要求大幅保持游離DNA和保護(hù)的游離DNA從脫氧核糖核酸酶的活動(dòng)中,以便它可以有效地分析。81. 樣品可能在任何數(shù)量的方式收集 。他們可能會(huì)收集通過(guò)靜脈穿刺，通過(guò)注射器,拭子,放電收集,或其他方面。他們可能會(huì)收集在容器(如瓶、樣本收集杯,集合管、毛細(xì)管或其他)。容器根據(jù)本指導(dǎo)可能包括保護(hù)劑組合物，樣品可能是血液樣本,方法可能包括獲得新鮮血液樣本進(jìn)入一個(gè)空的血液收集管,包括保護(hù)劑成分預(yù)先放置。82. 方法可能包括一個(gè)或多個(gè)核酸

43、分析的分析步驟。例如,可能包括一個(gè)步驟的方法對(duì)樣品的定性聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增,定量聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增在猝滅之后。這個(gè)方法可能包括一個(gè)步驟的方法對(duì)樣品的定性聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增,定量聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增在淬滅步驟發(fā)生至少四天,一周或兩周后在淬滅步驟之后。該方法可能包括對(duì)樣品的質(zhì)譜分析的步驟。方法可能包括一個(gè)步驟對(duì)樣品的質(zhì)譜至少4天,一個(gè)星期。兩周在猝滅步驟之后。該方法可能包括對(duì)樣本DNA測(cè)序的步驟。的方法可能包括一個(gè)步驟對(duì)樣本DNA測(cè)序發(fā)生至少四天,一周或兩周在猝滅步驟之后。方法或者可能包括一個(gè)步驟對(duì)樣品進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。83. 本指導(dǎo)與享樂保護(hù)劑組合物的范圍。單獨(dú)和/或結(jié)合樣本收集容器(如空采血設(shè)備),包

44、括保護(hù)劑組合物(如。在樣本收集容器,如血液收集管)，其他試劑,聚合酶鏈反應(yīng)樣本容器(如管)或類似的。 也有利地設(shè)想在教導(dǎo)的方法執(zhí)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增的一個(gè)樣品,包括從一個(gè)生物樣品放大核酸(如脫氧核糖核酸(DNA),按照上面的方法處理。此外,有利地設(shè)想確定可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列的方法(VNTR)DNA樣本,包括根據(jù)本指導(dǎo)處理樣品，確定樣本VNTR樣本模式，比較第一lrNTR模式從一個(gè)已知DNA樣品的lrNTR模式，并決定樣品VNTR模式是否匹配第一個(gè)VNTR模式。84. 本教義均可以用于任何數(shù)量的應(yīng)用,并可用于提高本指導(dǎo)包括基因組大屏幕的胎兒DNA。例如本指導(dǎo)可以找到合適的申請(qǐng)定量實(shí)時(shí)PCR用于基因

45、識(shí)別三體綜合癥(唐氏綜合癥),至少有一步檢測(cè)DNA拷貝數(shù)的增加。根據(jù)本指導(dǎo)分析樣品,一般來(lái)說(shuō),這可能是在離開臨床進(jìn)行(如一個(gè)位置遠(yuǎn)離產(chǎn)婦抽血的位置(如至少100米,1000米,10000米或更多)。 由于遠(yuǎn)程特性,通常會(huì)有一個(gè)步驟運(yùn)送樣品來(lái)做臨床分析。這樣運(yùn)輸可能不需要冷藏。85. 此外,本指導(dǎo)在法醫(yī)DNA分析提供有用的應(yīng)用。在放大DNA樣本的過(guò)程中。放大VNTRs可能集體運(yùn)行在一個(gè)獨(dú)立的瓊脂糖凝膠,它解決了lrNTR DNA片段根據(jù)它們的大小和特定主題的(如,犯罪嫌疑人)的已知VNTR模式。定性比較DNA大小的模式在瓊脂糖凝膠可以跟在犯罪現(xiàn)場(chǎng)收集DNA樣本對(duì)比匹配。本教導(dǎo)可能用于獲取和保護(hù)嫌

46、疑人的血液樣本,獲取和保護(hù)犯罪現(xiàn)場(chǎng)樣本,或兩者都有。例子86. 血液樣本來(lái)自健康的捐贈(zèng)者注入到K3EDTA、血液采集管包含一個(gè)防護(hù)劑組成。模擬運(yùn)輸條件下,樣本晃動(dòng)或不晃動(dòng)。樣品運(yùn)輸或不運(yùn)輸。評(píng)估溫度變化。樣本在6度，22度和37度培養(yǎng)。在所有情況下血漿是由離心收獲和總血漿DNA(pDNA)通過(guò)分析定量實(shí)時(shí)PCR(qPCR)。搖晃K3EDTA管中的血液pDNA大量增加而保護(hù)劑組合物的樣品沒有改變。 血液運(yùn)輸在K3 EDTA管中pDNA增加相比較于那些在保護(hù)劑組合物中運(yùn)輸。血液在K3EDTA管中以6度，22度，37度培養(yǎng)時(shí)pDNA增加而保護(hù)劑組合物中樣品的pDNA保持穩(wěn)定。保護(hù)劑組合物可以防止背景

