綠色熒光蛋白在大鼠骨骼肌中的表達

1、    綠色熒光蛋白在大鼠骨骼肌中的表達        【摘要】目的研究綠色熒光蛋白(GFP)在哺乳動物細(xì)胞中的表達。方法制備了含綠色熒光蛋白基因的重組DNA，經(jīng)脂質(zhì)體(lipofectin)法轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的大鼠骨骼肌細(xì)胞，用共聚焦顯微鏡觀察GFP的表達。結(jié)果大約20%30%的骨骼肌細(xì)胞呈現(xiàn)不同強度的綠色熒光。結(jié)論GFP是研究活細(xì)胞生命現(xiàn)象的一種新途徑?！娟P(guān)鍵詞】綠色熒光蛋白骨骼肌細(xì)胞大鼠 GFP EXPRESSION IN MUSCLE CELLS OF RATSTian Ji

2、ngsheng, Zhao Chunli, Zheng Shaopeng, Shang Yonglei,Pan Haiyan(Beijing Institute for Neurosciences, Capital University of Medical Sciences, Beijing)【Abstract】 Objective The expression of green fluorescent protein(GFP) in mammalian cells was studied. Methods The recombinant DNA containing GFP gene wa

3、s prepared and transfected into the rat muscle cells in culture using lipofectin method. The expression product of GFP gene was observed by confocal microscope. Results About 20%30% of living muscle cells expresses the product and appears different density of green fluorescent under confocal microsc

4、ope. Conclusion GFP can be used as a new approach for studies of life sciences.【Key words】 GFP; Muscle cell; Rat綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)是從發(fā)光水母(Aeguorea Vietoria)分離出來的一種熒光蛋白，它在藍(lán)光(主峰400nm，次峰475nm)或紫外光激發(fā)的條件下可自發(fā)綠色熒光，并由此而得名。GFP由238個氨基酸組成，分子量約為27kD，它所發(fā)射的綠色熒光主峰為509nm，肩峰為540nm，該熒光十分穩(wěn)定，沒有漂白現(xiàn)象1。

5、GFP色基來自其主要的氨基酸即絲氨酸(serine)去氫酪氨酸(dehydrotyrosine)甘氨酸(glycine)在六肽中的環(huán)化。對GFP色基改造以加強熒光強度，已成為人們關(guān)注的熱點。Rizzuto等2首先利用DNA重組技術(shù)，成功構(gòu)建了含GFP的重組體，即以巨細(xì)胞病毒(CMV)為啟動子將GFP cDNA插入真核表達載體Pc DNA1中，轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞和原代培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞等均獲成功，其后又將野生型GFP (Wt-GFP)進行改造，將發(fā)光色基中的Ser65變成Thr65，形成了突變型GFP (mt-GFP)，即GPFS65T以增強其熒光強度。本研究將此由水母發(fā)光蛋白構(gòu)建的突變型GFPS65

6、T行體外擴增，提取質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的大鼠骨骼肌細(xì)胞，用共聚焦顯微鏡觀察GFP在活體骨骼肌中的表達，進而提示GFP是研究活細(xì)胞生命現(xiàn)象的一種新途徑。材料和方法1.材料質(zhì)粒pGFP65T由Rizzuto Rosario教授(University of Padova, Italy)惠贈，其內(nèi)含有GFPS65T基因的cDNA(1.0kb)，克隆于PcDNA-1質(zhì)粒載體的EcoRI/XhoI酶切位點。Geneclean試劑盒購自Bio101公司，Lipotectin試劑盒購自GIBCO/BRL公司，Matrigel購自Collaborative Biomedical Produce公司，Perc

