三代基因組測序技術(shù)原理簡介

1、三代基因組測序技術(shù)原理簡介摘要：從1977年第一代DA測序技術(shù)（Sanger法）'，開展至今三十多年時間，測序技術(shù)已取得了相當(dāng)大的開展，從笫一代到第三代乃至笫四代，測序讀長從長到短，再從短到長。雖然就當(dāng)前形勢看來第二代短讀長測序技術(shù)在全球測序市場上仍然占有著絕對的優(yōu)勢位置，但第三和第四代測序技術(shù)也已在這一兩年的時間中快速開展著。測序技術(shù)的每一次變革，也都對基因組研究，疾病醫(yī)療研究,藥物研發(fā)，育種等領(lǐng)域產(chǎn)生巨大的推動作用。在這里我主要對當(dāng)前的測序技術(shù)以及它們的測序原理做一個簡單的小結(jié)。生命體遺傳信息的快速獲得對于生命科學(xué)的研究有著十分重要的意義。以上（圖1）所描述的是自沃森和克里克在19

2、53年建立DA雙螺旋結(jié)構(gòu)以來，整個測序技術(shù)的開展歷程。第一代測序技術(shù)第一代DNA測序技術(shù)用的是1975年由桑格（Sanger）和考爾森（Coulson）開創(chuàng)的鏈終止法或者是19761977年由馬克西姆（Maxam）和吉爾伯特（Gilbert）創(chuàng)造的化學(xué)法（鏈降解）.并在1977年，桑格測定了第一個基因組序列，是噬菌體X174的，全長5375個堿基、自此，人類獲得了窺探生命遺傳差異本質(zhì)的能力，并以此為開端步入基因組學(xué)時代。研究人員在Sanger法的多年實(shí)踐之中不斷對其進(jìn)行改良。在2001年，完成的首個人類基因組圖譜就是以改良了的Sanger法為其測序根底，Sanger法核心原理是：由于ddNTP

3、的2'和3'都不含羥基，其在DA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以用來中斷DA合成反響，在4個DA合成反響體系中分別參加一定比例帶有放射性同位素標(biāo)記的ddTP（分為：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP）,通過凝膠電泳和放射自顯影后可以根據(jù)電泳帶的位置確定待測分子的DA序列（圖2）。這個網(wǎng)址為sanger測序法制作了一個小短片，形象而生動。值得注意的是，就在測序技術(shù)起步開展的這一時期中，除了Sanger法之外還出現(xiàn)了一些其他的測序技術(shù)，如焦磷酸測序法、鏈接酶法等。其中，焦磷酸測序法是后來Roche公司454技術(shù)所使用的測序方法一，而連接酶測序法是后來ABI公司S

4、OLID技術(shù)使用的測序方法但他們的共同核心手段都是利川了Sange/中的可中斷DNA合成反響的dNTPoDr. Fred SangerFrederick danger woi awarded the prize in both 1958 and 1980. He is the fourth person in the world to have been awarded two Nobel Prizes and the onfy person to receive both in chemistry."dideoxy"sequencingtechniqueJSangeret

5、aU1977)DNA雙脫氧鏈終止法測序 I»CMtMrtiOO O<DNA with unknown圖2：Sanger法測序原理第二代測序技術(shù)(asm OEOC003d 30。First Generation SequencingSecond GenerationSequencing10總的說來，第一代測序技術(shù)的主要特點(diǎn)是測序讀長可達(dá)lOOObp,準(zhǔn)確性高達(dá)99.999%,但其測序本錢高，通量低等方面的缺點(diǎn)，嚴(yán)重影響了其真正大規(guī)模的應(yīng)用。因而第一代測序技術(shù)并不是最理想的測序方法。經(jīng)過不斷的技術(shù)開發(fā)和改良，以Roche公司的454技術(shù)、illumina公司的Solexa,Hise