47、gDNA水平的增加在樣本存儲(chǔ)和運(yùn)輸過(guò)程中。因此,保護(hù)劑成分提供了一種新穎的方法來(lái)獲得質(zhì)量穩(wěn)定的低豐度的DNA樣本目標(biāo)探測(cè)和精確的cfDNA濃度。87. PCR檢測(cè)游離DNA的目標(biāo)在一個(gè)高gDNA背景是具有挑戰(zhàn)性的,需要特殊協(xié)議和/或大量的原始材料。因此,從有核細(xì)胞最小化釋放gDNA對(duì)于準(zhǔn)確分析真正的cfDNA至關(guān)重要。增加背景gDNA不利于檢測(cè)低豐度cfDNA目標(biāo)。(圖2c)。在7天和14 K3EDTA樣品中pDNA濃度增加由于gDNA釋放。檢測(cè)引入SRY片段降低(圖2a)。相比之下。含有保護(hù)劑組合物管的樣品在7天和14天之后pDNA濃度沒有顯著變化,卻發(fā)現(xiàn)SRY片段整個(gè)時(shí)間段內(nèi)保持穩(wěn)定(圖2

48、 b)。88. 樣本儲(chǔ)存溫度的變化是另一個(gè)靜脈穿刺條件,可能導(dǎo)致gDNA濃度的變化。三個(gè)不同的存儲(chǔ)溫度對(duì)pDNA濃度的影響的血液樣本抽取到K3EDTA和保護(hù)劑組成物被監(jiān)控。抽血后,樣本在6度，22度，37度培養(yǎng) 14天。K,EDTA血液樣本pDNA濃度在6度，22度，37度培養(yǎng)7天和14天后顯著變化(圖4a)。抽取血液到保護(hù)劑組合物管中顯示沒有任何pDNA濃度的增加, (圖4 b)。這說(shuō)明保護(hù)劑組合物穩(wěn)定pDNA的水平,在廣泛的溫度范圍在較長(zhǎng)一段時(shí)間防止gDNA釋放。89. 招募了一些捐贈(zèng)者，捐贈(zèng)者都是男性和女性,都是健康的。所有都使用靜脈穿刺經(jīng)行抽血。對(duì)于每一個(gè)實(shí)驗(yàn),捐贈(zèng)血液樣本被放入到到兩

49、個(gè)不同的管?？刂茦颖颈怀槿隟3EDTA管和對(duì)照樣品放入有保護(hù)劑組合物的管。血液立即混合在抽取后通過(guò)反復(fù)顛倒10次。90. 樣品處理91. 靜脈穿刺后血液樣本被儲(chǔ)存在室溫下(22度),除非另有聲明。對(duì)于分離血漿，血液樣本在22度300 xg離心20分鐘。血漿層小心的移除而不打擾淡白細(xì)胞層。使用吸管轉(zhuǎn)移到一個(gè)新瓶在22度5000 xg 離心10分鐘去除殘余細(xì)胞。92. 從血漿中分離游離DNA93. 通過(guò)提高蛋白酶K在60度持續(xù)處理30分鐘到1小時(shí).樣本在50 UL無(wú)菌無(wú)核酸酶的水中儲(chǔ)存在-80度。直到實(shí)時(shí)分析qPCR94. 實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR) 95. 96. 儲(chǔ)存溫度對(duì)血液樣本中pDNA濃

50、度的影響97. 血液8個(gè)捐助者處收集，并注入K3EDTA管和保護(hù)劑組合物管。血液樣品被等分并分成三組由三份K3EDTA和三份保護(hù)劑組合物。每一份儲(chǔ)存在6度。,另一組在22度,最后一組在37度 .在每個(gè)溫度在0天、7和14天獲得血漿并儲(chǔ)存在-80 度。直到pDNA提取并分析了通過(guò)qPCR使用-actin化驗(yàn)。98. 在血液樣本中震動(dòng)和運(yùn)輸對(duì)pDNA濃度的影響99. 模擬運(yùn)輸血液來(lái)自八個(gè)捐助者，抽血到K3EDTA管和保護(hù)劑組合物管。管安全的放置在一個(gè)搖動(dòng)平臺(tái)上,在22度以150rpm的速度搖晃。時(shí)間點(diǎn)為0，3，6和24小時(shí)，從一個(gè)K3EDTA管中提取的血漿和一個(gè)從報(bào)估計(jì)組合物管中提取的血漿在-80

