姜黃素抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子所誘導(dǎo)的血管新生作用

1、姜黃素抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子所誘導(dǎo)的血管新生作用    【摘要】  為了研究姜黃素對多發(fā)性骨髓瘤（MM）細(xì)胞腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、內(nèi)皮細(xì)胞株TrkB的表達(dá)及內(nèi)皮細(xì)胞血管新生的影響，以初步探討姜黃素通過抑制血管新生治療多發(fā)性骨髓瘤的可能性，采用RT-PCR法分別檢測姜黃素處理前后多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株KM3中BDNF的基因表達(dá)變化與內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304中TrkB的基因表達(dá)變化，應(yīng)用內(nèi)皮細(xì)胞遷移試驗和內(nèi)皮細(xì)胞小管形成試驗評價姜黃素對內(nèi)皮細(xì)胞血管新生的影響。結(jié)果顯示：外源性BDNF能夠有效地促進內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和小管形成，但這兩

2、個效應(yīng)均能被姜黃素明顯阻斷；KM3細(xì)胞表達(dá)BDNF mRNA，ECV304細(xì)胞表達(dá)TrkB mRNA，姜黃素對兩者的表達(dá)均具有抑制作用，并呈劑量-時間依賴性。結(jié)論：BDNF是一種具有促進血管增殖活性的細(xì)胞因子，姜黃素可以分別下調(diào)MM細(xì)胞BDNF與內(nèi)皮細(xì)胞TrkB的表達(dá)，阻礙兩者間的相互作用，繼而抑制血管新生，這可能成為治療MM潛在的作用靶點。 【關(guān)鍵詞】  姜黃素Inhibitory Effect of Curcumin on Angiogenesis Induced by Brain Derived Neurotrophic Factor from Multiple Myeloma

3、 CellsAbstract    In order to explore the probability of curcumin treating multiple myeloma (MM) via   the inhibition of angiogenesis，the expressions of brain derived neurotrophic factor(BDNF) and its specific receptor  in human MM cells  and endothelial cells were

4、  detected  by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). The angiogenic activity was evaluated by endothelial cell  migration assay and tubule formation assay in vitro. The results showed that exogenous BDNF  significantly induced endothelial cell tubule formation

5、 and endothelial cell  migration，these two effects were inhibited by  curcumin. Furthermore，BDNF was detected in the MM cell and TrkB was detected in the endothelial cell and curcumin depressed the mRNA expression of BDNF and TrkB in the dose- and time-dependent manners. It is concluded th

6、at BDNF is a novel angiogenesis protein. Curcumin interrupts the  interaction between multiple myeloma cells and endothelial cells by reducing TrkB expression in endothelial cells and inhibiting BDNF production in multiple myeloma cells，eventually，resulting in inhibition of angiogenesis. This i

7、s probably one part of the mechanism of the curcumin treating MM via the inhibition of angiogenesis.Key words  curcumin；brain derived neurotrophic factor；multiple myeloma；angiogenesis    血管新生在多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）的發(fā)生與發(fā)展中占有重要的地位，我們近期的研究結(jié)果表明，MM患者高表達(dá)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neu

8、rotrophic factor，BDNF），且BDNF具有促進血管增殖活性1，2。在本試驗中我們檢測了姜黃素對BDNF體外誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞血管新生的影響及MM細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞中BDNF和TrkB轉(zhuǎn)錄水平的改變，以初步探討姜黃素通過抑制血管新生途徑治療MM的可能機制。材料和方法細(xì)胞株及其培養(yǎng)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株KM3由上海長征醫(yī)院候健教授惠贈，內(nèi)皮細(xì)胞株 ECV304 購于武漢大學(xué)典型物種保藏中心。將 KM3 和 ECV304 分別置于含10%胎牛血清的RPMI 1640和DMEM培養(yǎng)液（Gibcol）中，在37、 5 CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞進行實驗。主要試劑姜黃素（S