6、q技術(shù)和ABI公司的Solid技術(shù)為標(biāo)記的第二代測序技術(shù)誕生了。第二代測序技術(shù)大大降低了測序本錢的同時，還大幅提高了測序速度，并且保持了高準(zhǔn)確性，以前完成一個人類基因組的測序需要3年時間，而使用二代測序技術(shù)那么僅僅需要1周，但在序列讀長方面比起第一代測序技術(shù)那么要短很多。表1和圖3對笫一代和笫二代測序技術(shù)各自的特點(diǎn)以及測序本錢作了一個簡單的比擬,以下我將對這三種主要的笫二代測序技術(shù)的主要原理和特點(diǎn)作一個簡單的介紹。Illumine圖3.測序本錢的變化Illumina公司的Solexa和Hiseq應(yīng)該說是目前全球使用量最大的第二代測序機(jī)器，這兩個系列的技術(shù)核心原理是相同的斗。這兩個系列的機(jī)器采用

7、的都是邊合成邊測序的方法，它的測序過程主要分為以下4步，如圖4.(1) DNA待測文庫構(gòu)建利用超聲波把待測的DNA樣本打斷成小片段，目前除了組裝之外和一些其他的特殊要求之外,主要是打斷成200-500bp長的序列片段，并在這些小片段的兩端添加上不同的接頭，構(gòu)建出單鏈DNA文庫。(2) FlowcellFlowcell是用于吸附流動DA片段的槽道，當(dāng)文庫建好后，這些文庫中的DA在通過flowcell的時候會隨機(jī)附著在flowcell外表的channel上。每個Flowcell有8個channel,每個channel的外表都附有很多接頭，這些接頭能和建庫過程中加在DNA片段兩端的接頭相互配對(這就

8、是為什么flowcell能吸附建庫后的DNA的原因)，并能支持DA在其外表進(jìn)行橋式PCR的擴(kuò)增。(3)橋式PCR擴(kuò)增與變性橋式PCR以Flowcell外表所固定的接頭為模板，進(jìn)行橋形擴(kuò)增，如圖4.a所示。經(jīng)過不斷的擴(kuò)增和變性循環(huán)，最終每個DNA片段都將在各自的位置上集中成束，每一個束都含有單個DA模板的很多分拷貝，進(jìn)行這一過程的目的在于實(shí)現(xiàn)將堿基的信號強(qiáng)度放大，以到達(dá)測序所需的信號要求。(4)測序測序方法采用邊合成邊測序的方法。向反響體系中同時添加DNA聚合酶、接頭引物和帶有堿基特異熒光標(biāo)記的4中dNTP(如同Sanger測序法)。這些dNTP的3'-OH被化學(xué)方法所保護(hù)，因而每次只能

9、添加一個dNTP。在dTP被添加到合成鏈上后，所有未使用的游離dTP和DNA聚合酶會被洗脫掉。接著，再參加激發(fā)熒光所需的緩沖液，用激光激發(fā)熒光信號，并有光學(xué)設(shè)備完成熒光信號的記錄，最后利用計(jì)算機(jī)分析將光學(xué)信號轉(zhuǎn)化為測序堿基。這樣熒光信號記錄完成后，再參加化學(xué)試劑淬滅熒光信號并去除dNTP3'-0H保護(hù)基團(tuán)，以便能進(jìn)行下一輪的測序反響。Illumina的這種測序技術(shù)每次只添加一個dNTP的特點(diǎn)能夠很好的地解決同聚物長度的準(zhǔn)確測量問題，它的主要測序錯誤來源是堿基的替換，目前它的測序錯誤率在1%-1.5%之間，測序周期以人類基因組重測序?yàn)槔?0x測序深度大約為1周。Prepare geno

10、mic DNA sampleRandomly fragment genomic DNA and ligate adapters to boch ends of the fragmentsof primersAttach DNA to surfaceBind 9 ngle-stranded fragments random ly to the nside surface of tfie flow cell channefc.NudeotklesBridge amplificationAdd unlabeled nudeclides and enzyme (olnitiace solid- pha

