植物細(xì)胞骨架的光學(xué)顯微鏡觀察

1、幾種不同類型顯微鏡的使用及其對胞質(zhì)環(huán)流的觀察一、實驗?zāi)康膶W(xué)會使用相差顯微鏡，掌握暗視野技術(shù)，以及熒光顯微鏡等技術(shù)二、實驗原理在活細(xì)胞中，原生質(zhì)流動是細(xì)胞活力強弱的重要標(biāo)志，它的產(chǎn)生與細(xì)胞中微絲的作用是密不可分的。微絲的纖維較細(xì)，直徑為5-6nm,主要成分是肌動蛋白、肌球蛋白和原肌球蛋白，并像肌肉一樣有收縮功能。微管是由一種叫做微管蛋白的蛋白質(zhì)組成的，位于原生質(zhì)（靜止的）外質(zhì)，緊靠在質(zhì)膜之下，離運動的內(nèi)質(zhì)至少有1|im的距離，與胞質(zhì)川流運動無尖，主要起保持細(xì)胞形狀、承擔(dān)細(xì)胞運動和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運輸?shù)淖饔?。另外，用秋水仙素與細(xì)胞松弛素B處理也可產(chǎn)生不同的結(jié)果。經(jīng)秋水仙素處理后，細(xì)胞的纖維被擾亂，但不影

2、響川流運動，這是與秋水仙素影響邊緣微管作用有尖。相反，用細(xì)胞松弛素B處理，就可抑制細(xì)胞的川流運動，很明顯，微絲擔(dān)負(fù)著川流運動的功能。胞質(zhì)環(huán)流需要消耗能量，也受溫度'滲透壓以及離子濃度的影響。三、實驗材料新鮮洋蔥鱗莖，剛毛藻等。四、實驗器材相差顯微鏡，普通光學(xué)顯微鏡，黑卡紙，載玻璃片，蓋玻片，錫子，吸水紙，剪刀，滴管，擦鏡紙。五、實驗藥品100|ig/ml秋水仙素溶液，20|ig/ml細(xì)胞松弛素B（cytochalasinB），蒸Y留水，香玻油，二甲苯。六、實驗步驟1 .取新鮮洋蔥鱗莖內(nèi)表皮約1cm?或更小，放在干凈的載玻片上，加一小滴水，將蓋玻片傾斜蓋上，并注意不出現(xiàn)氣泡，即制成水封片

3、。2 .取一塊黑紙，把它剪成暗視野顯微鏡用的遮光板，并放入普通光學(xué)顯微鏡的聚光器下的光闌上，制成暗視野顯微鏡。（須反復(fù)調(diào)整遮光板的尺寸以得到最佳效果）。3 .把制成的水封片放在暗視野顯微鏡下用10倍物鏡觀察，可以看到在明亮的細(xì)胞壁與半透明的細(xì)胞核之間有很多極小而明亮的“質(zhì)點”或顆粒，仔細(xì)觀察，可以看出這些正作有向的運動（速度很慢）水封片中多加些水會促進(jìn)這種運動4 學(xué)習(xí)相差顯微鏡，熒光顯微鏡和倒置顯微鏡的使用方法和有尖操作技術(shù)。植物細(xì)胞骨架的光學(xué)顯微鏡觀察一、實驗?zāi)康恼莆占?xì)胞染色的基本過程及非切片法制片技術(shù)，了解細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)，學(xué)會制作永久封片。二、實驗原理當(dāng)用適當(dāng)濃度的TritonX-100處

4、理細(xì)胞時，因其非離子型表面活性劑的特性，可以除去可溶性蛋白質(zhì)和脂類，而微絲束屬不可溶性蛋白，就不會被TritonX-100破壞而保留在細(xì)胞中。當(dāng)用考馬斯亮藍(lán)R250染色時，在光學(xué)顯微鏡下通常能觀察到以核為中心的纖維狀骨架，在質(zhì)膜下還能見到絲狀骨架，骨架上常附著一些與膜運動、整合有尖的蛋白質(zhì)。考馬斯亮藍(lán)R250并不是特異地顯示微絲，但由于有些細(xì)胞骨架纖維如微管等在該實驗條件下不夠穩(wěn)定，又因有些類型的纖維太細(xì)而在光學(xué)顯微鏡下無法分辨，因此看到的是由微絲組成的纖維束，直徑約在40nm左右。三、實驗材料新鮮洋蔥鱗狀葉。四、實驗器材普通光學(xué)顯微鏡，50ml燒杯，滴管，試劑瓶，載玻片，蓋玻片，錫子，染色板

5、，吸水紙，擦鏡紙。五、實驗藥品1-M緩沖液：所含各成分終濃度為50mmol/L瞇口坐，50mmol/LKCL,0.5mmol/LMgCI2,Immol/LEGTA（乙二醇雙（a氨基乙基®四乙酸），0.1mmol/LEDTA，Immol/L疏基乙醇或二硫蘇糖醇vDTT）。Imol/LHCI調(diào)pH至J6.820.01mol/L磷酸緩沖液（pH6.8）用0.2mol/L磷酸氫二鈉一磷酸二氫鈉緩沖液稀釋配制其中磷酸鹽緩沖液配法：0.2mol/LNa2HPO449ml0.2mol/LNaH2PO45lml3.1%TrltonX-100,用M緩沖液配制。40.2%考馬斯亮藍(lán)R250。配制用的溶劑

