環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測動物病原研究進(jìn)展

1、生物技術(shù)通報BIOTECHNOLOGY BULLETIN2009年增刊·技術(shù)與方法·核酸擴增技術(shù)是分子生物學(xué)領(lǐng)域的一項重要的研究手段,其中PCR技術(shù)最為常用。但在應(yīng)用過程中人們發(fā)現(xiàn)PCR技術(shù)存在一些不足,如靶基因易被污染,可能引起非特異性擴增,多種因素可以產(chǎn)生抑制擴增反應(yīng),擴增反應(yīng)時間較長,一般需要幾小時,需要比較昂貴的PCR儀,不利于在基層實驗室推廣應(yīng)用等。2000年,日本學(xué)者Notomi等1建立了一種新的核酸擴增方法環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP技術(shù),該技術(shù)克服了PCR技術(shù)的一些缺點。目前已在人類及

2、動植物細(xì)菌、病毒、寄生蟲、真菌等病原體的檢測中取得重要進(jìn)展,在疫病診斷領(lǐng)域顯示出廣闊的應(yīng)用前景。1LAMP技術(shù)原理LAMP技術(shù)依賴于能夠識別靶序列上6個獨立區(qū)域的兩對特異性引物(內(nèi)引物:FIP和BIP;外引物:F3和B3和一種具有解旋功能且呈瀑布式擴增的Bst DNA聚合酶,在等溫條件下可高效、特異的擴增靶序列。LAMP反應(yīng)過程是先由外部引物擴增出內(nèi)部引物擴增所需要的模板,即起始反應(yīng)物模板的合成;緊接著由內(nèi)部引物引導(dǎo)合成靶基因DNA 片段,由于內(nèi)部引物擴增的DNA片段含有與該引物5端DNA片段的反向互補序列,因而這些反向互補序列之間通過雜交形成莖環(huán)結(jié)構(gòu),另外一條內(nèi)部引物與其互補鏈退火雜交后引導(dǎo)

3、鏈置換合成反應(yīng),在擴增的DNA片段的另外一端產(chǎn)生了新的莖環(huán)結(jié)構(gòu),形成啞鈴狀結(jié)構(gòu),如此往復(fù)循環(huán)最后形成花椰菜形狀的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA,數(shù)量級可達(dá)1091010拷貝,電泳后可見擴增終產(chǎn)物由大小不等的DNA片段組成,呈梯狀條帶。LAMP反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)體系相似,即由模板、引物、聚合酶、dNTP和緩沖液組成。但LAMP使用四個引物,聚合酶為Bst DNA聚合酶。LAMP擴環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測動物病原研究進(jìn)展鄭洋妹1陳信忠2(1福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,福州350002;2廈門出入境檢驗檢疫局,廈門361026摘要:綜述了環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測病毒、細(xì)菌和寄生蟲等動物病原方面的研究和應(yīng)用最新進(jìn)展。關(guān)

4、鍵詞:環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)病原檢測進(jìn)展Progress in Detecting Animal Pathogens by Loop-mediatedIsothermal AmplificationZheng Yangmei1Chen Xinzhong2(1The Zoo-science Institute of Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,350002;2Xiamen Entry-Exit Inspection andQuarantine Bureau,Xiamen361026Abstract:This article su

5、mmarized the newest progress on the research and application in detecting virus,bacterium and parasite by loop-mediated isothermal amplification.Key words:Loop-mediated isothermal amplification Pathogens Detection Progress收稿日期:2009-03-13作者簡介:鄭洋妹(1985-,女,碩士研究生,研究方向:動物病原與分子生物學(xué)研究通訊作者:陳信忠(1964-,男,研究員,主要