11、se bridge amplification.:/blog. esdn. net/dyllove98Denature the double stranded moleculesFirst chemistry cycle: determine first baseTb initiate the first sequencing cyde add all four labeled reversible terminators, primer、and DMA polymerase enzyme to the flow cell.Image of first chemistry cycleAfter

12、 laser excitation, capture the image of emitted fluorescence from each cluster on the flow cell. Record the identity of the first base for each cluster.Before initiating the next chemistry cycleThe blocked 3' terminus and thefluorophore fro(n each incorporated base are removed.Sequencereadovermu

13、ltiplechemistrycyclesRepeatcyclesofsequencingtodeterminethesequenceofbasesinagivenfragmentasinglebaseatatime,http:/blog.esdn.nct/dyllove98圖4.Illumina測序流程Roche454Roche454測序系統(tǒng)是第一個商業(yè)化運(yùn)營二代測序技術(shù)的平臺。它的主要測序原理是（圖5abc）（1） DNA文庫制備454測序系統(tǒng)的文件構(gòu)建方式和illumina的不同，它是利用噴霧法將待測DNA打斷成300-800bp長的小片段，并在片段兩端加上不同的接頭，或?qū)⒋郎yDNA變性

14、后用雜交引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，連接載體，構(gòu)建單鏈DNA文庫（圖5a）。（2） EmulsionPCR（乳液PCR,其實(shí)是一個注水到油的獨(dú)特過程）454當(dāng)然DNA擴(kuò)增過程也和illumina的截然不同，它將這些單鏈DNA結(jié)合在水油包被的直徑約28um的磁珠上，并在其上面孵育、退火。乳液PCR最大的特點(diǎn)是可以形成數(shù)目龐大的獨(dú)立反響空間以進(jìn)行DNA擴(kuò)增。其關(guān)鍵技術(shù)是“注水到油"（水包油），根本過程是在PCR反響前，將包含PCR所有反響成分的水溶液注入到高速旋轉(zhuǎn)的礦物油外表，水溶液瞬間形成無數(shù)個被礦物油包裹的小水滴。這些小水滴就構(gòu)成了獨(dú)立的PCR反響空間。理想狀態(tài)下，每個小水滴只含一個DNA模

15、板和一個磁珠。這些被小水滴包被的磁珠外表含有與接頭互補(bǔ)的DNA序列，因此這些單鏈DNA序列能夠特異地結(jié)合在磁珠上。同時孵育體系中含有PCR反響試劑，所以保證了每個與磁珠結(jié)合的小片段都能獨(dú)立進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且擴(kuò)增產(chǎn)物仍可以結(jié)合到磁珠上。當(dāng)反響完成后，可以破壞孵育體系并將帶有DNA的磁珠富集下來。進(jìn)過擴(kuò)增，每個小片段都將被擴(kuò)增約100萬倍，從而到達(dá)下一步測序所要求的DNA量。（3）焦磷酸測序測序前需要先用一種聚合酶和單鏈結(jié)合蛋白處理帶有DNA的磁珠，接著將磁珠放在一種PTP平板上。這種平板上特制有許多直徑約為44um的小孔，每個小孔僅能容納一個磁珠，通過這種方法來固定每個磁珠的位置，以便檢測接下

16、來的測序反響過程。測序方法采用焦磷酸測序法，將一種比PTP板上小孔直徑更小的磁珠放入小孔中，啟動測序反響。測序反響以磁珠上大量擴(kuò)增出的單鏈DNA為模板，每次反響參加一種dNTP進(jìn)行合成反響。如果dNTP能與待測序列配對，那么會在合成后釋放焦磷酸基團(tuán)。釋放的焦磷酸基團(tuán)會與反響體系中的ATP硫酸化學(xué)酶反響生成ATPo生成的ATP和熒光素酶共同氧化使測序反響中的熒光素分子并發(fā)出熒光，同時由PTP板另一側(cè)的CCD照相機(jī)記錄，最后通過計(jì)算機(jī)進(jìn)行光信號處理而獲得最終的測序結(jié)果。由于每一種dNTP在反響中產(chǎn)生的熒光顏色不同，因此可以根據(jù)熒光的顏色來判斷被測分子的序列。反響結(jié)束后，游離的dNTP會在雙磷酸酶的