6、為：甲醇：冰醋酸冰(46.5:7:46.5)。5 .3%戊二醛溶液，用9.01mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.8）配制6 .50%，70%，95%乙醇。7 叔丁醇.正丁醇9 .二甲苯。10 中性樹膠。六、實驗步驟1.撕取洋蔥鱗狀葉內(nèi)表皮約Icm大小，取若干片，置于裝有pH6.8磷酸鹽緩沖液的50ml燒杯中，用銀子輕按人使其浸沒5min。2吸去磷酸鹽緩沖液，用1%TritonX-100處理20-30min。3 .吸去TrironXi00液，用M緩沖液洗3次，每次10min左右。4 .用3%戊二醛固定0.5h。5 .再用磷酸鹽緩沖液洗3次，每次10min°6 .0.2%考馬斯亮藍(lán)R250

7、染色20-30min（在染色板上）。7 .用蒸館水洗1一2次，將樣品置于載玻片上，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，先低倍，再高倍，最后用油鏡。如觀察結(jié)果較佳，可制作永久封片：在有樣品的50ml燒杯中，依次用如下試劑處理：50%乙醇，70%乙醇，95%乙醇，（1/2）V95%乙醇+（1/2）V叔丁醇,叔丁醇（以上每個步驟反應(yīng)5-10min）或正丁醇，正丁醇，二甲苯，二甲苯（每個步驟5-10min）。然后，將樣品置于載玻片上展開，鏡檢后滴一滴中性樹脂，蓋上蓋玻片。葉綠體的分離與熒光觀察實驗?zāi)康恼莆帐止ぶ谱髅芏忍荻燃夹g(shù)，了解蔗糖密度梯度離心的原理及優(yōu)缺點實驗原理用兩種濃度的蔗糖溶液制成的梯度，在離心條件下，

8、葉綠體和比它沉降系數(shù)小的細(xì)胞組分聚集到梯度交界處，而沉降系數(shù)較大的細(xì)胞組分沉到離心管底部，這樣，可粗略地分離葉綠體。三、實驗材料新鮮菠菜葉四、實驗器材組織搗碎器，高速冷凍離心機，普通離心機，離心管，Corex離心管，燒杯，漏斗，紗布，載玻片，蓋玻片，普通光學(xué)顯微鏡，剪刀，滴管，熒光顯微鏡。五、實驗藥品加入約42 勻漿介質(zhì)（0.25mol/L蔗糖、0.05mol/LTris-HCi緩沖液,PH7.4）:稱取85.55g蔗糖，6.05gTris,溶解在近800ml蒸鐳水中,5ml0.lmol/LHCI,最后蒸館水定容至1000ml。50%蔗糖溶液，15%蔗糖溶液。0.35M氯化鈉，0.01%口丫喘

9、橙六、實驗步驟（一）葉綠體的密度離心1 .洗凈菠菜葉，盡可能使它干燥，去除葉柄、主脈后，稱取5g,剪碎。2 .加入預(yù)冷到近09的勻漿介質(zhì)10ml，在研缽內(nèi)低溫?fù)v碎。3搗碎液用雙層紗布過濾到燒杯中。4 .濾液移入普通玻璃離心管，在普通離心機上1000i7min離心。5 .在2ml離心管內(nèi)依次加入50%蔗糖溶液和15%蔗糖溶液，注意要用滴管吸取15%蔗糖液沿離心管壁緩緩注入，不能攪動50%蔗糖液面，50%蔗糖溶液加0.9ml,15%蔗糖溶液加0.5ml。加液完后，可見兩種溶液界面處折光稍有不同，這樣密度梯度就制好了。6 在制好的密度梯度上小心地沿離心管壁加入0.3ml上清液。7離心：000r/mi

10、n、20min °取出離心管，可見葉綠體在密度梯度液中間形成帶；用滴管輕輕吸出滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察。還可在暗室內(nèi)用熒光顯微鏡觀察。（二）菠菜葉手切片觀察用剃須刀將新鮮的嫩菠菜葉切削一斜面置于載片上，滴加1滴0.35mol/LNaCI溶液，加蓋片后輕壓，置顯微鏡下觀察，（1）在普通光鏡下觀察-（2）在熒光顯微鏡下觀察（3）用同樣方法制片，但滴加12滴001%11Y11定橙染液染色I(xiàn)min洗去余液，加蓋片后即可在熒光顯微鏡下觀察。七、實驗結(jié)果（一）葉綠體的分離和觀察1 普通光鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖形在高倍鏡下可看到葉綠體內(nèi)部含有較深的綠色小顆粒，即基粒。2 .以0

