高效液相色譜-電噴霧串聯質譜法(LC-ESI-MS MS)檢測人血漿中羅紅霉素濃度

1、Application Note: CM0026高效液相色譜-電噴霧串聯質譜法(LC-ESI-MS/MS檢測人血漿中羅紅霉素濃度郭蓓寧 1 郁繼誠1 張菁1 曹國英1 施耀國1 劉飛2(1 復旦大學華山醫(yī)院抗生素研究所, 上海200040，2 賽默飛世爾科技應用實驗室Key Words 羅紅霉素 高效液相串聯質譜法 血藥濃度摘 要建立了人血漿中羅紅霉素的高效液相色譜電噴霧串聯質譜(LC-ESI-MS/MS檢測方法。血漿樣品經乙腈沉淀蛋白后，反相液相色譜分離凈化后進行質譜分析, 采用選擇反應監(jiān)測模式(SRM進行檢測，羅紅霉素和內標物克拉霉素的檢測離子對分別為m/z 837.5m/z 679.5和

2、m/z 748.5m/z 158.1。羅紅霉素在101,000 ng/ml濃度范圍內線性關系良好(r20.999，最低定量限(LLOQ為10 ng/ml 。在人血漿基質中，高、中、低濃度及LLOQ (800、400、30和10 ng/ml四個添加水平下，羅紅霉素的平均提取回收率為96.7 %，日內及日間相對標準偏差分別為 4.5 和 8.2 。穩(wěn)定性試驗表明血漿樣品室溫下放置24h 或處理后放置12h 、80 放置3周及-80凍融3次對測定結果無影響。結果表明，該方法樣品處理簡單、靈敏、特異性高，為羅紅霉素臨床藥代動力學等研究提供了簡捷、準確的分析測定方法。關鍵詞 羅紅霉素，高效液相串聯質譜法

3、，血藥濃度Determination of roxithromycin in human plasma using liquid chromatography electrospray ionization tandam mass spectrometryGUO Bei-Ning, ZHANG Jing, YU Ji-Cheng, CAO Guo-Ying，SHI Yao-Guo(Institute of Antibiotics, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, ChinaAbstract To establish a

4、method for determination of roxithromycin in human plasma by LC-ESI-MS/MS. The plasma samples were applied to a C18 column interfaced with a triple quadrupole tandem mass spectrometer after pretreated with acetonitrile. Positive electrospray ionization was employed as the ionization source. The anal

5、yte and I.S. clarithromycin were detected by the use of selected reaction monitoring (SRM of the transitions m/z 837.5m/z 679.5 for roxithromycin and m/z 748.5m/z 158.1 for I.S, respectively. The method was linear in the concentration range of 10-1,000 ng/ml for plasma roxithromycin samples. The low

6、er limit of quantification (LLOQ was 10 ng/ml. The mean extraction recovery of roxithromycin was 96.7. The intra- and inter-day relative standard deviationfor roxithromycin plasma samples at LLOQ and three QC concentrations (30, 400 and 800 ng/ml across six validation runs was less than 4.5% and 8.2

7、%, respectively. A rapid and sensitive LC-MS/MS method was developed and validated for the determination of roxithromycin in human plasma. It can be applied to evaluate the pharmacokinetics of roxithromycin. Key words roxithromycin, LC-MS/MS, concentration1引言羅紅霉素(Roxithromycin為14元環(huán)新的半合成大環(huán)內酯類抗生素，是紅霉素

8、14元環(huán)9位酮基為O-(2-甲氧基 甲基肟所取代，其抗菌活性與紅霉素相仿或略差，但血藥濃度為大環(huán)內酯類抗生素中相對較高，在扁桃體、肺、前列腺及其他泌尿生殖道組織中的藥物濃度可達有效治療水平，臨床主要用于敏感菌引起的呼吸道感染包括鼻竇炎、中耳炎、支氣管炎及肺炎、皮膚軟組織感染以及衣原體所致的泌尿生殖道感染。有關羅紅霉素的血藥濃度測定, 國外多采用高效液相電化學(HPLC-EC檢測1-2，國內多采用微生物方法3-5和高效液相色譜紫外檢測法(HPLC-UV 6，但由于羅紅霉素原形藥物和代謝物都有活性, 微生物法專屬性不高；采用高效液相色譜紫外檢測法, 由于羅紅霉素在近紫外端210 nm 處有最大吸收