7、oll購自Sigma公司，其他試劑為國產(chǎn)分析純。SD大鼠由本校實驗動物部提供。2.質(zhì)粒DNA的制備GFPS65T轉(zhuǎn)化菌體外擴增，采用常規(guī)堿裂解法制備質(zhì)粒DNA，并經(jīng)Geneclean試劑盒純化，回收DNA片段。3.大鼠骨骼肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)取新生SD大鼠的四肢肌肉，剪碎，用0.16%胰酶和0.08%膠原酶消化，經(jīng)Percoll密度梯度離心后鋪盤培養(yǎng)，基質(zhì)為Matrigel，培養(yǎng)液為DMEM/F12加10%胎牛血清。4.脂質(zhì)體Lipofectin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染實驗按照Gibco公司的試劑盒及其說明書進行。5.觀察方法共聚焦顯微鏡(Mendian Instrument Inc產(chǎn)品)激光光源，選用藍(lán)色光(

8、400nm)為激發(fā)光，濾光片條件與異硫氰酸胍(FITC)相同，該儀器由中醫(yī)研究院針灸所提供。結(jié)果和討論大鼠骨骼肌在原代培養(yǎng)過程中再現(xiàn)分化的全過程，呈現(xiàn)以下3個時相的變化，經(jīng)Percoll分離純化的骨骼肌干細(xì)胞(衛(wèi)星細(xì)胞)在接種3d內(nèi)為梭形的單個核的成肌細(xì)胞；45d內(nèi)融合為管狀多核的肌管細(xì)胞；57d形成多核的可收縮的終末型骨骼肌細(xì)胞(1)。突變型GFP (pGFP65T)DNA在脂質(zhì)體(lipofectin)介導(dǎo)下，轉(zhuǎn)染48h后用共聚焦顯微鏡觀察GFP在骨骼肌細(xì)胞中的表達，鏡下可見綠色熒光分布在骨骼肌細(xì)胞的胞漿內(nèi)，約20%30%的細(xì)胞出現(xiàn)。胞漿內(nèi)熒光強度不同，可分為、+、+、+4個等級。強陽性一

9、般出現(xiàn)在多核的骨骼肌細(xì)胞中，這與其時相變化相一致(24)。本研究結(jié)果表明，突變型綠色熒光蛋白基因(GFP65T)可在原代培養(yǎng)的大鼠骨骼肌細(xì)胞中表達，這與Rizzuto等2，3的結(jié)果相似。我們還觀察到GFP在終末分化的骨骼肌細(xì)胞中表達水平高于成肌細(xì)胞和肌管細(xì)胞，這一現(xiàn)象可能與培養(yǎng)過程中骨骼肌分化過程相關(guān)，即隨著培養(yǎng)時間的推進，表達GFP的細(xì)胞會自發(fā)融合而導(dǎo)致熒光的增強。至于外源基因尤其是以質(zhì)粒DNA形式構(gòu)建成功的重組體，為何更易在骨骼肌中表達尚待探討。近年人們試對GFP色基的結(jié)構(gòu)進行改造，通過點突變使之發(fā)射更強的熒光4。“人化”改造5用人tRNA編碼的密碼子取代水母來源的序列，構(gòu)成pGren L

10、antern質(zhì)粒，使GFP應(yīng)用日趨擴大，它不但可在體外表達，而且還在體內(nèi)表達。157d肌管細(xì)胞融合成大的肌纖維并具有收縮功能×250Fig.1 After 5-7days, the myotube fused into large myotube that can contract.×2502綠色熒光在肌管細(xì)胞的胞漿中表達(+)Fig.2 GFP expressed in the cytoplasm of the myotube cells(+).3綠色熒光在肌管細(xì)胞的胞漿中表達(+)Fig.3 GFP expressed in the cytoplasm of the m

11、yotube cells(+).4綠色熒光在肌管細(xì)胞的胞漿中表達(+)Fig.4 GFP expressed in the cytoplasm of the myotube cells(+).作者單位：田竟生趙春禮鄭少鵬商永磊潘海燕首都醫(yī)科大學(xué)北京神經(jīng)科學(xué)研究所，北京100054參考文獻1Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science, 1994, 263(5148):8022Rizzuto R, Brini M, Pizzo P,

12、et al. Chimeric Green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Curr Biol, 1995, 5(6):6353Gubi AN, Reddy B, Njoroge JM,et al. Long-term stable expression of Green fluorescent protein in mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 236(2):3474Siemering KR, Golbik R, Sever R, et al. Mutations that suppress the thermosensitivity of Green fluorescent prot