11、1ympus熒光顯微鏡為例，在選用B（blue）激發(fā)濾片、B雙向色鏡和0530阻斷濾片的條件下，葉綠體發(fā)出火紅色熒光。3 .加入口丫噪橙染色后，葉綠體可發(fā)出桔紅色熒光，而其中混有的細(xì)胞核則發(fā)綠色熒光。（二）菠菜葉手切片觀察1在普通光鏡下可以看到三種細(xì)胞（1）表皮細(xì)胞：為邊緣呈鋸齒形的鱗片狀細(xì)胞。（2）保衛(wèi)細(xì)胞：為構(gòu)成氣孔的成對存在的腎形細(xì)胞。（3）葉肉細(xì)胞：為排成柵狀的長形和橢園形細(xì)胞。葉綠體呈綠色橄欖形，在高倍鏡下帶可以看到綠色的基粒。2在熒光顯微鏡下，葉綠體發(fā)出火紅色熒光，但其熒光強度要比游離葉綠體弱。氣孔發(fā)綠色熒光，兩保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)的火紅色葉綠體側(cè)環(huán)繞氣孔排列成一圈。表皮細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)量要比

12、葉肉細(xì)胞少。3用口丫旋橙染色后，葉綠體則發(fā)出桔紅色熒光，細(xì)胞核可發(fā)綠色熒光，氣孔仍為綠色。細(xì)胞組分的分離一、實驗?zāi)康恼莆辗旨壏蛛x方法。二、實驗原理利用細(xì)胞內(nèi)各組分在一定介質(zhì)中的沉降速度的差異，可采取分級差速離心的方法，將各組分逐級分離出來。三、實驗材料小鼠（30克）取肝臟四、實驗器材同實驗七夕卜加eppendorf管、微量進(jìn)樣器、tip頭、臺式高速冷凍離心機。五、實驗藥品勻漿介質(zhì)。25mol/L蔗糖+0Olmol/LTris鹽酸緩沖液pH7.4）,乙醇：冰乙酸（3:1），生理鹽水，姬姆薩染液，中性紅一詹納斯綠染液（稱取0.04g中性紅、0.02g詹姆斯綠溶于100ml,0.25mol/L蔗糖溶

13、液中）。其中0.01mo/LTris鹽酸緩沖液配法：Olmol/L三疑甲基氨基甲烷(Tris)10ml，0.1mol/L 鹽酸.4ml加蒸館水至100ml。六、實驗步驟1低速離心分離細(xì)胞核將饑餓24小時的小白鼠放入容器中麻醉致死，立即剪開腹部，迅速取出肝組織浸入預(yù)冷的生理鹽水中洗去血污，用濾紙吸干。，（2）稱取0.5g肝組織，放在小燒杯中剪碎，用少量預(yù)冷的勻漿介質(zhì)洗滌數(shù)次。（3）將燒杯內(nèi)懸浮組織倒入玻璃勻漿器中進(jìn)行冰浴勻漿。用4層紗布（先用少量勻漿介質(zhì)濕潤）過濾勻漿液至Corex離心管中，同時制備I張濾液涂片，做好標(biāo)記，自然干燥。4漓心機上500r/min離心5min（4七）5將上層溶液吸入2

14、支eppendof管中，蓋緊蓋子放在有冰塊的器皿內(nèi)，待分離線粒體時用。沉淀物作進(jìn)一步處理。(5)用5ml勻漿介質(zhì)懸浮離心下的沉淀物，用吸管混勻，以1000r/min離心10min(4t),吸去上清液，用吸管吸出少量沉淀物上層涂片。剩余的沉淀物加入0.3-0.5ml勻漿介質(zhì)，用吸管吹打成懸液，再制備一張涂片做好標(biāo)記，自然干燥。2.高速離心分離線粒體(1)將步驟I中的eppendof管在臺式高速冷凍離心機上以10000r7min離心5min,緩緩吸出上清液至另2eppendorf管，留取沉淀物冰浴保存，待涂片鑒定。(2)另2支上清液在臺式高速冷凍離心機上以13000r/min離心5min。(3)吸

15、去上清液，沉淀物置冰浴中，待制片鑒定時用。3分離物的鑒定(1)細(xì)胞核。將步驟I中得到的涂片浸入乙醇一冰醋酸中固定15min,吹干，滴姬姆薩染液(原液用1/15mol磷酸緩沖液稀釋10-20倍)染色10min自來水沖洗，吹干，在高倍鏡下比較觀察涂片。(2)線粒體。在2張干凈載玻片中央各滴2-3滴中性紅一詹納斯綠染液，取步驟2高速離心得到兩份沉淀物分別均勻地涂布在玻片上，染色30min后分別蓋上蓋玻片，在高倍鏡下觀察。附：更精致的分離方案將45ml0.34moi/L蔗糖溶液放入離心管，然后沿壁小心地加入4.5ml鼠肝勻漿使覆蓋于上層。用高速冷凍離心機以700xg離心10min,得上清液I和沉淀物。