17、作用下降解ATP,從而導(dǎo)致熒光淬滅，以便使測序反響進(jìn)入下一個循環(huán)。由于454測序技術(shù)中，每個測序反響都在PTP板上獨(dú)立的小孔中進(jìn)行，因而能大大降低相互間的干擾和測序偏差。454技術(shù)最大的優(yōu)勢在于其能獲得較長的測序讀長，當(dāng)前454技術(shù)的平均讀長可達(dá)400bp,并且454技術(shù)和illumina的Solexa和Hiseq技術(shù)不同，它最主要的一個缺點(diǎn)是無法準(zhǔn)確測量同聚物的長度，如當(dāng)序列中存在類似于PolyA的情況時，測序反響會一次參加多個T,而所參加的T的個數(shù)只能通過熒光強(qiáng)度推測獲得，這就有可能導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。也正是由于這一原因，454技術(shù)會在測序過程中引入插入和缺失的測序錯誤。aDNA Ifcrar

18、y preparationGenome fragmented bynebulizationNo cloning: no colony pickingsstDNA library created with adaptorsWB fragments selected using avidm-biotin purificationgDNA> sstDNA libraryhttp:/blog. csdn. nct/dyllove9«Emulsion PCR8 hoursAnneal sstDNA to an excess of DMA capture beadsEmulsify bea

19、ds and PCR reagents in water-in-oil microreactorsClonal amplification occurs inside microreactorsBreak miaoreactors and enrich for DNA-positive beadssstDNA library型映翔腌4，現(xiàn)）助陽的73Sequencing75 hoursWell diameter: average of 44 pm 400,000 reads obtained in parallel A single cloned amplified sstDNA bead i

20、s deposited per wellAmplified sstDNA library beads+40峋fil哈edba弼圖5.Roche454測序流程1. Solid 技術(shù)Solid測序技術(shù)是ABI公司于2007年開始投入用于商業(yè)測序應(yīng)用的儀器。它基于連接酶法,即利用DNA連接酶在連接過程之中測序（圖6） 2,它的原理是:aSOLiD substratePl adapterTemplate sequenceDi base probesy TTnnn,rzzS'3,TCnnhZ2z5, 3rTCnnnzzzS- ! .VTAnnnzzzS'Template2nd bae A

21、 C G TCleavage site5. Repeat steps 1 -4 to extend sequenceLigation cycle 127 . (n cycles)Universal seq primer (n)扁3,P1 adapter TA Template sequence6. Primer reset2. ImageFluorescenceExciteTA1Tm 義 " f 而H" ?Universal seq primer (n-1)3'wvwwwvvwwvw . 2. Primer reset / 1 Melt off extended J

22、 sequence ,/ 1 pmijijujuiuijuiiiiiiu3'3. Cap unextended strands4. Cleave off fluor8. Repeat Reset with, n-2, n-3r n-4 primers Read position I o I 11 2 Iio12131415161718192021222324252628293031 323313435puno一a>E-EdUniversal seq primer (n)3 Universal seq primer (n-1)3 Bridge probeUniversal seq

23、primer (n-2)3 mimiimimi4 Universajeqpnmertn-S) Brdge prcbe5 UnirsaHeq primer (X) Indicates positions of interrogation炯ioncyd*莉向上養(yǎng) csdE net，dy圖6-a. Solid測序技術(shù)（1）DNA文庫構(gòu)建片段打斷并在片段兩端加上測序接頭，連接載體，構(gòu)建單鏈DA文庫。EmulsionPCRSolid的PCR過程也和454的方法類似，同樣采用小水滴emulsionPCR,但這些微珠比起454系統(tǒng)來說那么要小得多，只有l(wèi)um0在擴(kuò)增的同時對擴(kuò)增產(chǎn)物的3'端進(jìn)行修飾，

