2011分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)講義8

1、生物工程教學(xué)實(shí)習(xí)-分子基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一 （1）大腸桿菌感受態(tài)制備及外源DNA的轉(zhuǎn)化一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? .了解轉(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學(xué)研究中的意義。2 .學(xué)習(xí)氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的方法。3 .學(xué)習(xí)將外源質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入受體菌細(xì)胞并篩選轉(zhuǎn)化體的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理轉(zhuǎn)化（Transformation ）是將異源DNA分子引入另一細(xì)胞品系，使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的 一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研窕的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì) 胞一般是限制性修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株，常用RM符 號(hào)表示。轉(zhuǎn)化方法：電擊法、CaC12, RuCI等化學(xué)試劑法

2、。感受態(tài)細(xì)胞：的處理后，細(xì)胞膜的 通透性發(fā)生變化，成為能容許外源DNA分子通過時(shí)細(xì)胞的狀態(tài)。轉(zhuǎn)化細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子）:帶有異源DNA 分子的受體細(xì)胞（Transformant ）。本實(shí)驗(yàn)以E.coli DH5«菌株為受體細(xì)胞，用CaC12處理受體菌使其處于為感受態(tài)，然后與 pUC18質(zhì)粒共保溫，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。pUC18質(zhì)粒攜帶有抗氨葦青霉素的基因，因而使接受了該質(zhì)粒的 受體菌具有抗緞?dòng)袂嗝沟奶匦?，用Apr符號(hào)表示。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的全部受體細(xì)胞經(jīng)過適應(yīng)稀釋，在 含氨苦青霉素的平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，只有轉(zhuǎn)化體才能存活，而未受轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞則因無抵抗紈荒 青霉素的能力而死亡。影響轉(zhuǎn)化率的因素細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和

3、密度。轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和濃度。試劑的質(zhì)量。防止雜菌和其它外源 DNA的污染。三、實(shí)驗(yàn)儀器、試劑超凈工作臺(tái)：臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；恒溫空氣搖床；恒溫培養(yǎng)箱；培養(yǎng)皿4 腸桿菌DH5 aLB培養(yǎng)基,（胰蛋白培10g,酵母提取物5g, NaCUOg,溶解到1升蒸儲(chǔ)水中，調(diào)PH7.0,滅菌）0.1mol/LCaC12 溶液（預(yù)冷）氨芳青霉素pUC18質(zhì)粒四、實(shí)驗(yàn)步驟菌株活化1 .用接種環(huán)直接取凍存的大腸桿菌DH5。，在LB培養(yǎng)基平板表而劃線，于37培養(yǎng)16小時(shí)2 .挑取一個(gè)單菌落，轉(zhuǎn)到3 5MLB培養(yǎng)基中，于37培養(yǎng)35小時(shí)3 .將培養(yǎng)液全部轉(zhuǎn)到lOOmlLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時(shí)，到OD600=0.

4、30.8感受態(tài)細(xì)胞制備4 .將培養(yǎng)液8mL在冰上放置15 30min, 4000rpm離心5min,棄上清（4度）5 .加入0.8ml預(yù)冷的0.1mol/lCaC12,懸浮沉淀,轉(zhuǎn)入15ml離心管中6 .冰上預(yù)冷30min, 4000rpm離心5 min,棄上清7 .加入0.2ml預(yù)冷的0.1mol/lCaC12,懸浮沉淀,即可使用。轉(zhuǎn)化8 .吸取200ul感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到無菌的離心管中，每管中加入質(zhì)粒DNAlul（不超過2叫,于冰上 放置30min,設(shè)置對(duì)照不加質(zhì)粒只有感受態(tài)細(xì)胞。9 .于42C水浴90s （增加DNA吸收）10 .冰上放置2min11 .加入800 H 1LB液體培養(yǎng)基于3

