中藥復蘇飲對嚴重膿毒癥患者外周血單核細胞TLR2TLR4基因表達的影響

1、中藥復蘇飲對嚴重膿毒癥患者外周血單核細胞TLR2、TLR4基因表達的影響 【摘要】觀察中藥復蘇飲對嚴重膿毒癥患者外周血單核細胞TLR2、TLR4基因表達的影響?！痉椒ā繉⒗颊唠S機分為復蘇飲組（治療組）和安慰劑組（對照組）各例，兩組均采用西醫(yī)常規(guī)監(jiān)護治療，治療組配合使用中藥復蘇飲（由工人牛黃、西洋參、黃芪、生大黃、生石膏、麥冬、丹參、赤芍、猴棗等組成），而對照組則加用安慰劑。另選取名健康體檢者作為正常組。采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR)法測定治療前及治療第、第天外周血單核細胞TLR2、TLR4mRNA表達的變化?！窘Y果】治療前兩組患者單核細胞TLR2、TLR4mRNA表達顯著低于正常組

2、（.)。對照組于治療第天TLR2、TLR4mRNA表達開始明顯升高（.1);治療組于治療第天TLR2、TLR4mRNA表達即明顯回升，且治療后各個觀察點的基因表達明顯高于對照組（.);但兩組的、mRNA表達均未達到正常組水平（.或.1）?！窘Y論】中藥復蘇飲可明顯上調外周血單核細胞TLR4、TLR2mRNA的表達，降低嚴重膿毒癥患者的病死率。 【關鍵詞】膿毒癥中藥療法復蘇飲治療應用Toll樣受體 膿毒癥是一種全身感染性疾病。以往研究認為，多種病原微生物的細胞壁成分如革蘭陰性菌的內毒素（LPS），革蘭陽性菌的肽聚糖（PGN)和脂磷壁酸（LTA)等均可通過與細胞表面的蛋白質受體CD14結合，誘導全身

3、炎癥反應，從而導致膿毒癥休克甚至多臟器功能衰竭綜合征（）。然而，由于CD14本身是一種膜錨蛋白（缺乏跨膜區(qū)和胞內區(qū)），不能直接向細胞內傳導信號，新近研究發(fā)現，Toll樣受體（Tolllikereceptors,TLRs)可能是跨膜信號轉導的門戶蛋白。 目前，已克隆的人類的TLRs成員有個（即TLR110)，其中TLR2和TLR4的作用尤為顯著。TLRs如同天然免疫的眼睛，監(jiān)視與識別各種不同的病原特異性分子模式（pathogenspecificmolecularpatterns,PAMPs)，激活B信號通路，啟動一系列免疫炎癥反應，最終達到清除入侵的病原微生物的目的，在天然免疫中發(fā)揮重要的抗感染

4、免疫功能。因此，以TLRs信號受體為靶向，可能為膿毒癥的防治帶來新的希望。本文通過觀察中藥復蘇飲對嚴重膿毒癥患者外周血單核細胞TLR2、TLR4基因表達的影響，從受體角度初步探討中藥在抗感染免疫中的作用?，F將結果報道如下。 1資料與方法 1.1臨床資料 1.1.1病例選擇及分組所選病例為年月至年月廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院ICU收治的嚴重膿毒癥的患者，確診h內被納入研究。但需除外以下情況：年齡小于歲;妊娠及哺乳期婦女;前個月內接受化療者;目前或前個月內接受皮質激素或其他免疫抑制劑、免疫調節(jié)劑治療者;有免疫系統(tǒng)疾病者;人類免疫缺陷病毒（HIV）陽性者;終末期肝功能或腎功能衰竭者;入院4h內死亡者

5、。符合納入標準的患者共例，在取得患者或家屬知情同意后被納入研究，其中例因經濟原因自動出院而被剔除，最終入選患者共例。 入選患者依據隨機數字表法分為西醫(yī)常規(guī)治療加復蘇飲組（治療組）和西醫(yī)常規(guī)治療加安慰劑組（對照組）各例。治療組男例，女例;年齡最小歲，最大歲，平均（.±4.8）歲;對照組男例，女例;年齡最小歲，最大歲，平均（.±.）歲;APACHE評分：治療組為（.±.）分，對照組為（.±.）分。同期在健康體檢者中隨機抽取名自愿者作為正常對照組（正常組），其中男例，女例;年齡最小歲，最大歲，平均（.±.）歲。組在年齡、性別方面均無顯著性差異（.)，