24、這是為下一步的測序過程作的準(zhǔn)備。3'修飾的微珠會被沉積在一塊玻片上。在微珠上樣的過程中，沉積小室將每張玻片分成1個、4個或8個測序區(qū)域（圖6-a）。Solid系統(tǒng)最大的優(yōu)點(diǎn)就是每張玻片能容納比454更高密度的微珠，在同一系統(tǒng)中輕松實(shí)現(xiàn)更高的通量。（3）連接酶測序這一步是Solid測序的獨(dú)特之處。它并沒有采用以前測序時所常用的DNA聚合酶，而是采用了連接酶。Solid連接反響的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物，這里將其簡單表示為：3'-XXnnnzzz-5'。連接反響中，這些探針按照堿基互補(bǔ)規(guī)那么與單鏈DNA模板鏈配對。探針的5'末端分別標(biāo)記了CY5、TexasRe

25、d、CY3、6-FAM這4種顏色的熒光染料（圖6-a）這個8堿基單鏈熒光探針中，第1和第2位堿基（XX）上的堿基是確定的，并根據(jù)種類的不同在6-8位（zzz）上加上了不同的熒光標(biāo)記。這是Solid的獨(dú)特測序法，兩個堿基確定一個熒光信號，相當(dāng)于一次能決定兩個堿基。這種測序方法也稱之為兩堿基測序法。當(dāng)熒光探針能夠與DNA模板鏈配對而連接上時，就會發(fā)出代表第1,2位堿基的熒光信號，圖6-a和圖6-b中的比色版所表示的是第1,2位堿基的不同組合與熒光顏色的關(guān)系。在記錄下熒光信號后，通過化學(xué)方法在第5和第6位堿基之間進(jìn)行切割，這樣就能移除熒光信號，以便進(jìn)行下一個位置的測序。不過值得注意的是，通過這種測序

26、方法，每次測序的位置都相差5位。即第一次是第1、2位，笫二次是第6、7位在測到末尾后，要將新合成的鏈變性,洗脫。接著用引物n-L進(jìn)行第二輪測序。引物n-L與引物n的區(qū)別是，二者在與接頭配對的位置上相差一個堿基（圖6-a.8）。也即是，通過引物n-1在引物n的根底上將測序位置往3'端移動一個堿基位置，因而就能測定第0、1位和第5、6位第二輪測序完成，依此類推，直至第五輪測序，最終可以完成所有位置的堿基測序，并且每個位置的堿基均被檢測了兩次。該技術(shù)的讀長在2X50bp,后續(xù)序列拼接同樣比擬復(fù)雜。由于雙次檢測，這一技術(shù)的原始測序準(zhǔn)確性高達(dá)99.94%,而15x覆蓋率時的準(zhǔn)確性更是到達(dá)了99.

27、999%,應(yīng)該說是目前第二代測序技術(shù)中準(zhǔn)確性最高的了。但在熒光解碼階段，鑒于其是雙堿基確定一個熒光信號，因而一旦發(fā)生錯誤就容易產(chǎn)生連鎖的解碼錯誤。Data collection and image analysisCollect Identify Identifycolor image beads bead colorPrimer round lf ligation cycle 1Primer round 2f ligation cycle 1Primer round 3f ligation cycle 1Primer round 4, ligation cycle 1Color space

28、for this sequencePossibledinucleotidesencodedbyeachcolor2nd base3J/WTemplate sequence A c G T A c G TJ c A汀G一 A c G K T G c A A c G TDouble interrogationWith 2 base encoding each base is defined twiceDecodingBase zeroColor space sequenceTA AC AA（GA）GC CA CCCG GTTCAGCTPossible dinucleotidesAT TG GG G