6、從事水生動物病害研究;Email:chenxz2009年增刊鄭洋妹等:環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測動物病原研究進(jìn)展增操作簡便,反應(yīng)體系混勻后于6065恒溫反應(yīng)1h,移至80熱浴10min滅活Bst DNA聚合酶即可。結(jié)果判定可通過肉眼直接觀察副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀,陽性反應(yīng)的反應(yīng)管內(nèi)液體渾濁,離心后有白色沉淀集于管底,陰性反應(yīng)則無此現(xiàn)象。也可在產(chǎn)物中加SYBR Green I等核酸染色劑,呈綠色的為陽性反應(yīng),橙紅色為陰性反應(yīng)。此外,還可通過瓊脂糖電泳,用EB或SYBR Green I染色進(jìn)行判定。LAMP技術(shù)具有比普通PCR更優(yōu)越的特點:(1特異性高:4條精確設(shè)計的引物嚴(yán)格地識別靶核酸序列上的6個獨立區(qū)

7、域,所以LAMP不會受到反應(yīng)混合物中存在的非靶序列DNA影響;(2靈敏度高:擴增模板量可低至10拷貝或更少,而產(chǎn)物擴增指數(shù)達(dá)109-1010個拷貝,比普通PCR法普遍高1-2個數(shù)量級;(3擴增時間短:LAMP是恒溫擴增反應(yīng),在30min60min內(nèi)即可完成反應(yīng)過程。此外,在LAMP反應(yīng)體系中增加2條環(huán)引物可使其反應(yīng)所需時間比原來縮短近一半,大大提高了檢測效率;(4設(shè)備簡單:LAMP反應(yīng)只需一個簡單的水浴鍋,不需要昂貴的PCR儀和凝膠成像系統(tǒng),易于在基層實驗室推廣應(yīng)用;(5結(jié)果判定便捷:可以用肉眼觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的混濁度或者通過SYBR Green I顏色變化判斷結(jié)果;(6步驟簡單:擴增RNA只

8、要在DNA基因擴增試劑的基礎(chǔ)上加上逆轉(zhuǎn)錄酶,就能夠完全像DNA基因擴增那樣,實現(xiàn)一步擴增;(7費用低:只要一個水浴鍋就能完成擴增反應(yīng),總費用低;(8在檢測細(xì)菌時,無需分離培養(yǎng)細(xì)菌,可直接提取感染動物組織基因組進(jìn)行擴增2,3。2LAMP技術(shù)在動物病原菌檢測中的應(yīng)用目前常用的細(xì)菌檢測方法包括傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)和生化鑒定法、免疫熒光、EILISA、PCR等,這些方法都存在一些缺陷,如細(xì)菌培養(yǎng)鑒定法步驟繁雜耗時長,免疫學(xué)方法特異性不強,PCR法容易出現(xiàn)假陽性等。目前,應(yīng)用LAMP法快速檢測病原菌已顯示其特有的優(yōu)勢。Saleh等2根據(jù)魯氏耶爾森菌(Yersinia ruckeri的yruI/yruR基因設(shè)計

9、一套引物,建立了檢測魯氏耶爾森菌LAMP方法,研究表明LAMP比PCR靈敏10倍,而且LAMP不僅可以檢測經(jīng)培養(yǎng)純化的細(xì)菌,還可以直接從感染魚的組織基因組中檢測到魯氏耶爾森菌。Yamazaki等4建立了檢測產(chǎn)毒霍亂弧菌(toxin-producing Vibrio cholerae的高靈敏性的LAMP方法,其對110株菌進(jìn)行了檢測,僅34株產(chǎn)毒霍亂弧菌得到了擴增。此方法用于人類糞便中的產(chǎn)毒霍亂弧菌的檢測下限是7.8×102cfu/g,比普通PCR靈敏10倍,且擴增單菌落所用時間不超過35min。Kayoko等5對疑被沙門氏菌感染的雞蛋進(jìn)行抽樣(110個樣品檢測,并與細(xì)菌分離培養(yǎng)方法和

