蛋白結(jié)合率相關(guān)知識

1、蛋白結(jié)合率相關(guān)知識血漿蛋白結(jié)合率：藥物與血漿蛋白結(jié)合的程度，即血液中與 蛋白結(jié)合的藥物占總藥量的百分?jǐn)?shù)。血漿蛋白結(jié)合率為可逆性疏松結(jié)合，結(jié)合型藥物分子量增大，不 能跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝和排泄，并暫時失去藥理活性，某些藥物可在 血漿蛋白結(jié)合部位上發(fā)生競爭排擠現(xiàn)象。藥物分子與血漿蛋白結(jié) 合的特點(diǎn)（和藥物與受體蛋白結(jié)合情況相似）：具有飽和性與可 逆性、結(jié)合物無活性、有競爭置換現(xiàn)象。藥物進(jìn)入循環(huán)后，有兩種形式：結(jié)合型藥物：藥物與血漿蛋白結(jié)合。特點(diǎn)：（1）暫時失去藥理活性。（2 ）體積增大，不易通過血管壁，暫時“儲存”于血液中。意義：結(jié)合型藥物起著類似藥庫的作用。藥物進(jìn)入相應(yīng)組織 后也與組織蛋白發(fā)生結(jié)合，也起

2、到藥庫作用，影響藥物作用和作 用維持時間長短，一般蛋白結(jié)合率高的藥物體內(nèi)消除慢，作用維 持時間長。游離型藥物：未被血漿蛋白結(jié)合的藥物。特點(diǎn)：能透過生物膜，進(jìn)入到相應(yīng)的組織或靶器官，產(chǎn)生效 應(yīng)或進(jìn)行代謝與排泄。藥物與血漿蛋白結(jié)合方式：酸性藥物與白蛋白結(jié)合：華法林、非甾體抗炎藥、磺胺類藥 物主要與血漿白蛋白結(jié)合，三環(huán)類抗抑郁藥、氯丙嗪也與白蛋白 結(jié)合。堿性藥物與al-糖蛋白結(jié)合：伊糖蛋白和a-酸性糖蛋白雖然 量比白蛋白少很多，但在癌癥、關(guān)節(jié)炎、心肌梗死等疾病中可增 高，能與奎寧結(jié)合。特點(diǎn)：（1 ）可逆性藥物與血漿蛋白的結(jié)合是可逆的，極少數(shù)是共價結(jié)合（如烷 化劑）。藥物在血液中轉(zhuǎn)運(yùn)時，結(jié)合型與游離型

3、藥物快速達(dá)到動態(tài)平 衡。游離型藥物透過生物膜血液中游離型藥物濃度降低結(jié) 合型藥物，釋出游離型藥物。（2）飽和性血漿中蛋白有一定的量，與藥物的結(jié)合有限，因此，藥物與 血漿蛋白結(jié)合具有飽和性。當(dāng)藥物濃度大于血漿蛋白結(jié)合能力時飽和游離型藥物急 劇增加毒性反應(yīng)。某些病理情況下，血漿蛋白過少（如肝硬化、慢性腎炎）、 變質(zhì)（如尿毒癥） 藥物與血漿蛋白結(jié)合減少毒性反應(yīng)。有些 藥物在老年人中呈現(xiàn)較強(qiáng)的藥理效應(yīng)，與老年人的血漿蛋白減少 有關(guān)。(3) 競爭性兩種藥物t競爭結(jié)合同一蛋白t置換t游離型藥物濃度增加 t導(dǎo)致中毒。女口：保泰松T結(jié)合型雙香豆素T游離型T濃度增加T出血傾 向。與內(nèi)源性代謝物競爭與血漿蛋白結(jié)合

