實(shí)驗(yàn)一生活污水(含藥廠廢水)的細(xì)菌學(xué)檢查(綜合性實(shí)驗(yàn))

1、實(shí)驗(yàn)一生活污水 (含藥廠廢水) 的細(xì)菌學(xué)檢查 (綜合性實(shí)驗(yàn))實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?. 學(xué)習(xí)水樣的采取方法和水樣中細(xì)菌總數(shù)測定的方法2 了解水源水的平板菌落計(jì)數(shù)的原則3.了解 PCR 技術(shù)監(jiān)測污染水體大腸埃希菌的意義和基本原理4掌握 PCR 操作技術(shù)實(shí)驗(yàn)材料：1培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。2材料 水樣3儀器及其他用具 恒溫培養(yǎng)箱、三角燒瓶，帶玻璃塞瓶，培養(yǎng)皿，移液器(1mL )，移液管(1mL )，試管等，PCR儀，水浴鍋，培養(yǎng)箱，電泳儀，自動(dòng)微量移液器(各型號)，濾膜，PCR 管，離心管， Whatman 3MM 濾紙或相當(dāng)產(chǎn)品。4. 試劑及溶液 含有適當(dāng)抗菌素的 LB 培養(yǎng)基， Taq DNA 聚

2、合酶，正向引物(20 mol/L )及反向引物 (20 mol/L )溶于水中， DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)，乙酸銨( l0mol/L )，無水乙醇，TSEL (50mmol/L Tris-HCl ， pH8.0 ， 20%蔗糖， 50mmol/L EDTA ， 1 g/ l 溶菌酶)，SSK (50mmo1/L NaCl, 1%SDS, 3mg/mL 蛋白酶 K)，TE 緩沖液，10 X 擴(kuò)增緩沖液(500mmol/L KCl , 100 mmol/L Tris-HCI , 15mmol/L , MgC1 2)。4種dNTP貯存液(20mmoI/L , pH8.0 )，瓊脂糖溶液(0.7%),電泳緩

3、沖液(1 X TAE)，溴化乙錠染色液，6 X凝膠上樣緩沖液。4.儀器及其他用具實(shí)驗(yàn)原理：本實(shí)驗(yàn)采用平板菌落計(jì)數(shù)技術(shù)測定水中細(xì)菌總數(shù)。由于水中細(xì)菌種類繁多， 它們對營養(yǎng)E.。 PCR和其他生長條件的要求差別很大， 不可能找到一種培養(yǎng)基在一種條件下， 使水中所有的細(xì)菌 均能生長繁殖。 因此， 以一定的培養(yǎng)基平板上生長出來的菌落計(jì)算得到的水中細(xì)菌總數(shù)僅是 一種近似值。目前一般是采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基測定水中細(xì)菌總數(shù)。大腸埃希菌( Escherichia coli )是指示糞便污染的重要指示物。當(dāng)水體中出現(xiàn)大量的 coli 就說明近期內(nèi)水體受到了糞便污染(因其脫離寄主后，其半存留期會(huì)大大縮短)檢

4、測這種微生物非常靈敏，即使每 100mL 水中只有一個(gè)個(gè)體，也能被檢驗(yàn)出來。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：一)細(xì)菌總數(shù)測定自來水(1)用滅菌移液管或移液器吸取 lmL 水樣，注入滅菌培養(yǎng)皿中。分別傾注約15mL已融化并冷卻到 45C左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，并立即在桌上作平面旋搖，使水樣與培養(yǎng)基充分混勻。(3)另取一空的滅菌培養(yǎng)皿，傾注牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基15mL ，作空白對照。(4)培養(yǎng)基凝固后，倒置于37C溫箱中，培養(yǎng)24h,進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。兩個(gè)平板的平均菌落數(shù)即為 lmL 水樣的細(xì)菌總數(shù)。池水、河水或湖水等1 )稀釋水樣： 取 3 個(gè)滅菌空試管， 分別加入 9mL 滅菌水。 取 lmL 水樣注入第一管