10、PCR法做比較。結(jié)果顯示,PCR漏檢了10%,LAMP 及分離培養(yǎng)的檢出率為100%;表明LAMP具有與細(xì)菌分離培養(yǎng)相同的靈敏度,而且更加快速。徐芊等6針對副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticu不耐熱溶血毒素基因(tlh設(shè)計4條特異性引物進(jìn)行LAMP擴增,對擴增反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化,最佳反應(yīng)時間為60min,反應(yīng)溫度為60。對12種細(xì)菌共28株菌進(jìn)行擴增,僅14株副溶血弧菌得到陽性擴增結(jié)果,證明引物具有很高的特異性。副溶血弧菌基因組DNA和純培養(yǎng)物的檢測靈敏度分別約為90fg和24cfu/ml。結(jié)果表明,該方法檢測副溶血弧菌特異性強、靈敏度高,并且簡便、快速,有望成為檢測副溶血弧菌的

11、有效手段。Savan等7根據(jù)遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda的溶血素(haemolysin基因序列設(shè)計4條引物,對日本鰻鱺(Anguilla japonica等4種水生動物和養(yǎng)殖水體中分離的5株遲鈍愛德華氏菌進(jìn)行了成功的檢測,而非遲鈍愛德華氏菌病原菌都沒有擴增,證明LAMP法檢測遲鈍愛德華氏菌具有很強的特異性。將LAMP法和PCR方法的靈敏性進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)LAMP法對遲鈍愛德華氏菌的最低檢測極限為10cfu/mL,比PCR法靈敏100倍。用LAMP法檢測正常的和受遲鈍愛德華氏菌感染的褐牙鲆,僅從受感染魚的脾和腎中提取的DNA模板能產(chǎn)生特異性擴增,并且也檢測了養(yǎng)殖水體中的遲鈍

12、愛德華氏菌,其最低的檢測濃度為3.8×10cfu/mL。Yeh等也用LAMP法檢測了斑點叉尾鲴的愛德華氏菌(Edwardsiella ictaluri8和柱狀黃桿菌(Flavobacteriira columnare9,比real-time PCR法更加靈敏。并且從感染的斑點叉尾鲴的組織中提取的DNA作為模板,均產(chǎn)生了特異性擴增,而正常魚都沒有產(chǎn)生109生物技術(shù)通報Biotechnology Bulletin2009年增刊擴增反應(yīng),證明此法具有簡單靈敏的特點。Iwamoto等10根據(jù)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacterium tuberculos complex、鳥結(jié)核分枝桿菌(

13、Mycobacterium avium subsp.Paratuberculosis和胞內(nèi)分枝桿菌的gyrB基因序列設(shè)計的引物和分枝桿菌屬16S rRNA保守序列的公共引物,用LAMP技術(shù)對唾液樣本中的結(jié)核分枝桿菌、鳥分支桿菌、胞內(nèi)分支桿菌作了檢測,通過檢測24株分枝桿菌和7株非分枝桿菌證實了LAMP的特異性和敏感性。LAMP從固體培養(yǎng)基中鑒定出特異的分枝桿菌屬只需35min,液體培養(yǎng)基則需60min。此外,還有LAMP技術(shù)檢測嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae和葡萄球菌(Staphyloco

14、ccus等細(xì)菌的報道。3LAMP技術(shù)在病毒檢測中的應(yīng)用動物病毒的檢測和診斷比較復(fù)雜,常用的方法有細(xì)胞培養(yǎng)、組織病理學(xué)、Western blot、ELISA和PCR方法等,但這些方法都有一定的局限性。LAMP 技術(shù)因其簡便、快速、經(jīng)濟(jì)的特點,在動物病毒的檢測上具有很好的應(yīng)用前景。LAMP用于DNA病毒診斷的報道相對較多。Gunimaladevi等11根據(jù)錦鯉皰疹病毒(Koi herpesvirus,KHV胸苷激酶(thymidine kinase,TK的基因序列設(shè)計引物,采用LAMP法檢測皰疹病毒,檢測的靈敏度和PCR方法相似,但LAMP方法所需的時間僅為6090min,而PCR需34h。LAM