16、沉淀物用1。0110.2501。1/1.蔗糖溶液洗2次，每次10。6<9離心10min,得到的沉淀物可進(jìn)行以下處理。(1)收集質(zhì)膜：吸出沉淀中較疏松的上層，混懸于比重為1.16的蔗糖溶液中，沿管壁小心加入已放在離心管中的比重1.1的蔗糖溶液的上層，經(jīng)700xg離心10min，質(zhì)膜最終集中在兩溶液界面匕，吸出質(zhì)膜層。(2)細(xì)胞核純化：將沉淀用5倍體積的0.34mol/L蔗糖0.5mol/LMg(Ac)2溶液混懸，鋪在4倍于核懸液體積的0.mOV/L蔗糖0.5mol/L Mg(Ac)2 溶液之上，1500xg 離心20min，沉淀物即為純化的細(xì)胞核。分離核仁：純化的細(xì)胞核混懸在2倍體積的0.

17、34mol/L蔗糖一0.5mol/LMg(Ac)2溶液中，超聲波破核膜，釋放出核仁，注意蔗糖介質(zhì)pH中性或弱堿性時核膜才易破碎，超聲后的懸液鋪于4倍體積的0.mol/L 蔗糖一 0 5mol /LMg(Ac) 2 溶液之上，1700xg離心17min。沉淀物即為核仁溶液為上清液將上清液I10OOOxg離心lOmin得上清液II和沉淀物，沉淀物以Qml預(yù)冷的0.25mol/L蔗糖溶液洗2次，每次10OOOxg離心10min得沉淀物即為純化的線粒體。上清液H經(jīng)16300xg離心20min得上清液HI和沉淀物，沉淀物以Qml預(yù)冷的0.25m01/L蔗糖溶液洗；16300xg離心20min，得沉淀物即

18、為純化的溶酶體。上清液皿經(jīng)lOOOOOXg離J30min，得沉淀物（為微粒體）和上清液IV，后者再經(jīng)離心150000xg3h左右可獲得核糖體、病毒、生物大分子等。四膜蟲纖毛的再生一、背景和原理纖毛和鞭毛是細(xì)胞表面的特化結(jié)構(gòu)，具有運動功能。纖毛和鞭毛的結(jié)構(gòu)基本相同。纖毛軸心含有一束“9+2”排列的平行微管，中央微管均為完全微管，外圍二聯(lián)體微管由A，B亞纖維組成，A亞纖維為完全微管，由13個球形亞基環(huán)繞而成，B亞纖維僅由10個亞基構(gòu)成，另3個亞基與A亞纖維共用（圖9-16）。微管是由微管蛋白組成的管狀結(jié)構(gòu)，對低溫、高壓和秋水仙素敏感。大多數(shù)微管纖維處于動態(tài)的組裝和去組裝狀態(tài)，這是實現(xiàn)其功能所必需的

19、過程。本實驗以Rosenbaum和Carlson（1969）的實驗為基礎(chǔ)，在降低pH和鈣離子存在的條件下通過機械修剪的方法，在膜水平脫去四膜蟲的纖毛，剩下腫脹的，不能運動的細(xì)胞。在不同的生長溫度（25P和17）下觀察纖毛的再生率，并且在不同的抑制物的作用下研究微管亞單位的合成和組裝。二、實驗?zāi)康?使用相差顯微鏡和血球計數(shù)器;2了解微管組裝的基本原理三、教學(xué)安排學(xué)時數(shù)：3-4小時。四、實驗儀器、器材與試劑parafilm1材料：梨形四膜蟲。2儀器：錐形瓶，相差顯微鏡，血細(xì)胞計數(shù)器，臺式離心機，滴管，注射器，EDTA '醋酸鈉，氯化鈣。膜，載玻片，蓋玻片，定時器。3試劑：蛋白陳，亞胺環(huán)己酮

20、，新霉素，秋水仙堿，五、實驗方法與步驟1、分別將250毫升含1%蛋白腺四膜蟲培養(yǎng)物置于500毫升錐形瓶中于25七和17P培養(yǎng)。（時間）2、兩瓶培養(yǎng)物分別800g離心10分鐘，重新懸浮于15毫升1%蛋白豚溶液，置于50毫升錐形瓶，做好標(biāo)記。3、準(zhǔn)備2個50毫升錐形瓶，各加入15毫升1%蛋白陳溶液；3個100毫升錐形瓶，含20毫升1 %蛋白陳溶液，分別加入1。微克/升亞胺環(huán)己酮；50微克/升亞新霉素；加入2毫克/升秋水仙堿。4、以下操作在冰浴上進(jìn)行：1）在零時間，用一個大試管在冰浴上將2.5毫升濃縮的四膜蟲懸液（生長于250c）加至5毫升介質(zhì)A（10mMEDT.A2Na;50mM醋酸鈉；pH6.0