29、AI Y Y YlA T G GADecodedsequenceBase$pacesequertp：/bl0gCSdnHet/dy110Ve98圖6-b.So6d測序技術(shù)第三代測序技術(shù)測序技術(shù)在近兩三年中乂有新的里程碑。以PacBio公司的SMRT和OxfordNanoporeTechnologies納米孔單分子測序技術(shù)，被稱之為第三代測序技術(shù)。與前兩代相比,他們最大的特點(diǎn)就是單分子測序,測序過程無需進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中PacBioSMRT技術(shù)其實(shí)也應(yīng)用了邊合成邊測序的思想:并以SMRT芯片為測序載體。根本原理是：DNA聚合酶和模板結(jié)合,4色熒光標(biāo)記4種堿基（即是dTP）,在堿基配對階段，不同

30、堿基的參加，會發(fā)出不同光，根據(jù)光的波長與峰值可判斷進(jìn)入的堿基類型。同時這個DNA聚合酶是實(shí)現(xiàn)超長讀長的關(guān)鍵之一,讀長主要跟酶的活性保持有關(guān),它主要受激光對其造成的損傷所影響。PacBioSMRT技術(shù)的一個關(guān)鍵是怎樣將反響信號與周圍游離堿基的強(qiáng)大熒光背景區(qū)別出來。他們利用的是ZMW（零模波導(dǎo)孔）原理：如同微波爐壁上可看到的很多密集小孔。小孔直徑有考究，如果直徑大于微波波長，能量就會在衍射效應(yīng)的作用下穿透面板而泄露出來，從而與周圍小孔相互干擾。如果孔徑小于波長，能量不會輻射到周圍，而是保持直線狀態(tài)（光衍射的原理），從而可起保護(hù)作用。同理，在一個反響管（SMRTCell:單分子實(shí)時反響孔）中有許多這

31、樣的圓形納米小孔，即ZMW（零模波導(dǎo)孔），外徑100多納米，比檢測激光波長小（數(shù)白納米），激光從底部打上去后不能穿透小孔進(jìn)入上方溶液區(qū)，能量被限制在一個小范圍（體積20X10-21L）里，正好足夠覆蓋需要檢測的局部，使得信號僅來自這個小反響區(qū)域，孔外過多游離核甘酸單體依然留在黑暗中，從而實(shí)現(xiàn)將背景降到最低。另外，可以通過檢測相鄰兩個堿基之間的測序時間，來檢測一些堿基修飾情況，既如果堿基存在修飾，那么通過聚合酶時的速度會減慢，相鄰兩峰之間的距離增大，可以通過這個來之間檢測甲基化等信息（圖7）。SMRT技術(shù)的測序速度很快，每秒約10個dTP。但是，同時其測序錯誤率比擬高（這幾乎是目前單分子測序技術(shù)

32、的通?。_(dá)到15%,但好在它的出錯是隨機(jī)的，并不會像第二代測序技術(shù)那樣存在測序錯誤的偏向，因而可以通過屢次測序來進(jìn)行有效的糾錯。A圖7.PacBioSMRT測序原理OxfordNanoporeTechnologies公司所開發(fā)的納米單分子測序技術(shù)與以往的測序技術(shù)皆不同，它是基于電信號而不是光信號的測序技術(shù)5。該技術(shù)的關(guān)鍵之一是，他們設(shè)計(jì)了一種特殊的納米孔，孔內(nèi)共價結(jié)合有分子接頭。當(dāng)DNA堿基通過納米孔時，它們使電荷發(fā)生變化，從而短暫地影響流過納米孔的電流強(qiáng)度（每種堿基所影響的電流變化幅度是不同的），靈敏的電子設(shè)備檢測到這些變化從而鑒定所通過的堿基（圖8）。該公司在去年基因組生物學(xué)技術(shù)進(jìn)展年會