4、，如磺胺藥T置換膽紅 素T新生兒核黃疸癥。此外，注射白蛋白可與藥物結(jié)合而影響療效。血漿蛋白與藥物結(jié)合時，血漿蛋白在體內(nèi)的各種作用暫時消失， 但是與藥物分離之后，血漿蛋白各種性質(zhì)基本不變，繼續(xù)發(fā)揮原 來的作用。血漿蛋白結(jié)合率的測定1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康臏y定磺胺嘧啶鈉在不同動物體內(nèi)的血漿蛋白結(jié)合率。2、實(shí)驗(yàn)原理將蛋白置于一個隔室內(nèi)，用半透膜將此隔室與另一隔室隔開。 蛋 白等大分子不能通過此半透膜，但系統(tǒng)中游離配基可自由通過。當(dāng)達(dá) 到平衡時半透膜兩側(cè)自由配基的濃度相等。 若系統(tǒng)中自由配基的總量 已知，測定不含蛋白隔室中自由配基的濃度， 即可推算與蛋白結(jié)合的 配基量。具有游離氨基的磺胺藥在酸性介質(zhì)中與亞硝酸發(fā)生

5、重氮化反應(yīng) 后，可與 N-（1 萘基）乙二胺產(chǎn)生偶合反應(yīng)生成紫紅色偶氮染料，與 經(jīng)過同樣處理的磺胺藥標(biāo)準(zhǔn)液比較，用 721 分光光度計比色法測出 組織中和不同時間的血液中磺胺嘧啶濃度。由于亞硝酸不穩(wěn)定， 在實(shí)驗(yàn)中， 用三氯醋酸與亞硝酸鈉反應(yīng)制的 得。剩余的過量亞硝酸影響測定，用氨基磺酸胺分解除去。3、實(shí)驗(yàn)材料1、實(shí)驗(yàn)動物兔子一只。2、設(shè)備與器械712 分光光度計、 管狀半透膜（周長 5cm ，長約 12cm ）、 絲 線 、廣口瓶 、 移液器。3、藥物與試劑10% 磺胺嘧啶鈉注射液15% 三氯醋酸溶液0.1% 亞硝酸鈉溶液0.5% 氨基磺酸胺溶液0.1%二鹽酸 N-（1 萘基） -乙二胺溶液磺

6、胺嘧啶鈉貯存標(biāo)準(zhǔn)液磺胺嘧啶鈉應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)液4、試驗(yàn)方法1、試劑的制備0.1%二鹽酸N- (1萘基)-乙二胺溶液：0.5 g溶于95 %乙醇 約 400 mL 中，再用乙醇稀釋至 500ml ，棕色瓶于冰箱中保存透析液( PBS)： pH7.4 的 0.02M 磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含 0.15M NaCl磺胺嘧啶鈉應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)液：10%磺胺嘧啶鈉注射液3.75訕溶于約 80ml3% 三氯醋酸溶液再定容于 100ml 容量瓶中備用2、血漿制備兔心臟采血， 肝素抗凝， 以 3000rpm 離心 10min ，取上清液即 為血漿。3 、透析將管狀半透膜一端折疊， 用紗線扎緊，保留結(jié)扎線段 10cm 左右， 以調(diào)節(jié)

7、袋內(nèi)外液面在同一水平，加血漿樣品 2.0ml 于上述半透膜袋 內(nèi)，并扎緊口袋另一端，袋口不得污染血漿。將兩端扎緊的半透膜置 于盛有 9.75ml 透析液的 30ml 廣口瓶中，用袋兩端線段調(diào)節(jié)袋內(nèi)外 液面，加 0.05mg/ml 的磺胺嘧啶鈉溶液 0.5ml 于各瓶袋外透析液中。 置廣口瓶于冰箱中，平衡透析約 60h 左右。吸出袋外透析液少許， 加等量磺基水楊酸試劑， 無渾濁，說明無血漿蛋白漏出。 取出半透膜， 用濾紙吸干袋外壁透析液， 小心解開透析袋， 使袋內(nèi)血漿流入干凈試 管。4、用重氮化 -偶合比色法測定袋內(nèi)外溶液中磺胺藥濃度。取袋內(nèi)外溶液各 0.5ml ，加水 15.5ml ；加 15