5、7培養(yǎng)1小時(shí)12 .將200U1培養(yǎng)液均勻涂布在含Amp+的培養(yǎng)基平板上（可以設(shè)置涂布20uL對(duì)照）13 .將平板放置于37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14-16個(gè)小時(shí)，然后觀察結(jié)果對(duì)照組吸取2003感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，加入2 ul無菌水，于冰上放置30min,接 著9步做下去轉(zhuǎn)化率氨一儲(chǔ)備液;100mg/mL,卡那儲(chǔ)備液50 mg/mL,培養(yǎng)基中總濃度為:氨茱50ug/ml,卡那,25 ug/mL 固體培養(yǎng)基在60C以下添加。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告畫出實(shí)驗(yàn)結(jié)果的示意圖并做分析，計(jì)算轉(zhuǎn)化效率（質(zhì)粒0.05ug/uL*10uL）。實(shí)驗(yàn)一 轉(zhuǎn)化子DNA的快速鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、選擇性培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)化子為材料檢測(cè)

6、重組質(zhì)粒DNA分子的大小，選出合理的重組的轉(zhuǎn)化體 菌株。2、掌握快速細(xì)胞破碎法，測(cè)定大小不等的質(zhì)粒DNA。二、實(shí)驗(yàn)原理利用Cracking gel緩沖液，采用快速細(xì)胞破碎法直接從菌體中提取DNA三、實(shí)驗(yàn)操作轉(zhuǎn)化子鑒定步驟：（1）挑取轉(zhuǎn)化平板上的單菌接種于含相應(yīng)抗生素的50ml LB中，37c振蕩培養(yǎng)至A590 值為0.60.8。（2）取1.2ml菌液至1.5ml Eppendorf管中，9000rpm離心9min,去盡上清。（3）加入 70 口 1 Cracking Gel 緩沖液Imol/L Tris - HCl（pH6.8）10ml.20%SDS 10ml, 250mmol/LEDTA 1

7、.6ml,蔗糖 27.2g, 1.2%浪酚藍(lán) 1.67ml,加雙蒸水至 200ml,混勻后，37水浴 30min 以上。（4） 15000rpm 離心 15min。（5）（實(shí)驗(yàn)三）吸取上清點(diǎn)樣電泳，觀察。思考題1、Cracking gel中各成分的作用分別是什么？2、培養(yǎng)基中添加抗生素的作用是什么？實(shí)驗(yàn)二質(zhì)粒DNA的提取、酶切與鑒定一、目的掌握質(zhì)粒的小量快速提取法：了解質(zhì)粒酶切鑒定原理。 二、原理所有分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增：收集和裂解細(xì)菌：分 離和純化質(zhì)粒DNA。采用溶菌酶可破壞菌體細(xì)胞壁，十二烷基磺酸鈉（Sodium dodecyl sulfate, SD

8、S） 可使細(xì)胞壁裂解，經(jīng)溶菌酶和陰離子去污劑（SDS）處理后，細(xì)菌DNA纏繞附著在細(xì)胞壁碎片上, 離心時(shí)易被沉淀出來，而質(zhì)粒DNA則留在上清液中。用酒精沉淀洗滌，可得到質(zhì)粒DNA。主要原 理是利用染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離的目的，細(xì)菌在氫氧化鈉和SDS 溶液中裂解，蛋白質(zhì)和DNA變性但是染色體DNA氫鍵斷裂，雙螺旋解開，質(zhì)粒DNA也會(huì)發(fā)生這 種變化，但共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離，用PH4.8乙酸鉀將其PH調(diào)制中性，變 性質(zhì)粒DNA又恢復(fù)到原來的構(gòu)型，而染色體DNA不能復(fù)性，形成纏繞的致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。質(zhì)粒DNA分子量一般在106707道爾頓范圍內(nèi)。在細(xì)胞內(nèi)，

9、共價(jià)閉環(huán)DNA （covalently closed circular DNA,簡(jiǎn)稱cccDNA）常以超螺旋形式存在。若兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分 子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，這種松弛型的分子叫作開環(huán)DNA（open circular DNA,簡(jiǎn)稱ocDNA）。 在電泳時(shí)，同一質(zhì)粒如以cccDNA形式存在，它比其開環(huán)和線狀DNA的泳動(dòng)速度都快，因此在本 實(shí)驗(yàn)中，質(zhì)粒DNA在電泳凝膠中呈現(xiàn)3條區(qū)帶。限制性內(nèi)切酶是一種工具酶，這類酶的特點(diǎn)是具有能夠識(shí)別雙鏈DNA分子上的特異核甘酸順 序的能力，能在這個(gè)特異性核甘酸序列內(nèi)，切斷DNA的雙鏈，形成一定長(zhǎng)度和順序DNA片段。如: EcoR I和