33、（AGBT）上推出第一款商業(yè)化的納米孔測序儀，引起了科學(xué)界的極大關(guān)注。納米孔測序（和其他第三代測序技術(shù)）有望解決目前測序平臺的缺乏，納米孔測序的主要特點(diǎn)是：讀長很長，大約在幾十kb,甚至100kb;錯誤率目前介于1%至4%,且是隨機(jī)錯誤，而不是聚集在讀取的兩端;數(shù)據(jù)可實(shí)時讀取;通量很高（30x人類基因組有望在一天內(nèi)完成）；起始DNA在測序過程中不被破壞；以及樣品制備簡單又廉價。理論上，它也能直接測序RNA。納米孔單分子測序計(jì)算還有另一大特點(diǎn)，它能夠直接讀取出中基化的胞喀咤，而不必像傳統(tǒng)方法那樣對基因組進(jìn)行bisulfite處理。這對于在基因組水平直接研究表觀遺傳相關(guān)現(xiàn)象有極大的幫助。并且改方法

34、的測序準(zhǔn)確性可達(dá)99.8%,而且一旦發(fā)現(xiàn)測序錯誤也能較容易地進(jìn)行糾正。但目前似乎還沒有應(yīng)用該技術(shù)的相關(guān)報道。圖&納米孔測序其他測序技術(shù)目前還有一種基于半導(dǎo)體芯片的新一代革命性測序技術(shù)一一IonTorrent%該技術(shù)使用了一種布滿小孔的高密度半導(dǎo)體芯片，一個小孔就是一個測序反響池。當(dāng)DA聚合酶把核昔酸聚合到延伸中的DNA鏈上時，會釋放出一個氫離子，反響池中的PH發(fā)生改變，位于池下的離子感受器感受到H+離子信號，H+離子信號再直接轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，從而讀出DNA序列圖9）。這一技術(shù)的創(chuàng)造人同時也是454測序技術(shù)的創(chuàng)造人之一JonathanRothberg,它的文庫和樣本制備跟454技術(shù)很像，

35、甚至可以說就是454的翻版，只是測序過程中不是通過檢測焦磷酸熒光顯色，而是通過檢測H+信號的變化來獲得序列堿基信息。IonTorrent相比于其他測序技術(shù)來說，不需要昂貴的物理成像等設(shè)備，因此，本錢相對來說會低，體積也會比擬小，同時操作也要更為簡單，速度也相當(dāng)快速，除了2天文庫制作時間，整個上機(jī)測序可在2-3.5小時內(nèi)完成，不過整個芯片的通量并不高，目前是10G左右，但非常適合小基因組和外顯子驗(yàn)證的測序。Prepare GdrtOmiC bbraryPrepare TcmpW on BeadSequence on Ion Chap圖 9. Ion Torrent小結(jié)以上，對各代測序技術(shù)的原理做

36、了簡要的闡述，這三代測序技術(shù)的特點(diǎn)比擬匯總在以下表1和表2中。其中測序本錢，讀長和通量是評估該測序技術(shù)先進(jìn)與否的三個重要指標(biāo)。笫一代和笫二代測序技術(shù)除了通量和本錢上的差異之外，其測序核心原理（除Solid是邊連接邊測序之外）都是基于邊合成邊測序的思想。第二代測序技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是本錢較之一代大大下降，通量大大提升，但缺點(diǎn)是所引入PCR過程會在一定程度上增加測序的錯誤率，并且具有系統(tǒng)偏向性，同時讀長也比較短。第三代測序技術(shù)是為了解決第二代所存在的缺點(diǎn)而開發(fā)的，它的根本特點(diǎn)是單分子測序，不需要任何PCR的過程，這是為了能有效防止因PCR偏向性而導(dǎo)致的系統(tǒng)錯誤，同時提高讀長，并要保持二代技術(shù)的高通量，低本