15、P技術(shù)被應(yīng)用于檢測日本對蝦白斑綜合癥病毒(White spot syndrome virus,WSSV12,對病毒DNA的檢測限為10pg級,比巢式PCR法靈敏一個數(shù)量級。Caipang等13使用染病真鯛的脾DNA 抽提物,用LAMP擴增真鯛虹彩病毒(Red sea bream iridovirus,RSIV的DNA,LAMP比傳統(tǒng)的PCR靈敏度高l0倍,而且利用病毒顆?？截悢?shù)和反應(yīng)管混濁度的相互關(guān)系,可以對病毒進(jìn)行量化。Sun等14采用LAMP法檢測了南美藍(lán)對蝦(Penaeus stylirostris傳染性皮下及造血組織壞死病毒(Infectious hypodermal and hema

16、topoietic necrosis virus,IHHNV,反應(yīng)條件優(yōu)化為64反應(yīng)60min。Chen等15針對豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus的非結(jié)構(gòu)蛋白-1基因設(shè)計一組特異性引物,結(jié)果顯示LAMP 的敏感性和特異性與PCR相當(dāng),并且LAMP的檢測下限是5個拷貝的豬細(xì)小病毒。RT-PCR可以用于診斷RNA病毒,但是費用高,而且要經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄階段,費時且效率較低。隨著LAMP的發(fā)展,RT-LAMP已得到應(yīng)用。RT-LAMP 第一次應(yīng)用于日本山藥花葉病毒的檢測。秦智鋒等16設(shè)計了6條針對口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV3D基因的8個位

17、點的特異性引物,建立了一套從核酸抽提到檢測僅需要75min 的快速檢測FMDV的LAMP技術(shù),靈敏度與實時熒光RT-PCR相當(dāng),特異性也強。吳紹強等17建立了檢測亞洲I型FMDV細(xì)胞培養(yǎng)病毒的RT-LAMP方法,作者認(rèn)為LAMP法是適合基層和現(xiàn)場檢測的快速靈敏實用的方法。Li等18根據(jù)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV的開放閱讀框6(ORF6設(shè)計了一套引物用于LAMP擴增,并用豬圓環(huán)病毒-2 (Porcine circovirus type2,PCV-2、豬免疫缺陷病毒(Simian imm

18、unodeficiency virus,SIV、溫和型豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV進(jìn)行對照,結(jié)果顯示此引物特異性高,靈敏性也很高。Poon LL等19用LAMP和PCR方法分別對稀釋成不同濃度的禽流感病毒(Avian influenza virus樣本進(jìn)行檢測,PCR最低檢測到10-2Pfu,而LAMP 能在不到1h內(nèi)檢測到10-3Pfu,且可以通過肉眼觀察反應(yīng)所生成的白色沉淀物來快速檢測禽流感病毒,因此LA MP在應(yīng)對農(nóng)場大規(guī)模禽流感病毒檢測時有相當(dāng)廣泛的

19、應(yīng)用前景。李啟明等20對51份實驗感染動物及病毒培養(yǎng)標(biāo)本的H5N1亞型禽流感病毒的HA、NA基因區(qū)進(jìn)行了RT-LAMP檢測,并對擴增產(chǎn)物做內(nèi)切酶驗證和測序分析,證明RT-LAMP技術(shù)的特異性與Real-time PCR結(jié)果一致。此方法的靈敏度可達(dá)到10個拷貝模板RNA。作者認(rèn)為RT-LAMP技術(shù)應(yīng)用于H5N1亞型禽流感病毒的快速檢測是一種可行的方法。Mekata等21采用RT-LAMP法檢測了斑節(jié)對蝦的黃頭病毒(Yellow head virus,YHV,反應(yīng)條件優(yōu)化為65反應(yīng)60 min。Gunimaladevi等22以流行性造血器官壞死癥病毒病毒(Infectioushaematopoie