9、，內源性物質常有干擾，最低檢測限僅為0.25 mg/L；也有作者7采用柱前衍生化后熒光檢測的方法減少內源性物質干擾，但存在靈敏度低和操作繁瑣的問題，相對來說LC-MS 方法8更有優(yōu)勢。本文建立的血漿中羅紅霉素的高效液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS測定法，方法簡單、靈敏，血樣需要量及進樣量少，分析時間短，實用性強，可用于臨床藥代動力學等研究。2 實驗部分2.1 儀器、試劑和材料高效液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS儀由Waters Alliance 2690高效液相色譜儀（美國Wa t e r s 公司）和T S Q Quantum Discovery三級四極桿質譜儀（美國，Thermo

10、Fisher Scientific公司 組成，Xcalibur 2.0數據處理系統(tǒng)；Millipore 純水系統(tǒng)(美國Millipore 公司）； METTLERAE240 分析天平(上海Mettler 公司 ；N-EVAPTM112氮吹儀(美國Organomation 公司 ；ABBOTT 離心機(德國Hettich 公司 ；-80 超低溫冰箱(美國Thermo 公司 。藥物濃度測試用對照品：羅紅霉素，批號30351-200303，含量946 U/mg， 購自中國藥品生物制品檢定所；克拉霉素，批號33386-255-3，含量990 g/mg ，由Abbott 公司提供；乙腈（色譜純），購自S

11、igma 公司；甲酸銨（分析純），購自國藥集團化學試劑有限公司；甲酸（分析純），購自上海凌峰化學試劑有限公司；空白血漿取自健康受試者。2.2 LC-MS/MS條件氮氣流下揮干，殘渣用200 L流動相溶解，5 L進樣分析。3 結果與討論3.1 LC-MS/MS條件的選擇克拉霉素是羅紅霉素的結構類似物，較紅霉素穩(wěn)定性好，以克拉霉素為內標保證了方法的準確性和重現性；血漿樣品直接用乙腈蛋白沉淀，方法簡單，樣品需要量少，適合大批量生物樣品濃度的檢測。在本試驗的LC-MS/MS條件下, 羅紅霉素和內標物克拉霉素的保留時間分別在1.49 min 和1.41 min, 峰形良好，分析時間僅為3 min。電噴霧

12、電離源正離子模式（ESI+），羅紅霉素分子離子m/z 837.5產生的碎片離子中，以碎片離子m/z 679.5的信號最強且穩(wěn)定，克拉霉素分子離子m/z 748.5 產生的信號較強且穩(wěn)定的碎片離子為m/z 158.1，因此選擇的選擇反應監(jiān)測（SRM ）離子對為羅紅霉素m/z 837.5m/z 679.5，克拉霉素 m/z 748.5 m/z 158.1，見圖1。3.2 方法學考察處理后，室溫下分別放置0 h、3 h、6 h、9 h和12 h，以0 h為基準，放置12 h后羅紅霉素回收率為90.9102.1 %；在80 低溫冰箱中放置3周后，羅紅霉素回收率為90.598.0 %；經80 凍融3次后

13、，羅紅霉素回收率為93.8106.7 %。穩(wěn)定性試驗結果表明，該血漿樣品室溫下放置24h 或處理后放置12h 、80 放置3周及-80 凍融3次對羅紅霉素的測定結果無影響。4 結 論本文建立的血漿中羅紅霉素的高效液相色譜電噴霧串聯質譜(LC-ESI-MS/MS檢測法，簡單、靈敏、實用性強，可用于藥代動力學研究和特殊情況下的藥物濃度監(jiān)測。 References1. Birkett D J, Robson R A, Grgurinovich N, Tonkin A. Ther. Drug Monit., 1990, 12 (1: 6571.2. Denotes-Mainaird F M, Vinc

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