10、HindHI的識(shí)別序列和切口是：EcoR I ： G I AAITCHindlH： A I AGCTTG, A等核甘酸表示酶的識(shí)別序列，箭頭表示酶切口。限制性內(nèi)切酶對(duì)環(huán)狀質(zhì)粒DNA有多少切 口，就能產(chǎn)生多少酶切片段，因此鑒定酶切后的片段在電泳凝膠的區(qū)帶數(shù)，就可以推斷酶切口的數(shù) 目，從片段的遷移率可以大致判斷酶切片段大小的差別。用已知分子量的線狀DNA為對(duì)照，通過 電泳遷移率的比較，就可以粗略推測(cè)分子形狀相同的未知DNA的分子量。三、實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器和試劑1 .主要儀器（1）塑料離心管1.5mLX3O（2）塑料離心管架XI（3）微量加樣器10 uL、100 uL、1000 uL各一支（4）常用

11、玻璃儀器及滴管等（5）臺(tái)式高速離心機(jī)（20 000i7min）（6）電泳儀（7）電泳槽（8）樣品槽模板2 .材料大腸桿菌DH5 «3 .試劑（1） PH8.0G.E.T 緩沖液（50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA, 25mmol/LTris-HCl）；用前加 溶菌兩4mg/mL.（2） pH 4.8 乙酸鉀溶液（60mL5moi/LKAc, U.5mL 冰乙酸，28.5inLH2O）（3）酚/氯仿（1 ： 1, V/V）：酚需在160c重蒸，加入抗氧化劑8-羥基瞳咻，使其濃度為0.1%, 并用Tris-HCl緩沖液平衡兩次。氯仿中加入異戊醉，氯仿/異戊醉（24： 1,

12、V/V）o（4）pH8.0TE緩沖液：10mnK）l/LTris,ln】mol/LEDTA,其中含有RNA酶（RNase）20ug/mL。（5）TBE緩沖液：稱取TrislO.88g、硼酸5.52g和EDTA0.72g,用蒸儲(chǔ)水溶解后，定容至200mL, 用前稀釋10倍。(6)溶液 II ,0.2mol/LNaOH,l%SDS(必須新鮮配置) 四、操作步驟1 .培養(yǎng)細(xì)菌將帶有質(zhì)粒的大腸桿菌DH5 G接種在LB液體培養(yǎng)基上，37培養(yǎng)2448h,2 .從細(xì)菌中快速提取制備質(zhì)粒DNA,后面依次擴(kuò)大加的溶液。(1)收集7.5ml菌液，離心12000rpm,lmin,棄去上清液。加入150 u L預(yù)冷的

13、的GE.T.緩沖液, 強(qiáng)烈震蕩混勻。(2)加入200 L新配置的0.2mol/LNaOH, 1%SDS (現(xiàn)用現(xiàn)配)。加蓋，快速顛倒46次使 之混勻(勿劇烈)。冰上放置4 min。(3)加150 uL冷卻的乙酸鉀溶液,加蓋后顛倒數(shù)次混勻,冰上放置5 min。10 000r/min離心 5 min,上清液倒入另一離心管中。(4)向上清液中加入等體積酚/氯仿，震蕩混勻，10 00(h7min離心2 min,將上清液水相轉(zhuǎn)移 至新的離心管中，棄有機(jī)相。(5)力口 1/10體積的3mol/LnaAc(NaAc+HAc.PH5.2)和2.5倍體枳的無水乙醉，混勻，于-20放 置15分鐘。離心14000r

14、pm*15min.棄去上清。(6)加1mL70%乙醇,旋轉(zhuǎn)洗滌,倒掉洗滌液，真空抽干,待用。加TE50uL溶解沉淀。加Rnasel-2uL混勻，置37水浴30min后，進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切實(shí)驗(yàn)。或者于-20C保存待 用O3 .質(zhì)粒DNA的酶解將自提質(zhì)粒加入20uL的TE緩沖液，使DNA完全溶解。取清潔、干燥、火菌的具塞離心管 編號(hào)用微量加樣器按表1所示將各種試劑分別加入每個(gè)小離心管內(nèi)。表1 DNA酶切加樣表7ul ddH202uL10*H.BufferluL限制酶(10U)WuL質(zhì)粒DNA(lug),注：購(gòu)買質(zhì)粒加0.5uL.*如果體積不到20,補(bǔ)無菌雙蒸水至20 uL,依實(shí)際情況做相應(yīng)調(diào)整加