20、tic necrosis virus,IH1102009年增刊鄭洋妹等:環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測動物病原研究進(jìn)展NV的G蛋白為靶序列進(jìn)行RT-LAMP,比較了RT-LAMP、LAMP和巢式PCR三種方法,其中RT-LAMP以RNA為模板,cDNA合成和目標(biāo)基因的擴增可在單管中進(jìn)行,可以節(jié)約3040min反應(yīng)時間; LAMP靈敏度比巢式PCR高10倍。RT-LAMP和實時PCR都可作為診斷IHNV的很好的方法,但是RT-LAMP的花費要低很多。RT-LAMP還用于檢測諾達(dá)病毒(MrNV、小顆粒病毒(XSV、病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV、偽狂犬病毒(Pseudorabies virus、新城疫病

21、毒(Newcastle disease virus等。4LAMP技術(shù)在寄生蟲檢測中的應(yīng)用形態(tài)學(xué)鑒定一直是寄生蟲分類的傳統(tǒng)方法,但常常需要對蟲體進(jìn)行染色、固定、制片等,而且要求有一定的經(jīng)驗,這種方法越來越顯示出它的局限性,尤其對那些相似種或近緣種來說,從形態(tài)上很難進(jìn)行區(qū)分,需要采用其它方法來對寄生蟲進(jìn)行分類、鑒定,而分子生物學(xué)是其中發(fā)展最快的一種。隨著LAMP技術(shù)的不斷改善和成熟,相信LAMP法將成為寄生蟲的一種快速檢測方法。Njiru等23以布氏羅得西亞錐蟲(Trypanosoma brucei rhodesiense的血清耐藥相關(guān)(SRA基因為靶序列,進(jìn)行了SPA-LAPM,該研究顯示LAM

22、P在檢出率和靈敏性方面均比PCR高。楊秋林等24設(shè)計4條擴增日本血吸蟲尾蚴鈣結(jié)合蛋白基因的引物,進(jìn)行LAMP反應(yīng),可檢測到最低1條尾蚴。EI-Matboulim和Solimanh25用LAMP方法快速檢測引起虹鱒增生性腎臟病的孢子蟲Tetracapsuloides bryosalmonae,而且將LAMP方法和常規(guī)的PCR方法進(jìn)行比較。根據(jù)目的基因SSU rDNA設(shè)計4條引物,并且加入了環(huán)引物來加速LAMP反應(yīng),整個反應(yīng)在1h內(nèi)完成,LAMP反應(yīng)比PCR反應(yīng)的靈敏度高100倍。同時,用LAMP法快速檢測了寄生魚和寡毛類動物體上的黏液孢子蟲(Myxobolus cerebralis26,檢測的靈

23、敏度和PCR相似,但是,此法需要的時間更短而且只需要一個水浴鍋,更加適用于實際診斷。Lin等27根據(jù)致病鉤端螺旋體(pathogenic Leptospira的LipL41基因設(shè)計了一套引物進(jìn)行LAMP檢測,其檢測的最低極限是100個拷貝,與普通PCR和real-time PCR一致。巴貝西蟲病(Babesia Gibsoni infection是一種由蜱傳播的致命性疾病,會導(dǎo)致犬類的死亡。Ikadai等28根據(jù)18S rDNA序列設(shè)計引物,采用LAMP和PCR的方法進(jìn)行擴增反應(yīng),兩者的檢測蟲體密度(parasitemia的極限均為0.0005%,但LAMP操作簡單,結(jié)果可通過肉眼觀察,并且時

