大黃素對模擬冷缺血再灌注后肝細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及細(xì)胞凋亡的影響

1、大黃素對模擬冷缺血再灌注后肝細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及細(xì)胞凋亡的影響         11-01-07 09:35:00     編輯：studa20           作者：祁翔，呂毅，沈乃營，劉昌，劉學(xué)民，王博 祁翔【摘要】  目的 研究中藥大黃素對模擬冷缺血再灌注后肝細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及細(xì)胞凋亡的影響。方法 體外培養(yǎng)肝細(xì)胞株HL7702，隨機(jī)分為對照組和大黃素

2、處理組。對照組未予大黃素處理，大黃素處理組按100、10、1mol/L分為高、中、低3個(gè)濃度組，建立模擬冷缺血再灌注模型，流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及細(xì)胞凋亡水平，分別檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液乳酸脫氫酶水平。結(jié)果 冷缺血8h再灌注6h后，高、中、低濃度大黃素處理組鈣離子熒光強(qiáng)度分別為(24.12±0.51)、(26.35±1.34)、(39.12±1.94)，均顯著低于對照組的105.29±1.01(P<0.01)。高、中、低濃度大黃素處理組細(xì)胞凋亡率分別為(5.46±0.41)%、(10.64±0.64)%、(11.9

3、0±0.50)%，均顯著低于對照組的(25.40±1.41)%(P<0.01)。高、中濃度大黃素處理組上清液LDH含量分別為(179.67±18.57)u/L、(198.83±14.22)u/L，顯著低于對照組的(351.33±34.16)u/L(P<0.01)。結(jié)論 大黃素可降低模擬冷缺血再灌注后的肝細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，抑制細(xì)胞凋亡，減輕肝細(xì)胞損傷。 【關(guān)鍵詞】  大黃素；肝細(xì)胞；冷缺血再灌注；細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度；凋亡ABSTRACT: Objective  To investigate the effect of

4、 Emodin on intracellular calcium concentration (Ca2+i) and apoptosis of hepatic cells after simulated cold ischemiareperfusion. Methods  Glucoseoxygen deprivation, low temperature, subsequent reoxygenation and rewarming were used to induce ischemiareperfusion injury model in cultured hepatic ce

5、lls which were divided into 4 groups: control group and Emodintreated group(100, 10 and 1mol/L groups). The intracellular calcium concentration (Ca2+i) and apoptosis rate were determined by flow cytometry (FCM) respectively; the content of lactate dehydrogenase (LDH) in supernatant was tested. Resul

6、ts  Intracellular calcium fluorescence intensity in Emodintreated groups of high, medium and low density was 24.12±0.51, 26.35±1.34 and 39.12±1.94, respectively, which were significantly lower than 105.29±1.01 in control group(P<0.01). Apoptosis rate in Emodintreated grou

7、ps of high, medium and low density was 0.0546±0.0041, 0.1064±0.0064 and 0.1190±0.0050, respectively, which were significantly lower than 0.2540±0.0141 in control group(P<0.01). LDH was (198.83±14.22)u/L and (179.67±18.57)u/L in Emodintreated groups of medium and high

8、 density respectively, which were significantly lower than (351.33±34.16)u/L in control group(P<0.01). Conclusion  Emodin could reduce Ca2+i and inhibit apoptosis of hepatic cells after simulated cold ischemiareperfusion, thus protecting hepatic cells effectively.KEY WORDS: Emodin; hepa

9、tic cell; ischemiareperfusion injury; intracellular free calcium concentration; apoptosis大黃素12化學(xué)結(jié)構(gòu)為1，3，8羥基6甲基蒽醌，具有抗炎、抗腫瘤、保護(hù)肝腎等多種生物學(xué)作用。有文獻(xiàn)報(bào)道34，大黃素可對細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響。鈣超載及凋亡均為缺血再灌注損傷機(jī)制之一。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)5，大黃素對肝細(xì)胞體外模擬冷缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。該保護(hù)作用是否與抑制肝細(xì)胞內(nèi)鈣超載及凋亡有關(guān)？大黃素對冷缺血再灌注后肝細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及凋亡的影響未見相關(guān)報(bào)道。本研究擬通過觀察大黃素對模擬冷缺血再灌注后