6、且治療組和對照組的APACHE評分亦無顯著性差異（.),具有可比性。 1.診斷標準按照年國際膿毒癥定義會議提出的膿毒癥及嚴重膿毒癥的診斷標準。 1.2治療方法 所有入選患者均給予重癥監(jiān)護、抗炎、營養(yǎng)支持、維持血流動力學穩(wěn)定、呼吸機輔助呼吸等西醫(yī)常規(guī)治療。治療組在西醫(yī)常規(guī)治療基礎上加用中藥復蘇飲（廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑室提供，由人工牛黃、西洋參、黃芪、生大黃、生石膏、麥冬、丹參、赤芍、猴棗等組成，諸藥研末分裝膠囊，0.4g/粒），品服或涼開水化開后鼻飼，每日3次。均給對照組在西醫(yī)常規(guī)治療基礎上加用安慰劑（廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑室提供，由淀粉色素制成，大小、顏色和外包裝與復蘇飲完全

7、一致），用法同復蘇飲。兩組均以治療天為個療程，以天計算患者總病死率。 1.3實驗方法 所有患者被納入研究時（治療前）、治療第天、第天各取外周靜脈血mL用于單核細胞TLR2、TLR4mRNA表達的檢測。所有病例在被納入研究期間內留取血液、痰液、尿液等標本用于細菌學檢查。 1.3.1單核細胞的分離患者于被納入研究時（治療前）、治療第天、第天分別取肝素抗凝靜脈血mL，與等量Hanks液充分混勻，用淋巴細胞分離液密度梯度離心法收集單個核細胞，然后用RPMT1640(美國Gibco公司）重懸細胞，置塑料培養(yǎng)瓶中，于，體積分數為CO2孵箱中溫育h，所得貼壁細胞即為單核細胞，經苔盼藍染色證實活細胞超過，Gi

8、emsa染色證實其純度大于。 1.3.2TLR2、TLR4mRNA的檢測按照RNA提取試劑盒（大連寶生物有限公司）說明書抽提單核細胞總RNA。用紫外分光光度儀（UV1206,澳大利亞SHIUADIV公司）測量其純度和含量，RNA經電泳證實s亞基為s亞基的兩倍，且/1.8。取RNA樣本g，采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RTPCR)檢測TLR2、TLR4mRNA的表達，Bactin的擴增作為內參照用，引物由華南理工大學科學與生物工程學院設計、上海博亞生物工程有限公司合成，見表。擴增產物取每個反表1PCR引物序列組別合計感染來源肺部腹腔內泌尿道其他病原菌培養(yǎng)結果單純G-單純G+混合陰性治療組（）對照組（

9、）統(tǒng)計方法：單因素方差分析(OnewayANOVA);：.，：.1,與治療前比較(vspreTinthesamegroup);:.,:.1,與對照組同期比較(vsgroupB);:.,:.1，與正常組比較(vsgroupC) 應體系L，于的瓊脂糖凝膠中電泳，電泳結果在凝膠成像分析系統(tǒng)中分析泳帶的平均密度面積值，用此值表示相應基因的表達強度。 1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行數據的統(tǒng)計分析。 2結果 2.1兩組患者的感染來源及病原菌培養(yǎng) 結果見表。 2.2兩組d病死率的比較 治療組患者死亡例，存活例，病死率為;對照組患者死亡例，存活例，病死率為。兩組比較，治療組的病死率明顯低于

10、對照組（.)。 2.2兩組患者外周血單核細胞TLR2、TLR4mRNA表達的比較 表結果顯示，治療前（被納入觀察時）兩組患者單核細胞TLR2、TLR4mRNA表達顯著低于正常組（.1),而兩組患者間無顯著性差異（.)。治療第天治療組TLR2、TLR4mRNA表達明顯回升，與治療前比較有顯著性差異（.);對照組TLR2、TLR4mRNA表達有恢復趨勢，但變化不明顯（.);兩組比較，差異有顯著性意義（.）。治療第天治療組TLR2、TLR4mRNA表達繼續(xù)回升，但仍低于正常組水平（.);對照組TLR2、TLR4mRNA表達明顯回升，與治療前比較，差異有顯著性意義（.1)，但上升水平不及治療組（.)。