9、igma公司），以二甲亞砜(DMSO)配成8 mmol/L儲存液，使用前用無菌的PBS稀釋至工作濃度。BDNF（R&D system）用含1%牛血清白蛋白的PBS溶解至50 g/ml，儲存于-20；使用時終濃度為100 ng/ml。去生長因子基質(zhì)膠（Matrigel） 為Becton Dickinson公司產(chǎn)品。引物由上海生工公司合成（引物序列及擴增片段大小見表1），M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Oligo(15dt)為promega公司產(chǎn)品，RNasin、Taq酶為Biostar公司產(chǎn)品，dNTP為MBI公司產(chǎn)品。Table 1. Sequence  of primers and&#

10、160; size of amplified fragments（略）內(nèi)皮細(xì)胞遷移試驗參考早期文獻3報道，于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔接種1×105  ECV304細(xì)胞。單層培養(yǎng)至細(xì)胞覆蓋率為90左右時，換1% FBS的DMEM培養(yǎng)12小時，使細(xì)胞同步化。用橡膠刮片在孔內(nèi)刮出兩條整齊而平行的20 mm×5 mm刮痕，棄上清，加入新鮮含1血清的培養(yǎng)液1 ml并在不同孔內(nèi)加入實驗相應(yīng)空白對照（PBS）、陽性對照（BDNF）和試驗組（ BDNF不同濃度的姜黃素）。37、5 CO2下培養(yǎng)24小時。4多聚甲醛固定，瑞氏-姬姆薩染色后光學(xué)顯微鏡下（×100）觀察刮痕。每孔

11、隨機選擇5個視野，進行遷移細(xì)胞計數(shù)，每組重復(fù)3次。內(nèi)皮細(xì)胞小管形成試驗參考早期文獻4報道，ECV304在含1血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)12小時后收獲。于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入250 l  Matrigel，37，5 CO2下溫育90分鐘使膠凝固。每孔加入ECV304制成的5×105/ml不含血清的細(xì)胞懸液400 l，并添加實驗所需的空白對照（PBS）、陽性對照（BDNF）和試驗組（ BDNF不同濃度的姜黃素）。37，5 CO2下培養(yǎng)，24小時后光學(xué)顯微鏡下（×100）觀察細(xì)胞管狀排列及管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量、完整程度。逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）檢測BDNF的和TrkB的

12、mRNA細(xì)胞總RNA的提取  采用異硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法提取KM3與ECV304的總RNA，用DNA/RNA紫外檢測儀測定其含量及純度。逆轉(zhuǎn)錄  取總RNA 9 l，加入M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1 l，5×Rt buffer  4 l，Oligo(dt)1 l，RNasin  0.5 l，dNTP 4 l，用DEPC處理過的雙蒸水補充至20 l。42 水浴1小時，95 5分鐘滅活M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，-20保存或即用。PCR擴增  取1 g cDNA，加Taq酶0.5  l，10×buffer 5  l，d

13、NTP 2  l，BDNF、TrkB或 -actin上下游引物各2 l，用DEPC處理過的雙蒸水補充至50 l，上機檢測。BDNF與TrkB擴增條件分別為: 95 預(yù)變性4分鐘，95 變性60秒，55 退火30秒，72 延伸60秒，共30個循環(huán)；94 預(yù)變性4分鐘，94 變性30秒，65 退火30秒，72 延伸60秒，共32個循環(huán)。電泳  取PCR產(chǎn)物4 l于1.5%瓊脂糖凝膠上電泳15分鐘，紫外光顯影。統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 11.5軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗結(jié)果以x±SD 表示，組間分析采用兩獨立樣本的t檢驗。結(jié)果姜黃素阻斷BDNF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移效應(yīng)在未作任

14、何處理的情況下，內(nèi)皮細(xì)胞具有一定的遷移能力，100 ng/ml 的BDNF能明顯促進其遷移，每個視野的遷移細(xì)胞總數(shù)明顯地增加。姜黃素阻斷BDNF誘導(dǎo)的遷移效應(yīng)，遷移細(xì)胞總數(shù)隨著姜黃素濃度的升高而下降，20 mol/L時幾乎無細(xì)胞移動，30  mol/L時貼壁的細(xì)胞部分開始脫落，細(xì)胞皺縮凋亡，40 mol/L時絕大多數(shù)細(xì)胞脫落、皺縮凋亡（圖1）。BDNF組與對照組之間、姜黃素組（10，20 mol/L）與BDNF組相比，遷移細(xì)胞總數(shù)具有顯著差異（P<0.01）（表2 ）。Table 2.  Number of migrated cells  in differ