8、%三氯醋酸 4ml ， 混勻，靜置 2min ，過濾，取試管 3 支，各加入濾液 5mL ，為測定管； 取試管 3 支，加入空白對照液 5mL ，為空白管；取試管 3 支，加入 應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)液 5mL ，為標(biāo)準(zhǔn)管，在以上各管中各加入 0.1% 亞硝酸鈉溶 液 0.5mL ，混勻，放置 3min ，各加入 0.5%氨基磺酸胺溶液 0.5mL ， 混勻，放置 2min ，各加入 0.1% 二鹽酸 N- （1 萘基） -乙二胺溶液 2.5mL ，充分混勻，放置 10min ，用 721 分光光度計在 550nm 波 長處比色：以空白管校正光密度到 0 點(diǎn)，讀取標(biāo)準(zhǔn)管和測定管光密度， 并用公式計算：測定管

9、光密度游離磺胺藥含量（mg% ） = x應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)液濃度x樣品稀釋倍數(shù)標(biāo)準(zhǔn)管光密度5、計算血漿蛋白結(jié)合率。Dt - Dffb= x100%Dtfb ：血漿蛋白結(jié)合率；Dt ：血藥總濃度（透析袋內(nèi)血漿藥物濃度） ；Df ：游離藥物濃度（透析袋外緩沖液中藥物濃度）五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、結(jié)果記錄表一：標(biāo)準(zhǔn)管和測定管光密度的測定結(jié)果均值樣一樣二樣三平透析袋外0.0060.0080.0110.008透析袋內(nèi)0.0650.0900.0610.072標(biāo)準(zhǔn)液0.6900.7010.6800.6902、游離磺胺藥含量的計算計算得：透析袋內(nèi)藥物濃度=0.000044mg/ml透析袋外藥物濃度=0.00039mg/ml3、

10、藥物血漿蛋白結(jié)合率的計算結(jié)果：兔：fb=88.9%六、結(jié)果討論與總結(jié)1、分光光度計的使用操作。由于應(yīng)該使用一套比色杯來測定吸光度，而在實(shí)際操作中比色杯使用混亂，而且并沒有做到嚴(yán)格的潤洗，所以吸光度的測量存在較大 的誤差。分光光度計的使用應(yīng)該注意的事項(xiàng)：（1）為了防止光電管疲勞。不測定時必須將比色皿暗箱蓋打開，使 光路切斷，以延長光電管使用壽命。（2）拿比色皿時，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿 的透光面，以免沾污。（3）清洗比色皿時，一般先用水沖洗，再用蒸餾水洗凈。每次做完 實(shí)驗(yàn)時，應(yīng)立即洗凈比色皿。（ 4）測定有色溶液吸光度時， 一定要用有色溶液洗比色皿內(nèi)壁幾次， 以免改變有色溶液

11、的濃度。另外，在測定一系列溶液的吸光度時，通 常都按由稀到濃的順序測定，以減小測量誤差。（5）在實(shí)際分析工作中，通常根據(jù)溶液濃度的不同，選用液槽厚度不同的比色皿，使溶液的吸光度控制在 0.20.7。2、總結(jié)動物的種屬、生理病理狀態(tài)、個體差異可以影響血漿蛋白結(jié)合率。 理論上當(dāng)?shù)鞍诐舛茸銐蚋邥r所有與蛋白作用的藥物都能被結(jié)合。 但實(shí) 際情況下，當(dāng)親和力較低時不可能達(dá)到這種所謂的足夠高的蛋白濃 度。蛋白濃度一定時， 一定范圍內(nèi)當(dāng)藥物濃度增加結(jié)合的藥量會隨之 增加，但結(jié)合分?jǐn)?shù)降低。相反，當(dāng)藥物濃度下降時，結(jié)合分?jǐn)?shù)增加并 逐漸趨向于一個最大值 , ，因此不同藥物在低濃度時的最大結(jié)合率各 不相同。平衡透析法是一種相對簡單不需要復(fù)雜設(shè)備的可行性強(qiáng)的