11、 3討論 Toll樣受體（Tolllikereceptors,TLRs)是一種模式識別受體，在先天免疫中發(fā)揮主導作用。天然免疫的細胞，如單核細胞、中性粒細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、自然殺傷細胞（細胞）等，都不同程度地表達TLRs。 病原體入侵時，TLRs被相應的病原體相關分子模式（pathogenspecificmolecularpatterns,PAMPs)所激活，除了通過刺激天然免疫細胞分泌大量的細胞因子、趨化因子誘導炎癥反應外，還可直接增強天然免疫系統(tǒng)對病原微生物的清除能力。一方面，TLRs增強吞噬細胞的吞噬能力，如TLRs激活后中性粒細胞、巨噬細胞的吞噬能力明顯增強-，相反的抑制

12、TLRs信號通路，吞噬功能降低。體內外觀察結果顯示，在TLR2或TLR4的基因上即使出現個堿基的突變，都會導致宿主對革蘭陽性菌或革蘭陰性菌的反應能力嚴重喪失-。因此，TLRs作為識別細菌共有成分的"模式"識別受體，在膿毒癥的發(fā)生與發(fā)展中可能居核心地位。 本研究結果顯示，嚴重膿毒癥患者TLR4、TLR2mRNA表達明顯低于正常水平，其結果可能使機體陷入無變應性（anergic)狀態(tài)，無法及時清除或殺滅病原菌，這種狀態(tài)類似于中醫(yī)學所說的"正虛邪盛"?，F有的證據表明，許多中藥可通過多種途徑或環(huán)節(jié)提高機體抗感染免疫力，如扶正中藥可增強網狀內皮系統(tǒng)（）的功能，加速

13、體內多種致病異物（包括內毒素）的清除，以保持機體內環(huán)境的相對恒定;清解藥能增強單核-吞噬細胞系統(tǒng)（）及T細胞功能，同時使體液免疫系統(tǒng)抗體增強，從而增強機體清除病毒和外毒素的能力，并能增強腎上腺皮質功能，對于非特異性炎癥呈現抗炎作用，但以TLR為靶點開展中藥抗感染作用的研究目前尚處于起步階段。 中藥復蘇飲主要由人工牛黃、西洋參、黃芪、生大黃、生石膏、麥冬、丹參、赤芍、猴棗等組成，具有益氣養(yǎng)陰、清熱解毒、涼血活血、通里攻下之功。實驗結果證實，治療組（即復蘇飲組）單核細胞TLR4、TLR2mRNA表達回升速度較快，與此相對應，該組的病死率亦較對照組（安慰劑組）明顯降低，這可能與中藥通過調節(jié)TLR活性

14、和表達水平而增強了機體的抗感染能力有關，至于二者之間是通過怎樣的途徑和環(huán)節(jié)發(fā)揮對免疫系統(tǒng)的調控作用，尚需要進一步的實驗研究證實。 【參考文獻】 1AderemA,UlevitchRJToll2likereceptorsintheinductionoftheinnateimmuneresponseNature,2000,406(6797):782 2HayashiF,MeansTK,LusterADTolllikereceptorsstimulatehumanneutrophilfunctionBlood,2003,102(7):2660 3DoyleSE,OConnellRM,MirandaG

15、A,etalTolllikereceptorsinduceaphagocyticgeneprogramthroughp38JExpMed,2004,199(1):81 4BlanderJM,MedzhitovR.RegulationofphagosomematurationbysignalsfromtolllikereceptorsScience,2004,304(5673):1014 5LienE,SellatiTJ,YoshimuraA,etal.Toll2likereceptor2functionsasapatternrecognitionreceptorfordiversebacter

16、ialproductJBiolChem,1999,274:33419 6KawaiT,AdachiO,OgawaT,etalUnresponsivenessofMyD88deficientmicetoendotoxinImmunity,1999,11:115 7SwantekJL,TsenMF,CobbMH,etalIL1receptor2associatedknasemodulateshostresponsivenesstoendotoxinJImmumo，2000,164:4301 8YangRB,MarkMR,GurneyAL,etal.Signalingeventsinducedbylipopolysaccharideactivatedtolllikereceptor2JImmunol,1999,163:639 9ShimazuR,AkashiS,OgataH,etalMD2,amoleculethatconferslipopolysaccharideresponsivenessontolllikerecept