21、）中，攪拌混勻。2 ）30秒后加入2.5毫升預(yù)冷的蒸館水。3 ）1分鐘后加入0.25毫升預(yù)冷的0.2McaCI2,parafilm膜封口，倒轉(zhuǎn)試管使之混合。4 ）2分鐘后用裝有19號針頭的注射器吸取懸液并注入預(yù)冷的試管中（修剪掉四膜蟲的纖毛）。迅速用滴灌取少量懸液，滴加在載玻片上鏡檢，觀察其是否失去運動性。5 ）去纖毛后，立即把1毫升去纖毛的細(xì)胞加至20毫升1%蛋白陳溶液，25預(yù)熱的100毫升錐形瓶中，于25七培養(yǎng)并開始實驗。5、每隔10分鐘取出定量的樣品，對其隨時間變化的能動性（motility）%進(jìn)行分析。由于脫纖毛的細(xì)胞不能運動，切記在取樣前振蕩錐形瓶。在血細(xì)胞計數(shù)器上觀察，估計運動細(xì)胞

22、和非運動細(xì)胞的數(shù)目。制備快速標(biāo)本，在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞是否腫脹，有無新生纖毛等情況。6、同時對生長于17七的四膜蟲進(jìn)行脫纖毛，并同在25七的四膜蟲的纖毛再生時間比7、從生長于25C的四膜蟲懸液制備新鮮脫纖毛的細(xì)胞，在分別加入亞胺環(huán)己酮，新霉素，秋水仙堿和空白對照的含20毫升的1%蛋白腺溶液100毫升錐形瓶中各加入1毫升脫纖毛細(xì)胞。每隔10分鐘分別從瓶中取樣，觀察其反應(yīng)是否發(fā)生改變。8、從生長于17的四膜蟲懸液制備新鮮脫纖毛的細(xì)胞，在分別加入亞胺環(huán)己酮，新霉素，秋水仙堿和空白對照的含20毫升的1%蛋白豚溶液100毫升錐形瓶中各加入1毫升脫纖毛細(xì)胞。每隔10分鐘分別從瓶中取樣，觀察其反應(yīng)是否發(fā)生

23、改變。9、從生長于25的濃縮四膜蟲懸液制備一些新鮮的脫纖毛細(xì)胞。對下列各個瓶中分別加入1ml脫纖毛細(xì)胞：(i)蛋白陳+10pg/ml亞胺環(huán)己酮(ii)蛋白陳+50ng/ml新霉素(iii)蛋白陳+2mg/ml秋水仙堿(iv)只含蛋白腺作為對照每隔1。分鐘從瓶中取樣。讓實驗進(jìn)行盡可能長的時間，以便觀察其反應(yīng)是否發(fā)生改變。記錄結(jié)果實驗結(jié)果以能動性()對時間(min)作圖表示：(1)生長于250c和17七的四膜蟲；(2)抑制物對纖毛再生的效應(yīng)。討論作為這一實驗的引伸，還可以應(yīng)用更多的抑制物來表明，是否需要生成新的信息性分子，細(xì)胞周期中的不同時相是否起重要作用？對抑制物的觀察可以時可逆的，因為經(jīng)過一個

24、時間階段后，細(xì)胞可以克服由于秋水仙堿引起的組裝阻斷。這些實驗著眼于纖毛的再生系統(tǒng)，在這些系統(tǒng)中很容易辨認(rèn)出重點。這些實驗還為諸如纖毛和鞭毛等微管結(jié)構(gòu)的合成和組裝提供資料。六、實驗提示與注意事項1 .梨形四膜蟲的純培養(yǎng)可培養(yǎng)于1%蛋白陳（1%蛋白腺；025%酵母浸膏），培養(yǎng)液用15磅/時2高壓滅菌15分鐘。在接種培養(yǎng)物和整個培養(yǎng)過程中需用無菌技術(shù)，但在課堂實驗時無需應(yīng)用無菌采樣技術(shù)。為了獲得實驗所需數(shù)量的培養(yǎng)物，含250ml蛋白腺的500ml錐形瓶在25可培養(yǎng)12天，而在17°C需23天。這一體積的培養(yǎng)物可用來接種25瓶新的250ml培養(yǎng)物。2 生長的溫度很重要；如果四膜蟲沒有在25生

25、長至少6天的話，則再生速率顯著延緩。因此，對兩種不同生長溫度的比較，形成了本實驗中一部分的基礎(chǔ)。3.四膜蟲的離心必須小心，因為在減速時細(xì)胞容易被漩渦卷起。如果參加實驗的學(xué)生較多，或沒有經(jīng)驗，最好在實驗時由一位技術(shù)員來離心細(xì)胞。通常800g即可，但也可用1000g。七、思考題纖毛再生所需的時間，是包括微管蛋白的合成和組裝在內(nèi)的許多過程決定的。培養(yǎng)物原先生長的溫度為什么能影響纖毛再生率？通過抑制物的實驗結(jié)果，我們能否確定在實驗過程中，纖毛再生取決于現(xiàn)存前體庫的大小和新蛋白質(zhì)合成的程度？在較低級的真核細(xì)胞中我們能學(xué)到什么有矢蛋白質(zhì)合成的知識？八、推薦閱讀Rosenbaum,J.L.andCarlso