15、樣后，小心混勻，置于37水浴中，酶解23h,反應(yīng)終止后，各酶切樣品于冰箱中貯存?zhèn)?用O 五、思考題1.染色體DNA與質(zhì)粒DNA分離的主要依據(jù)是什么？實(shí)驗(yàn)三(1)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)PCR反應(yīng)的基本原理，掌握PCR的基本操作技術(shù)以及瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。 二、實(shí)驗(yàn)原理PCR用于擴(kuò)增位于兩端已知序列之間的DNA區(qū)段，即通過引物延伸而進(jìn)行的重復(fù)雙向DNA合 成?；驹砑斑^程如下：PCR循環(huán)過程中有三種不同的事件發(fā)生：(1)模板變性；(2)引物退火：(3)熱穩(wěn)定DNA聚 合酶進(jìn)行DNA合成。1 .變性：加熱使模板D

16、NA在高溫下(94-95C)變性，雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈，即 變性階段。2 .退火：在體系溫度降至37-65C,模板DNA與引物按堿基配對(duì)原則互補(bǔ)結(jié)合，使引物與模 板鏈3'端結(jié)合，形成部分雙鏈DNA,即退火階段。3 .延伸：體系反應(yīng)溫度升至中溫72,耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導(dǎo) 下，利用反應(yīng)混合物中的4種脫氧核甘三磷酸（dNTP）,按5,到3,方向復(fù)制出互補(bǔ)DNA,即引物 的延伸階段。上述3步為一個(gè)循環(huán)，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個(gè)階段。從理論上講，每經(jīng)過一個(gè) 循環(huán)，樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過2530個(gè)循 環(huán)

17、后DNA可擴(kuò)增1061（）9倍。典型的PCR反應(yīng)體系由如下組分組成：DNA模板、反應(yīng)緩沖液、dNTP、MgCb,兩條合成的 DNA引物、耐熱DNATaq聚合酶。三、實(shí)驗(yàn)材料及相關(guān)試劑基因組DNA,基因特異性引物，PCR擴(kuò)增相關(guān)試劑，等PCR擴(kuò)增儀、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)、加樣器、槍頭、DNA模板、引物1、引物2、dNTP、Taq 酶、Eppendorf 管等 四、實(shí)驗(yàn)步驟1. 模板DNA的抽提：實(shí)驗(yàn)一所得的基因組DNA.2. PCR操作（在冰上操作）：（1）PCR反應(yīng)混合液的配制：反應(yīng)體系25 pL,在無菌的0.2 mL離心管中按下列操作程序 加樣： 反應(yīng)物體積磯終濃度ddH2O12Xn10 x

18、Buffer2.5 Xn1 X25 mmol/L MgC122.52.5 mol/L10 mmol/L dNTP4Xn (1X4)200 mol/L10 pM上游引物0.5 XnlOOpmol/L10 UM下游引物0.5 XnlOOpmol/LDNA Taq聚合的IXn1 UPUC18引物：產(chǎn)物長(zhǎng)度：632bp引物購(gòu)買后2OD先離心后約加入420uLddH2O,使?jié)舛葹?0uM.上游引物：5' CGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTA 3'下游引物 5' GGGAGTCAGGCAACTATGGATGAA 3'（2）將反應(yīng)混合液混勻，然后每個(gè)PCR管中

19、分裝24HL反應(yīng)混合液，再加2-3rL模板DNA。（3）將PCR管放到PCR熱循環(huán)儀中，按下列程序開始循環(huán)：PCR條件：預(yù)變性94度，5分鐘；變性94度，1分鐘;退火55度,45秒;延伸72度，1分鐘：循環(huán)35 次：過度延伸10分鐘。（4）注意事項(xiàng)由于PCR靈敏度非常高，所以應(yīng)當(dāng)采取措施以防反應(yīng)混合物受痕量DNA的污染。a.所有與PCR有關(guān)的試劑，只作PCR實(shí)驗(yàn)用，而不挪作它用。b.操作中所用的PCR管、離心管、吸管頭等都只能一次性使用。8C.每加一種反應(yīng)物，應(yīng)換新的槍頭。3. PCR產(chǎn)物的檢測(cè)：思考題：1 . PCR反應(yīng)液中主要成分是哪些？在PCR反應(yīng)過程中各起什么作用？2 .為什么在PCR