10、肝細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及凋亡的影響，初步探討其對冷缺血再灌注損傷可能的保護(hù)機(jī)制，為其在臨床肝移植中的應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1  材料與方法1.1  材料肝細(xì)胞株HL7702由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫提供；RPMI 1640培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清由杭州四季青生物工程研究所提供；混合氣體95% N24% CO21% O2由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院后勤中心提供；大黃素、Annexin凋亡試劑盒為美國SIGMA公司產(chǎn)品。AO/EB凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。Fluo3/AM鈣離子熒光探針為美國Biotium公司產(chǎn)品；LDH檢測試劑盒由南京建成

11、生物工程研究所提供。流式細(xì)胞儀型號FACSCabuliburTM USA，Olympus熒光顯微鏡型號BX51TR32FB3E01 Japan。1.2  冷缺血再灌注損傷模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 模擬冷缺血再灌注模型參照文獻(xiàn)6的方法并加以改進(jìn)：肝細(xì)胞HL7702體外培養(yǎng)至對數(shù)生長期，等量均勻接種于6孔板或25mL培養(yǎng)瓶中，給予大黃素干預(yù)，按100、10、1mol/L分為高、中、低濃度組和對照組(未予大黃素干預(yù))，培養(yǎng)24h準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)；模擬缺血：將培養(yǎng)液吸棄，等體積加入模擬缺血溶液(NaCl 98.5mmol/L、KCl 10mmol/L、NaH2PO4 0.9mmol/L、NaH

12、CO3 6.0mmol/L、CaCl2 1.8mmol/L、MgSO4 1.2mmol/L、乳酸鈉40mmol/L、HEPES 20mmol/L，pH 6.8，4)，并給予大黃素干預(yù)。再將培養(yǎng)容器放入缺氧培養(yǎng)裝置中，充入混合氣體(95% N24% CO21% O2)，待氧分壓1%時(shí)，同時(shí)關(guān)閉進(jìn)氣口與出氣口，放入4冰箱保存8h；模擬再灌注：取出培養(yǎng)容器，吸棄模擬缺血溶液，等體積加入模擬再灌注液(NaCl 129.5mmol/L、KCl 5.0mmol/L、NaH2 PO4 0.9mmol/L、NaHCO3 20mmol/L、CaCl2 1.8mmol/L、MgSO4 1.2mmol/L、葡萄糖5

13、5mmol/L、HEPES 20mmol/L，pH 7.4，37)，并給予大黃素干預(yù)，放入50mL/L CO2孵箱中37培養(yǎng)6h。1.3  細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、細(xì)胞凋亡水平及上清液乳酸脫氫酶的檢測 Fluo3/AM鈣離子熒光探針負(fù)載細(xì)胞懸液，終濃度10mol/L，37避光孵育30min，PBS洗滌兩遍重懸，流式細(xì)胞儀檢測分析，平均熒光強(qiáng)度代表細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。Annexin VPI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率(apoptosis rate)及正常細(xì)胞比例(normal cell rate)。AO/EB染色法熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，綠色熒光代表正常細(xì)胞，

14、橘紅色熒光代表凋亡細(xì)胞。上清液乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)含量的檢測嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。1.4  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)用±s表示。統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析，多重比較用LSDt檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2  結(jié)果2.1  冷缺血再灌注后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、細(xì)胞凋亡水平及上清液LDH的含量 流式細(xì)胞技術(shù)檢測結(jié)果中平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity, MFI)代表細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，模擬冷缺血再灌注后，各濃度大黃素處理組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度均顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。并且隨大黃素濃度增加，鈣離子濃度有降低趨勢，各濃度大黃素處理組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各濃度大黃素處理組細(xì)胞凋亡率顯著低于對照組，正常細(xì)胞比例顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；低濃度組與中濃度組之間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)