5、9mL滅菌水內(nèi)、搖勻，再自第一管取 lmL 至下一管滅菌水內(nèi)，如此稀釋到第三管，稀釋度分別為 10-1， 10-2 與 10-3。稀釋倍數(shù)看水樣污染程度而定，以培養(yǎng)后平板的菌落數(shù)在30300 個(gè)之間的稀釋度最為合適，若三個(gè)稀釋度的菌數(shù)均多到無法計(jì)數(shù)或少到無法計(jì)數(shù)，則需繼續(xù)稀釋或減小稀釋倍數(shù)。一般中等污染水樣，取10-1 ， 10-2,10-3 三個(gè)連續(xù)稀釋度，污染嚴(yán)重的取 10-2， 10-3， 10-4三個(gè)連續(xù)稀釋度。(2)自最后三個(gè)稀釋度的試管中各取 1mL 稀釋水加入空的滅菌培養(yǎng)皿中。每一稀釋度做兩個(gè)培養(yǎng)皿。(3)各傾注15mL己融化并冷卻至 50C左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，立即放在

6、桌上搖勻。(4)凝固后倒置于37C培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h.。菌落計(jì)數(shù)方法(1)先計(jì)算相同稀釋度的平均菌落數(shù)。 若其中一個(gè)平板有較大片狀菌苔生長時(shí)， 則不應(yīng)采用，而應(yīng)以無片狀菌苔生長的平板作為該稀釋度的平均菌落數(shù)。(2)選擇平均菌落數(shù)在 30300 之間的，當(dāng)只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，則以該平均菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)即為該水樣的細(xì)菌總數(shù)。(3)若有兩個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)均在 30300之間，則按兩者菌落總數(shù)之比值來決定。若其比值小于 2，應(yīng)采取兩者的平均數(shù)；若大于2，則取其中較小的菌落總數(shù)。(4)若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于 300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。(5) 若

7、所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。(6) 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30300之間，則以”近 300或30 的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。(二)應(yīng)用PCF技術(shù)監(jiān)測污染水體大腸埃希菌1水樣的處理及模板 DNA 的制備(1)取水樣 lmL ，低速 (2 000 r/min ) 離心 5min ，以除去不溶性雜質(zhì)。 取出上清， 經(jīng) 6 000 r/min離心 5min ，收集菌體。(2)將菌體懸于100 ITSEL溶液中，置37C水浴作用30 min。(3)向反應(yīng)混合物中加入 300 I SSK溶液，置37 C繼續(xù)作用60 min。(4)向反應(yīng)混合物中加入

8、2倍體積的無水乙醇，搖勻后置-20C, 2h. 12 000 r/min離心15 min ,收集沉淀，室溫晾干后將沉淀物溶于 100300 l 無菌去離子水或 TE 緩沖液中備用。如果是純培養(yǎng)的菌落，即將菌落挑入100 l無菌去離子水中，加熱煮沸l(wèi)min ,即可作為PCR 模板。2引物設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)的引物來自E. coli的lac Z和lam B基因。Iac Z 引物 1 ：ZL-1 675 (5'-ATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCC-3'引物 2：ZR-2025( 5'-GGTTTATGCAGCAACGAGACGTCA-3'lam B 引物 1：BL-4910(5'-CTGA TCGAATGGCTGCCAGGCTCC-3'引物 2 ： BR-5219 (5'-CAACCAGACGATAGTTA TCACGCA-3'3 PCR 擴(kuò)增體系按以下次序，將各成分加在 0.5mL PCR 薄壁管內(nèi)混合：l0 X擴(kuò)增緩沖液5 l20mmo1/L 4 種 dNTP 混合液(pH8.0) 1 l20 mo1/L 正向引物 2.5 l20 mo1/L 反向引物 2.5 l模板 DNA 510 lTaq DNA 聚合酶 12單位補(bǔ)足 H2O 至總體積 50 l4PCR 循環(huán)。依擴(kuò)增產(chǎn)物按以下方法進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，典型的程序