20、反應(yīng)過程中，使用三個(gè)不同的溫度變化？3 .用PCR擴(kuò)增目的基因，要想得到特異性產(chǎn)物需注意哪些事項(xiàng)？實(shí)驗(yàn)三(2)DNA的瓊脂糖凝膠電泳一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康沫傊悄z電泳是常用的檢測(cè)核酸的方法，具有操作方便、經(jīng)濟(jì)快速等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)DNA 瓊脂糖凝膠電泳的使用技術(shù)，掌握有關(guān)的技術(shù)和識(shí)讀電泳圖譜的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定DNA、RNA分子混合物的方法，這種電泳方法以瓊 脂凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動(dòng)時(shí)的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離混合物的目的。 DNA分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電，在電場(chǎng)中向陽極移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分 子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即

21、分子本身的大小和構(gòu)型是主要的影響因素。遷移速度與分子量 的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。不同構(gòu)型的DNA分子的遷移速度不同。如環(huán)形DNA分子樣品，其中有三種 構(gòu)型的分子：共價(jià)閉合環(huán)狀的超螺旋分子(cccDNA),開環(huán)分子(ocDNA)、和線形DNA分子(IDNA)。 這三種不同構(gòu)型分子進(jìn)行電泳時(shí)的遷移速度大小順序?yàn)?cccDNA>IDNA>ocDNA核酸分子是兩性解離分子，pH3.5是堿基上的氨基解離，而三個(gè)磷酸基團(tuán)中只有一個(gè)磷酸解離, 所以分子帶正電，在電場(chǎng)中向負(fù)極泳動(dòng)；而PH8.0-8.3時(shí)，堿基幾乎不解離，而磷酸基團(tuán)解離，所 以核酸分子帶負(fù)電，在電場(chǎng)中向正極泳動(dòng)。不同的核酸分子的電荷密度

22、大致相同，因此對(duì)泳動(dòng)速度 影響不大。在中性或堿性時(shí)，單鏈DNA與等長(zhǎng)的雙鏈DNA的泳動(dòng)率大致相同。影響核酸分子泳動(dòng)率的因素主要是：1、樣品的物理性狀即分子的大小、電荷數(shù)、顆粒形狀和空間構(gòu)型。一般而言，電荷密度愈大，泳動(dòng)率越大。但是 不同核酸分子的電荷密度大致相同，所以對(duì)泳動(dòng)率的影響不明顯。對(duì)線形分子來說，分子量的常用對(duì)數(shù)與泳動(dòng)率成反比，用此標(biāo)準(zhǔn)樣品電泳并測(cè)定其泳動(dòng)率，然 后進(jìn)行DNA分子長(zhǎng)度(bp)的負(fù)對(duì)數(shù)一一泳動(dòng)距離作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，可以用于測(cè)定未知分子的長(zhǎng)度 大小。DNA分子的空間構(gòu)型對(duì)泳動(dòng)率的影響很大，比如質(zhì)粒分子，泳動(dòng)率的大小順序?yàn)?cDNAAIDNA >ocDNA但是由于瓊脂糖濃度

23、、電場(chǎng)強(qiáng)度、離子強(qiáng)度和濾化乙錠等的影響，會(huì)出現(xiàn)相反的情況。2、支持物介質(zhì)瓊脂糖凝膠適合分離長(zhǎng)度100至60的分子，而聚丙烯酰胺凝膠對(duì)于小片段(5bp-500bp)的分 離效果最好。選擇不同濃度的凝膠，可以分離不同大小范圍的DNA分子。3、電場(chǎng)強(qiáng)度電場(chǎng)強(qiáng)度愈大，帶點(diǎn)顆粒的泳動(dòng)越快。但凝膠的有效分離范圍隨著電壓增大而減小，所以電泳 時(shí)一般采用低電壓，不超過4V/cme而對(duì)于大片段電泳，甚至用0.5-LOV/cm電泳過夜。進(jìn)行高壓 電泳時(shí)，只能使用聚丙烯酰胺凝膠。4、緩沖液離子強(qiáng)度核酸電泳常采用TAE、TBE、TPE三種緩沖系統(tǒng)，但它們各有利弊。TAE價(jià)格低廉，但緩沖能 力低，必須進(jìn)行兩極緩沖液的循