26、n,K-1968CiliaRegenerationinTetrahymenaanditsInhibitionbyColchicine,J.cellBiol.,40,415Rosenbaum,JL,Moulder,J.E.andRingo,D1969FlagellarElongationandRosenbaum,J.L.andChild,F.M1967FlagellarRegenerationinProtozoanFlagellates,J.CellBiol.,34,345ShorteninginChlamydomona,sJ.CellBiol,41,600植物愈傷組織誘發(fā)培養(yǎng)一、實驗?zāi)康恼莆諢o

27、菌操作進(jìn)行愈傷組織誘發(fā)培養(yǎng)的方法。二、實驗原理植物組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)是進(jìn)行植物細(xì)胞工程的基礎(chǔ)工作。一般認(rèn)為，分化了的植物根、莖、葉細(xì)胞具有全能性，在一定條件下進(jìn)行離體培養(yǎng)，給予合適的營養(yǎng)條件和激素水平，可以脫分化為愈傷組織。利用愈傷組織可以進(jìn)行一些生物化學(xué)、發(fā)育學(xué)、遺傳學(xué)等方面的研究工作，例如愈傷組織能進(jìn)一步誘導(dǎo)分化成完整的植株，還可以將愈傷組織進(jìn)行單細(xì)胞分離，做懸浮培養(yǎng)，篩選各種生化突變型。三、實驗材料煙草或迎春花莖段四、實驗器材培養(yǎng)皿，燒杯，霆子，剪刀，小三角燒瓶，大三角燒瓶，酒精燈，酒精棉花，滴管，試劑瓶，濾紙，錫箔紙，超凈工作臺，植物細(xì)胞培養(yǎng)室。五：實驗藥品MS固體培養(yǎng)基（見附錄，力0

28、 0%瓊脂）:培養(yǎng)基中加生長素2.4- D，為脫分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中加細(xì)胞分裂素6-BA和生長素NAA,為分化培養(yǎng)基，和其它成分相同。70%乙醇，漂白粉溶液（1片漂白粉片/加300ml水），無菌水。六：實驗步驟1培養(yǎng)基的配制：MS固體培養(yǎng)基滅菌后稍冷，倒入無菌培養(yǎng)皿分裝，或者直接配在三角瓶中，瓶口用二層牛皮紙蓋上用繩扎緊，滅菌后待用。2-迎春花枝條，去葉，用水洗莖。洗干凈后剪取5cm長的枝條3段，投入70%乙醇中浸泡30秒。再轉(zhuǎn)入漂白粉溶液，消毒Imin。3移入超凈臺，按無菌操作要求將莖段取出置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用無菌水反復(fù)沖洗。再用無菌錫子移入另一培養(yǎng)皿內(nèi)，再用無菌水反復(fù)沖洗。4將莖段剪小，每

29、段約Icm長，放入脫分化培養(yǎng)基，每皿6-7段，均勻分散在培養(yǎng)皿中，26暗培養(yǎng)34天，觀察有無染菌。5挑取無污染莖段，轉(zhuǎn)接入新的脫分化培養(yǎng)基，繼續(xù)暗培養(yǎng)7天，可觀察到愈傷組織開始生長。6如果以無菌煙草為材料，可跳過2、3兩步，省去消毒、漂洗過程。直接進(jìn)入第5步。取煙草葉片進(jìn)培養(yǎng)。培養(yǎng)7天檢查有無染菌，如有污染再轉(zhuǎn)接一次，繼續(xù)暗培養(yǎng)7天，在這階段可以看到葉片細(xì)胞脫分化產(chǎn)生愈傷組織。7將煙草愈傷組織轉(zhuǎn)接到細(xì)胞分化培養(yǎng)基，照光培養(yǎng)2-3周，可以觀察到細(xì)胞分化產(chǎn)生新的苗。鼠腎細(xì)胞原代培養(yǎng)一、實驗?zāi)康牧私饧?xì)胞原代培養(yǎng)的原理和方法，學(xué)習(xí)細(xì)胞消化、細(xì)胞計數(shù)、營養(yǎng)液的配制等操作技術(shù)，觀察原代細(xì)胞的形態(tài)。二、實驗

30、原理原代細(xì)胞培養(yǎng)是指直接從動物體內(nèi)獲取的器官組織，經(jīng)消化，培養(yǎng)成為單個細(xì)胞的過程。用胰蛋白酶對組織進(jìn)行消化獲得單細(xì)胞懸液，由細(xì)胞懸液定量接種后獲得原代細(xì)胞培養(yǎng)物。胰蛋白酶的作用是消化除去細(xì)胞間質(zhì)，蛋白酶液中可添加膠原酶以增加消化能力。細(xì)胞培養(yǎng)是探索細(xì)胞生命活動規(guī)律一種基本的、十分有效的實驗技術(shù)，通過細(xì)胞培養(yǎng)可以進(jìn)行細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，細(xì)胞的生長發(fā)育等等各項研究，目前已廣泛地被應(yīng)用于生物學(xué)的各個領(lǐng)域。三、實驗材料出生后一周左右的乳鼠。四、實驗器材細(xì)胞培養(yǎng)箱，離心機，超凈工作臺。細(xì)胞培養(yǎng)皿，滴管，血球計數(shù)板，吸液器，眼科剪刀，錫子，小離心管。五、實驗藥品RPMI640培養(yǎng)液，小牛血清，青霉素，鏈霉素，02