51、度冷凍，直到提取和分析。在一個(gè)單獨(dú)的運(yùn)輸研究中,血液從十個(gè)捐助者得來(lái)并注入K3EDTA管和保護(hù)劑組合物管。管通過(guò)4天的運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室并保存在-80度，直到提取和分析。一個(gè)管的控制組沒有運(yùn)送，血漿在0和4天獲得。對(duì)于晃動(dòng)和運(yùn)送樣品,pDNA通過(guò)qPCR使用11-actin化驗(yàn)。100. 統(tǒng)計(jì)分析 101. 統(tǒng)計(jì)分析的實(shí)驗(yàn)室名字.balabalabala102. 保護(hù)劑組合物中的化學(xué)物質(zhì)的存在對(duì)pDNA擴(kuò)增的影響 103. 我們調(diào)查保護(hù)劑組合物對(duì)pDNA通過(guò)qPCR擴(kuò)增的影響(圖1).血液被抽取到K3EDTA管，血漿被離心分離。血漿上清層被等分為兩個(gè)治療組。一組為血漿樣本(灰條),添加的保護(hù)劑組合物

52、的濃度等于標(biāo)準(zhǔn)10毫升血液。另一組的血漿樣品(黑色條)沒有經(jīng)過(guò)處理并作為控制。每組樣本都經(jīng)過(guò)處理3和6小時(shí)(板a)和7和14天(板b)。pDNA濃度測(cè)定使用13 -actin qPCR化驗(yàn)。和未經(jīng)處理的樣品相比，樣品通過(guò)化學(xué)物質(zhì)處理后發(fā)現(xiàn)DNA從血漿中提取或其通過(guò)qPCR放大沒有減少。誤差線表明SD ,所有板的n=5。在圖1中,比較經(jīng)過(guò)化學(xué)處理和未經(jīng)處理的血漿樣本中的pDNA濃度沒有減少在22度放大3和6小時(shí)培養(yǎng)后。（圖1a,p= 0.44,p=0.52);樣品培養(yǎng)7和14天顯示類似的結(jié)果(圖1 b、6 p = 0.23,p = 0.003)。這些發(fā)現(xiàn)表明防護(hù)劑的化學(xué)物質(zhì)成分沒有影響DNA從血

53、漿中提取或其通過(guò)qPCR放大。 104. 提升血漿中的背景gDNA對(duì)檢測(cè)少見cfDNA序列的影響。 105. 我們模擬gDNA增加濃度的影響。通過(guò)-actin化驗(yàn)測(cè)量，檢測(cè)低豐度cfDNA目標(biāo)通過(guò)引入男特征的DNA(SRY)進(jìn)入到非孕期女性血液(圖2)。來(lái)自非孕期女性捐贈(zèng)者的血液進(jìn)入到K3EDTA管和保護(hù)劑組合物管，儲(chǔ)存在22度，0，7和14天。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，血漿被離心分離。pDNA的構(gòu)建物包含SRY序列片段 (3000個(gè)復(fù)制)?？偟难獫{DNA濃度可以使用-actin qPCR化驗(yàn)來(lái)測(cè)定(O)和Y染色體序列復(fù)制數(shù)據(jù)是由SRY qPCR化驗(yàn)測(cè)定()。對(duì)于K3EDTA樣本(圖2)， pDNA在 K

54、3EDTA樣品中濃度增加(*p < 0.05, * * p < 0.001),防護(hù)劑組成的樣本(圖28),pDNA濃度保持接近第一天的值(* * p < 0.001)106. 圖2顯示了在這血漿中的兩個(gè)基因目標(biāo)中的的DNA濃度從K3EDTA樣本存儲(chǔ)在22度 ，0，7和14天。gDNA被釋放到血漿中。顯著增加gDNA水平通過(guò)(13-actin)觀察在7和14天的時(shí)候,比初始濃度在0天(p = 0.0087,p = 0.0002)。的時(shí)候增加。檢測(cè)的cfDNA目標(biāo)(SRY基因片段)濃度明顯降低(7天，p=0.0068, 14天,p = < 0.0001)。107. 圖2 b