37、錢的優(yōu)點(diǎn)。表1：測序技術(shù)的比擬第X代公司平臺名稱測序方法檢測方法大約讀長（堿基數(shù)）優(yōu)點(diǎn)相對局限性第代ABI/生命技術(shù)公司3130xL-3730xL桑格-毛細(xì)管電泳測序法熒光/光學(xué)600-1000高讀長，準(zhǔn)確度一次性達(dá)標(biāo)率高，能很好處理重復(fù)序列和多聚序列通量低；樣品制備本錢高，使之難以做大量的平行測序第代貝克曼GeXP遺傳分析系統(tǒng)桑格-毛細(xì)管電泳測序法熒光/光學(xué)600-1000高讀長，準(zhǔn)確度一次性達(dá)標(biāo)率高，能很好處理重復(fù)序列和多聚序列：易小型化通量低；單個樣品的制備本錢相對較高第代Roche/454基因組測序儀FLX系統(tǒng)焦磷酸測序法光學(xué)230-400在第二代中最高讀長：比第一代的測序通量大樣品制

38、備較難：難于處理重復(fù)和同種堿基多聚區(qū)域：試劑沖洗帶來錯誤累積：儀器昂貴第代IlluminaHiSeq2000,HiSeq2500/MiSeq可逆鏈終止物和合成測序法熒光/光學(xué)2x150很高測序通量儀器昂貴；用于數(shù)據(jù)刪行和分析的費(fèi)用很高第代ABI/Solid5500xlSolid系統(tǒng)連接測序法熒光/光學(xué)25-35很高測序通量：在廣為接受的幾種第二代平臺中，所要拼接出人類基因組的試劑本錢最低測序運(yùn)行時間長；讀長短，造成本錢高，數(shù)據(jù)分析困難和基因組拼接困難；儀器昂貨第代赫利克斯Heliscope單分子合成測序法熒光/光學(xué)25-30高通量：在第二代中屬于單分子性質(zhì)的測序技術(shù)讀長短，推高了測序本錢，降低

39、了基因組拼接的質(zhì)量；儀器非常昂貴第代太平洋生物科學(xué)公司PacBioRS實(shí)時單分子DNA測序熒光/光學(xué)"1000高平均讀長，比第一代的測序時間降低：不需要擴(kuò)增：最長單個讀長接近3000減基并不能高效地將DNA聚合酶加到測序陣列中；準(zhǔn)確性一次性達(dá)標(biāo)的時機(jī)低（81-83%）：DNA聚合酶在陣列中降解；總體上每個堿基測序本錢高（儀器昂貴）；第代全基因組學(xué)公司GeXP遺傳分析系統(tǒng)復(fù)合探針錨雜交和連接技術(shù)熒光/光學(xué)10在第三代中通量最高：在所有測序技術(shù)中，用于拼接一個人基因組的試劑本錢最低；每個測序步驟獨(dú)立，使錯誤的累積變得最低低讀長；模板制備阻礙長重復(fù)序列區(qū)域測序：樣品制備費(fèi)事：尚無商業(yè)化供給

40、的儀器第代IonTorrent/生命技術(shù)公司個人基因組測序儀（PGM）合成測序法以離子敏感場效應(yīng)晶體管檢測pH值變化100-200對核酸堿基的摻入可直接測定：在自然條件下進(jìn)行DNA合成（不需要使用修飾過的堿基）一步步的洗脫過程可導(dǎo)致錯誤累積；閱讀高重復(fù)和同種多聚序列時有潛在困難：第代牛津納米孔公司gridlON納米孔外切酶測序電流尚未定量有潛力到達(dá)高讀長；可以本錢生產(chǎn)納米孔；無需熒光標(biāo)記或光學(xué)手段切斷的核甘酸可能被讀錯方向：難于生產(chǎn)出帶多重平行孔的裝置表2：主流測序機(jī)器的本錢測序比擬InslrumentPurchasecostAdditionaliixstruinents*ServicecontracthComputationalresources4.Datafilesizes(GB)dPrimaryerrorsErrorrate(%r373(1x1(capillary)»76$19.8Desktop().03Substitution0.1-1454GSJr.Titanium$108$16$12.6$5(desktop)<3images,<1sffIndd1454FLXTitanium$500$30$50.0$5(desktop)20images,4sffIndeli4