24、環(huán)。TPE在進(jìn)行DNA回收時(shí)，會(huì)使DNA污染磷酸鹽，影響后續(xù)反 應(yīng)。所以多采用TBE緩沖液。在緩沖液中加入EDTA,可以整合二價(jià)離子，抑制DNase,保護(hù)DNA,緩沖液pH常偏堿性或中性，此時(shí)核酸分子帶負(fù)電，向正極移動(dòng)。核酸電泳中常用的染色劑是澳化乙錠（ethidium bromide EB）。澳化乙錠是一種扁平分子，可以 嵌入核酸雙鏈的配對(duì)堿基之間。在紫外線照射BE-DNA復(fù)合物時(shí)，出現(xiàn)不同的效應(yīng)。254nm的紫外 線照射時(shí)，靈敏度最高，但對(duì)DNA損傷嚴(yán)重：360nm紫外線照射時(shí)，雖然靈敏度較低，但對(duì)DNA 損傷小，所以適合對(duì)DNA樣品的觀察和回收等操作。300nm紫外線照射的靈敏度較高，且

25、對(duì)DNA 損傷不是很大，所以也比較適用。使用澳化乙錠對(duì)DNA樣品進(jìn)行染色，可以在凝膠中加入終濃度為0.5 ug/ml的EB。EB摻入 DNA分子中，可以在電泳過程中隨時(shí)觀察核酸的遷移情況，但是如果要測(cè)定核酸分子大小時(shí)，不 宜使用以上方法，而是應(yīng)該在電泳結(jié)束后，把凝膠浸泡在含0.5 4 g/mlEB的溶液中1030min進(jìn)行 染色。BE見光分解，應(yīng)在避光條件下4保存。三、材料、試劑及器具1、材料Marker （分子量標(biāo)準(zhǔn)）：質(zhì)粒提取物：酶切產(chǎn)物。2、試劑加樣緩沖液（6x）： 0.25%澳酚蘭，40%蔗糖：瓊脂糖：酶液3、器具（1）電泳系統(tǒng)：電泳儀、水平電泳槽、制膠板等。（2）紫外透射儀。四、操作

26、步驟瓊脂糖凝膠電泳步驟：瓊脂糖濃度（1.2%）； EB 濃度（5 pl/100 mlTBE）（1）制膠（以150 mL為例）a.稱取1.8 g瓊脂糖，加入150 ml的TBE緩沖液（pH 8.0）,搖勻，用電子天平稱三角瓶 的總重量。b.電爐上加熱，至瓊脂糖完全溶解：然后在天平上加蒸儲(chǔ)水至原重量；c.用凝膠將制膠板兩端封好，插入適當(dāng)?shù)氖嶙?，將溶解的瓊脂糖（約50C）,倒入其中，直 至厚度為46 mm （如有氣泡要把氣泡趕出），在室溫下冷卻凝固（約30 45 min）；d.將制膠板置于電泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保證點(diǎn)樣孔完好。（2）點(diǎn)樣a.將樣品稍微離心，將2.0懼澳酚藍(lán)加入到小離心管中，混勻：b.每孔點(diǎn)樣15.0惘，藍(lán)色樣品混合物將沉入點(diǎn)樣孔下部。加樣順序：marker（9uL）,自提質(zhì) 粒、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒（10uL稀釋）、自提酶切、標(biāo)準(zhǔn)酶切、快速鑒定、自提PCR、標(biāo)準(zhǔn)PCR.（3）電泳打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至35 V/cm（約120 V）,可見到澳酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動(dòng)， 約1小時(shí)后即可觀察。（4）染色將電泳好的凝膠放入含EB的水溶液中，染色5-10分鐘。（5