15、ent   groups（略）姜黃素阻斷BDNF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞小管形成效應(yīng)BDNF誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞在Matrigel上形成小管狀結(jié)構(gòu)，管壁完整，管腔大。姜黃素具有抑制BDNF誘導(dǎo)的小管形成效應(yīng)的能力，并隨濃度的增加而增強。30 mol/L時幾乎無管狀結(jié)構(gòu)形成，部分細(xì)胞皺縮凋亡，40 mol/L時細(xì)胞聚集成團，貼壁困難（圖2）。BDNF組與對照組之間、姜黃素組（10，20，30 mol/L）與BDNF組相比，小管總面積具有顯著差異（P<0.01）（表3 ）。Table 3. Total  area of formed tubules per visual fiel

16、d in  different groups（略）姜黃素對KM3細(xì)胞BDNF表達(dá)的影響用0、10、 20、 30、40 mol/L 的姜黃素孵育KM3細(xì)胞24小時，以0.5%的DMSO作為對照，排除DMSO對KM3的影響。結(jié)果顯示，隨著濃度的增加KM3細(xì)胞表達(dá)的BDNF mRNA逐漸減少，40 mol/L時已檢測不到BDNF mRNA的表達(dá)（圖3）。以20 mol/L 的姜黃素分別孵育KM3細(xì)胞12、24、36、48小時，隨著時間的增加KM3細(xì)胞表達(dá)的BDNF mRNA逐漸減少，作用48小時后KM3細(xì)胞無BDNF mRNA表達(dá)（圖4）。姜黃素對ECV304細(xì)胞TrkB表達(dá)的影響用0、

17、 10、 20、 30、40 mol/L 的姜黃素孵育ECV304細(xì)胞24小時，以0.5%的DMSO作為對照，排除DMSO對ECV304的影響。結(jié)果表明，隨著濃度的增加ECV304細(xì)胞表達(dá)的TrkB mRNA逐漸減少，在姜黃素濃度為30 mol/L時已檢測不到TrkB mRNA的表達(dá)（圖5）。百事通     以20 mol/L 的姜黃素分別孵育ECV304細(xì)胞12、24、36、48小時，結(jié)果隨著時間的增加ECV304細(xì)胞表達(dá)的TrkBmRNA逐漸減少，作用36小時后ECV304細(xì)胞無TrkB mRNA表達(dá)（圖6）。討 論姜黃素是從草本植物姜黃的根莖中提取出來的一種

18、酚類色素，其抗癌作用倍受矚目，它主要通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、調(diào)控癌基因和抑癌基因的表達(dá)、誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡等機制發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)5，6。近年來國外學(xué)者將姜黃素的研究延伸到防治MM中。Alok等7，8證實，姜黃素下調(diào)NF-B及由NF-B調(diào)節(jié)的基因產(chǎn)物IB、Bcl-2、Bcl-xl、cycle D1和IL-6，將細(xì)胞周期阻滯于G1/S，繼而抑制MM細(xì)胞系的增殖；從MM患者骨髓中分離的CD138+細(xì)胞常規(guī)表達(dá)活化形式的NF-B和STAT3，姜黃素能抑制這些轉(zhuǎn)錄因子的活性、削弱細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和黏附于骨髓基質(zhì)細(xì)胞的能力。    血管新生在MM的發(fā)生發(fā)展中占重要地位，

19、以抑制血管新生為目標(biāo)的治療已成為難治性/復(fù)發(fā)性MM的重要著眼點。有研究表明姜黃素具有抗血管新生的活性9，10，Passos等11在對激光誘導(dǎo)的脈絡(luò)膜血管新生大鼠動物模型的研究中發(fā)現(xiàn)，膜內(nèi)注射姜黃素能有效抑制脈絡(luò)膜的血管新生。Thaloor等9的試驗表明，姜黃素能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞小管形成，在內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生過程中充當(dāng)血管新生阻滯劑的角色。然而，姜黃素是否能抑制MM的血管新生，在國內(nèi)外尚無人研究。    內(nèi)皮細(xì)胞遷移試驗和小管形成試驗是評價體外內(nèi)皮細(xì)胞血管形成能力的兩種重要指標(biāo)。在本實驗中100 ng/ml的BDNF能夠有效地促進內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和小管形成，而姜黃素可明顯