24、間比PCR少3h。5LAMP法在其他領(lǐng)域中的應(yīng)用LAMP技術(shù)除了用于檢測動物病原外,還被廣泛應(yīng)用于人類病原、食品微生物方面的檢測。Yoshikawa29和Ihira30等分別建立了人皰疹病毒(Human herpes virus6型和7型的LAMP檢測方法,他們設(shè)計的LAMP引物具有高度的特異性和敏感性。Maeda等利用LAMP方法建立了一種簡單、快速的檢測牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis體系,運用了3種結(jié)果判定方法,發(fā)現(xiàn)瓊脂糖電泳和SYBR Green I的檢測極限相近,直接沉淀觀測法則低10倍;此外,通過real-time PCR和real-time LAM

25、P的比較發(fā)現(xiàn),后者更加快速、便捷,靈敏度更高。Seki等31針對肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae的特異性基因序列l(wèi)ytA設(shè)計6條引物,利用LAMP法來檢測肺炎鏈球菌,通過對10株肺炎鏈球菌和6株非肺炎鏈球菌的檢測驗證了LAMP法的特異性,LAMP的檢測下限為10拷貝的純化DNA,比PCR法敏感1000倍,時間只需60 min。LAMP技術(shù)還用于SARS冠狀病毒、巨細(xì)胞病毒、登革熱病毒、丙型肝炎病毒等方面的研究。沙門氏菌是引起食物中毒和傷寒的主要病原菌。朱勝梅等32根據(jù)沙門氏菌特異性的invA基因,設(shè)計了一套特異性引物對該基因進(jìn)行了LAMP,同時優(yōu)化了反應(yīng)條件,建立了

26、沙門氏菌的LAMP快速檢測技術(shù)。在此條件下,LAMP檢測沙門氏菌DNA 的敏感度達(dá)10fg,且與其他常見的細(xì)菌無交叉反應(yīng)。Song等33用LAMP方法以志賀氏桿菌(Shigella enteroinvasive和腸侵染性大腸桿菌(E.coli的侵襲性質(zhì)粒抗原基因(ipaH基因作為靶基因進(jìn)行擴增,白色焦磷酸鎂沉淀作為鑒定的依據(jù)。試驗發(fā)現(xiàn), LAMP方法的檢測靈敏度是8cfu,整個過程只需2h,而PCR反應(yīng)是8×10cfu。6應(yīng)用前景LAMP技術(shù)在快速檢測和鑒定動物病原方面不僅具有重要的理論意義,而且具有很高的實用價111生物技術(shù)通報Biotechnology Bulletin2009年

27、增刊值。該方法快速高效,整個過程在恒溫條件下進(jìn)行,避免了常規(guī)PCR對于溫度循環(huán)的特殊要求所帶來的種種不便。實驗結(jié)果判定可以直接使用副產(chǎn)物焦磷酸鎂的濁度檢測法。由于該方法簡單易行,提高了LAMP的使用價值。目前,LAMP在以實用研究為主導(dǎo)的日本非常熱門。LAMP技術(shù)作為一種檢測技術(shù),在核酸研究方面具有重要的作用,尤其在人類和動植物的病原檢測方面具有良好的發(fā)展前景。LAMP方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域的一種新的技術(shù),同樣存在一些不足。由于LAMP法陽性反應(yīng)呈現(xiàn)梯度條帶,并不像PCR 只呈現(xiàn)單帶,一旦產(chǎn)生非特異性擴增,則不易鑒別。因此,應(yīng)特別關(guān)注反應(yīng)的特異性,可通過對目標(biāo)序列特異的限制性酶切割擴增產(chǎn)物進(jìn)行驗

28、證。另外,從分子生物學(xué)研究的角度看,還應(yīng)該對LAMP反應(yīng)的理論基礎(chǔ)作更系統(tǒng)、更深入的探討,擴大其在分子生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍,以便開發(fā)出方便、快捷、實用的LAMP檢測試劑盒。參考文獻(xiàn)1Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,et al.Nucleic Acids Research,2000,28:e63.2Saleh M,Soliman H,El-Matbouli M.BMC Veterinary Research, 2008,4:31.3Itano T,Kawakami H,Kono T,et a1.J Appl Microbiol,2006,100(6:13811387

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