31、5%胰蛋白酶和0,1%膠原酶75%乙醇，碘酒，乙蘸，PBS，EDTA。六，實驗步驟：1 .按無菌操作技術(shù)，消毒超凈工作臺及雙手。2 用乙gg麻醉法處死小鼠：將乙蘸棉球放進(jìn)燒杯中，然后放入小鼠，蓋住杯口片亥IJ等小鼠死亡。3 .碘酒消毒腹部皮膚。4 .75%酒精脫碘2次，然后進(jìn)入超凈工作臺操作。5 .用酒精消毒雙手及臺面。6 .用第一副眼科鑲及眼科剪“工”字型剪開皮膚。7 .用第二副眼科剪，剪開拉開腹膜。8 推開腸管，在腹后壁找到腎臟，并剪取全腎。將剪刀放入75%酒精中浸泡，待用。9 .置腎臟于滅菌的盛有PBS滅菌液的培養(yǎng)皿。（直徑60mm）中洗兩次。夾取腎組織，移至滅菌15ml離心管內(nèi)，將剪刀

32、在無菌PBS中洗一下，剪碎腎組織，越碎效果越好。10 .加入025%胰蛋白酶+1%膠原酶Iml,混合均勻。11 .37作用15分鐘，每五分鐘輕輕彈擊。12 .無菌滴管輕輕吹打已消化組織20次，注意避免液體外溢。13 .1000RPM，離心1分鐘，沉淀未消化的組織塊和殘渣。14 .吸取含有離散細(xì)胞的上清液至另一個管內(nèi)。15 .3000RPM離心2分鐘，收集離散細(xì)胞。16棄去上清液，加入完全培養(yǎng)液Iml，吹打均勻。17 吸取加入細(xì)胞計數(shù)板中，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。要求數(shù)四個角的16個小格中細(xì)胞數(shù)的總和。然后按照以下公式計算細(xì)胞密度。總計數(shù)結(jié)果*1000*稀釋倍數(shù)二細(xì)胞個數(shù)/mL4按細(xì)胞/ml，吸取Iml細(xì)

33、胞加Iml培養(yǎng)液，接種到35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中。19.輕輕混勻細(xì)胞，置培養(yǎng)皿于379，5%的C02培養(yǎng)箱中，第二天觀察，換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，第四天觀察結(jié)果。哺乳動物貼壁細(xì)胞的傳代培養(yǎng)一、實驗?zāi)康牧私獠溉轭悇游镫x體貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)條件；掌握貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的傳代技術(shù)；觀察傳代細(xì)胞貼壁、生長和繁殖過程中細(xì)胞形態(tài)變化和形成單層；掌握細(xì)胞培養(yǎng)中一些常用培養(yǎng)基、緩沖液、消化液、抗生素、完全培養(yǎng)液的配制方法及各種無菌消毒方法；掌握細(xì)胞計數(shù)方法。二、實驗原理要使細(xì)胞能在離體條件下存活并代代相傳，必須在體外人工模擬一個類似于體內(nèi)的環(huán)境。所要求的這個環(huán)境呈液態(tài)，它包含有細(xì)胞賴以生存的基本培養(yǎng)基、一定的滲透壓和氫離子濃度

34、（即pH）,要有足夠的空間，能在恒溫恒壓和無菌的條件下以滿足細(xì)胞群體增殖和代謝的需要。離體貼壁培養(yǎng)細(xì)胞當(dāng)群體增殖匯合形成單層細(xì)胞群體達(dá)到飽和密度時，必須進(jìn)行傳代。傳代過程是通過胰蛋白酶消化將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶（皿）上脫落并分散成單細(xì)胞，經(jīng)過稀釋（或不經(jīng)稀釋）從一個容器上轉(zhuǎn)移到另一個容器并給予新鮮培養(yǎng)液進(jìn)行再培養(yǎng)。這種傳代過程稱為傳代培養(yǎng)。三、實驗材料貼壁培養(yǎng)細(xì)胞株(系)、CHO、Hela、L929、或其他細(xì)胞瓶。四、實驗器材設(shè)備：細(xì)胞培養(yǎng)箱，電熱恒溫干燥箱，高壓消毒鍋，水浴鍋，離心機，冰箱，無菌室或超凈工作臺。器具：培養(yǎng)瓶(皿)3-6只，離心管2只，試管2只，滴管，5ml、10ml,移液管各若干支，