55、顯示了pDNA濃度在保護(hù)劑組合物樣本存儲(chǔ)在相同的存儲(chǔ)條件。血漿從保護(hù)劑組合物樣本中得到顯示13 -actin濃度無(wú)顯著變化7天，（p=0.55）但在14天時(shí)(p=0.0002)。有保護(hù)劑組合物時(shí), 剩余gDNA (13 -actin)水平接近第一天的值,cfDNA(SRY基因片段)水平并沒有改變,仍可在整個(gè)時(shí)間進(jìn)程檢測(cè)(第七天,p = 0.45和14天,p = 0.20)。 108. 為了更清楚地說(shuō)明cfDNA目標(biāo)探測(cè)gDNA水平變化的影響,褶皺變化進(jìn)行計(jì)算(圖2 c)。由于K3EDTA gDNA水平增加(13 -actin,第七天= 51-褶皺變化)第14天 = 92-褶皺變化),cfDNA

56、檢測(cè)下降(SRY、第七天= -3-褶皺變化,第14天 = -95-褶皺變化)。保護(hù)劑成分gDNA水平保持相對(duì)穩(wěn)定和cfDNA目標(biāo)探測(cè)(SRY、第七天=-1-褶皺變化,第14天 = -1-褶皺變化)。109. 震動(dòng)和運(yùn)輸對(duì)在血液樣本中pDNA濃度的影響110. 攪拌條件下呈現(xiàn)在樣品運(yùn)輸模擬軌道振動(dòng)器?？刂茖?shí)驗(yàn)中也使用這兩種類型的管而沒有震蕩(圖3)。血樣進(jìn)入K3EDTA管和保護(hù)劑組合物管,然后在22度震動(dòng)0，3，6，24小時(shí)。一個(gè)K3EDTA管(o)和一個(gè)保護(hù)劑組成管(a)去除,pDNA被分離。K3EDTA管,受到搖動(dòng)顯示pDNA濃度在3、6和24小時(shí)相比時(shí)間0顯著增加(* p < 0.0

57、5,p < 0.001)。總血漿DNA濃度在震動(dòng)保護(hù)劑組合物樣本和沒有震動(dòng)的樣本中保持不變。 111. 圖3表明,震蕩血液進(jìn)入K3EDTA管導(dǎo)致pDNA濃度顯著增加,3、6和24小時(shí)在抽血之后(p = 0.03,0.03和0.0003),而震蕩血液進(jìn)入保護(hù)劑組合物管顯示沒有變化(p = 0.14，0.34和0.31)。沒有震動(dòng)控制樣本進(jìn)入K3EDTA、保護(hù)劑組合物管的pDNA濃度沒有變化3小時(shí)(p = 0.14和0.22),6小時(shí)(p = 0.33,0.52)或24小時(shí) (p = 0.29,0.29)。 112. 模仿運(yùn)輸后,新樣品抽入K3EDTA管或保護(hù)劑組合物管。管在22度用4天運(yùn)輸

58、。圖3 b說(shuō)明了在運(yùn)送K3EDTA和運(yùn)送保護(hù)劑成分樣品在返回后pDNA濃度（p=0.01）顯著增加。相對(duì)于初始值，運(yùn)送K3EDTA (p = 0.015)和沒有運(yùn)輸K3EDTA(p = o.013) pDNA濃度顯著增加。而保護(hù)劑組合物管的pDNA濃度和初始值比沒有變化(p = 0.399和0.340)。 113. 儲(chǔ)存溫度對(duì)在血液樣本pDNA濃度的影響114. 抽取血液進(jìn)入K3EDTA管和保護(hù)劑組合物管，樣本存儲(chǔ)在6度，22度，37度保存0到14天(圖4)。血液抽入K3EDTA管和防護(hù)劑組合物管。血樣等分成三組,每組由3等分 K3EDTA和3 等分保護(hù)劑組成。一份在6度(),一份在22度(O

59、)和一份在37度(l)。pDNA濃度測(cè)定使用13 -actin qPCR化驗(yàn)。樣品進(jìn)入K3EDTA(圖4)和存儲(chǔ)溫度顯示,和0天相比pDNA濃度顯著增加, pDNA從保護(hù)劑組合物樣本中分離出來(lái)(圖4 b)顯示在14天內(nèi)很小的變化(* p < 0.05,p < 0.001)。115.116. 褶皺變化計(jì)算(圖4 a和4 b表插圖)說(shuō)明了在K3EDTA管中 pDNA水平在7和14天增加，而保護(hù)劑組合物樣本pDNA水平變化保持最小。 117. 參照?qǐng)D5、甲醛作為細(xì)胞固定劑由于其交聯(lián)氨基酸的能力,氨基、胍基、硫醇、酚醛。形成DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)或DNA-DNA 交聯(lián),但重要的是,損傷類型阻礙了遺傳。福爾馬林誘導(dǎo)交聯(lián)有效保存DNA結(jié)構(gòu)形態(tài),但它非常不利于后續(xù)的DNA分析,因?yàn)榻宦?lián)基失速聚合酶和DNA-DN