20、阻斷BDNF誘導(dǎo)的這一血管新生效應(yīng)，并呈劑量依賴性。另外，我們以往的研究結(jié)果證實，BDNF是一種具有促進血管新生活性的細(xì)胞因子，且與MM有著密切的聯(lián)系，高表達(dá)于MM患者外周血血漿中，其升高趨勢與VEGF的升高趨勢具有相關(guān)性1，2。因此推測姜黃素可能會通過抑制BDNF誘導(dǎo)的血管新生而起到治療MM的作用。    通過阻斷血管新生的方法來防治腫瘤的關(guān)鍵在于下調(diào)血管新生因子，阻斷腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的相互作用，繼而抑制血管新生。Pollmann等12指出，姜黃素通過下調(diào)HL-60與HeLa細(xì)胞c-jun蛋白的表達(dá)，減少大約75%  VEGF蛋白的分泌，達(dá)到抗腫瘤

21、、抗血管新生的效應(yīng)。本實驗數(shù)據(jù)顯示，在MM細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中，在轉(zhuǎn)錄水平上能分別檢測到BDNF及其特異性的受體TrkB的表達(dá)，而姜黃素能同時阻斷兩種細(xì)胞中目標(biāo)產(chǎn)物的表達(dá)，兩者均呈時間-劑量依賴性。眾所周知，腫瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子與內(nèi)皮細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合是血管新生的始動因素，姜黃素同時下調(diào)兩種細(xì)胞BDNF和TrkB表達(dá)，必然阻礙了MM細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞通過BDNF介導(dǎo)的生物信息的傳遞。    綜上所述，BDNF是一種具有促進血管增殖活性的細(xì)胞因子，姜黃素可以分別下調(diào)MM細(xì)胞BDNF與內(nèi)皮細(xì)胞TrkB的表達(dá)，阻礙兩者間的相互作用，從而抑制血管新生，這可能成為治療MM潛

22、在的作用靶點。 【參考文獻】  1王雅丹，胡豫，魏文寧等. 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子在多發(fā)性骨髓瘤患者血漿中的表達(dá).臨床血液學(xué)雜志，2004；17: 82-862胡豫，孫春艷，王雅丹等. 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）在多發(fā)性骨髓瘤患者血漿中的表達(dá)增高及其意義的初步研究. 中國實驗血液學(xué)雜志，2005；13: 104-1093Sharma GD，He JC，Bazan HE. p38 and ERK1/2 coordinate cellular migration and proliferation in epithelial wound healing: evidence of

23、 cross-talk activation between MAP kinase cascades. J Biol Chem，2003；278: 21989-219974Yahata Y，Shirakata Y，Tokumaru S，et al. Nuclear translocation of phosphorylated STAT3 Is essential for vascular endothelial growth factor-induced human dermal microvascular endothelial cell migration and tube format

24、ion. J Biol Chem，2003；278: 40026-400315陳偉紅，陳燕，谷俊俠等. 姜黃素對K562細(xì)胞STAT5信號分子的影響. 中華血液學(xué)雜志，2004；25：151-1536吳裕丹，陳燕，何靜等. 姜黃素在急性髓性白血病HL-60細(xì)胞中對凋亡調(diào)控蛋白Bax、Bak、Mcl-1的影響. 同濟醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2001；30：25-277Bharti AC，Donato N，Singh S，et al. Curcumin (diferuloylmethane) down-regulates the constitutive activation of nuclear factor-B and IB kinase in human multiple myeloma cells，leading to suppression of proliferation and induction of apoptosis. Blood，2003；101: 1053-10628Bharti AC，Shishodia S，Reuben JM，et al. Nuclear factor-B and STAT3 are constitutively active i