35、血球計數(shù)板1塊，污物缸，橡皮塞，吸液器，pH試紙，消毒藥棉等高壓或高溫滅菌備用。五、實驗藥品RPMI1640培養(yǎng)基，5%NaHCO3,小牛血清，青霉素，鏈霉素，谷氨酰胺，0.25%胰蛋白酶液，0.1%EDTA-Na2液,75%乙醇，HCI，臺酚藍(lán)染色液(NaCI,KCI,Na2HPO4,KH2PO40六、實驗步驟I-洗凈雙手，入無菌室緩沖間穿戴工作服、鞋、帽、口罩后進(jìn)入無菌室。2點燃煤氣(或酒精)燈，用75%乙醇棉球抹拭雙手、操作臺表面、各種試劑瓶口。3.配制有尖溶液(1)RPMII640培養(yǎng)液：1640粉劑一袋(10.4g)+1升milice水+谷氨酰胺0.3g+NaHCO32g,混勻后逐滴

36、加入0.5ml濃HCI到pH6.8,過濾滅菌，分裝，-209保存。臨用時加10%小牛血清和兩種抗菌素溶液；最終濃度分別為100單位/毫升。(2)小牛血清滅活：小牛血清溶解后放置56P，30min，然后分裝小瓶，2(rc保存。(3)兩種抗菌素(雙抗)溶液：取青霉素80萬單位和鏈霉素80萬單位，溶于0ml無菌水中，配成每毫升1萬單位溶液,4保存。(4) PBS溶液：NaCI4g,KCIO.lg,NazHPCU(無水)0.57g或(12H2O)1.43g,KFkPCUO.Ig,雙蒸水500mlpH7.2,10磅20分鐘滅菌，49保存。(5) 0.1%EDTA:lOOmgEDTA+100mlPBS（6

37、）胰蛋白酶溶液：50mg胰蛋白酶+lOOmIPBS（7）胰酶消化液：溶液+（6），得到200ml溶液過濾滅菌。細(xì)胞培養(yǎng)液：45ml1640培養(yǎng)液+5ml小牛血清+0.5E雙抗。4消化細(xì)胞取接種3-5天形成單層的細(xì)胞株，使細(xì)胞面朝上，將培養(yǎng)液用吸管吸去，用1-2滴管PBS洗1-2次，加入2滴管消化液。消化1-2min，待細(xì)胞單層上出現(xiàn)透明針尖小孔隙時（此時鏡檢可見成片層的細(xì)胞固縮成圓形，細(xì)胞與細(xì)胞之間相互接觸松散或互不接觸），使細(xì)胞面朝上，輕輕吸去消化液，丟入廢物缸，然后加入2滴管完全培養(yǎng)液，吸打細(xì)胞使其成細(xì)胞懸液。如果消化過頭而細(xì)胞已自行脫落時，可加少量血清或完全培養(yǎng)液以中止消化。滴管吸打均勻

38、使成細(xì)胞懸液并轉(zhuǎn)移至離心管離心（1000r，3-5min）后用完全培養(yǎng)液再懸浮。5 .細(xì)胞接種取小型細(xì)胞培養(yǎng)瓶1只，然后加入5ml左右培養(yǎng)液，再將上述細(xì)胞懸液等量（1：3或1：4）或不等量（根據(jù)實驗需要）接種人內(nèi)，打勻、平置、編號，37培養(yǎng)，隔天觀察結(jié)果。6 .細(xì)胞計數(shù)胰酶徹底消化細(xì)胞，用4.5ml細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞后轉(zhuǎn)移到試管中，加0.5ml臺酚藍(lán)染色液，滴管吸打細(xì)胞懸液使均勻，吸取細(xì)胞懸液（要充滿滴管，不能有氣泡）沿細(xì)胞計數(shù)板血蓋片邊沿輕輕滴入計數(shù)板（不能有氣泡、空隙，也不能使其外溢以免定量有誤），在光學(xué)顯微鏡（10X10）下計數(shù)按圖中四角大方格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)，按公式計算如下4大格細(xì)胞總數(shù)*1

39、044求出每ml平均細(xì)胞數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)為該瓶細(xì)胞總數(shù)。附錄二細(xì)胞培養(yǎng)用液-1平衡鹽液(1)Hank液原液：取NaCI80.0g，Na2HPO4.2H2O0.6g,KCI4.0g,KH2PO40.6g,MgSO4.7H2O2.0g，葡萄糖10.0g，無水CaCI21.4g，加水至1000ml。配制:取Hank原液100ml,加蒸鐳水896ml，加0.5%酚紅4ml，混勻。分裝,包扎,0.0552MPa(8psi)/30min或-.0689MPa臨用前，力口NaHCO3液調(diào)pH至7.2。(2)D-Hank液NaCI8.0g、KCI0.4g,Na2HPO4.12H2O0.12g，KH2P040.06g，葡萄糖10g,酚紅(1%)2ml,力口三蒸水至1000ml。09689MPa(10psi)/10min滅菌，冷卻后置4P冰箱保存。(3)Earle液原液A:取NaCI68.0g、KCI4.0g,NaH2PO4.H2OI.4g,葡萄糖10.Og5力口水至500ml。原液B:取CaCk2.0g,MgSO4-7H