植保生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)安排

1、分組：第一組：植保1班（2號(hào)李丁-29號(hào)薊曉玲）第二組：植保1班（31號(hào)尹曉娟-56號(hào)郭嗣瑞）第三組：植保2班（1號(hào)劉小慧-25號(hào)謝佼昕）第四組：植保2班（26號(hào)吉夏潔-57號(hào)楊鵬飛）每組一整天（上午8點(diǎn)，下午2點(diǎn)半）共15個(gè)學(xué)時(shí)，所開實(shí)驗(yàn)如下：實(shí)驗(yàn)一：生技實(shí)驗(yàn)室主要儀器介紹及注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)二：質(zhì)粒DNA的制備實(shí)驗(yàn)三：瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA實(shí)驗(yàn)四：運(yùn)用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)進(jìn)行基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)五：瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果實(shí)驗(yàn)一：生技實(shí)驗(yàn)室主要儀器介紹及注意事項(xiàng)主要介紹進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室注意事項(xiàng)；主要儀器設(shè)備的用法及注意事項(xiàng)；有毒試劑的用法及注意事項(xiàng)等。實(shí)驗(yàn)二：細(xì)菌基因組DNA的制備 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^本實(shí)驗(yàn)

2、掌握細(xì)菌基因組DNA。二、實(shí)驗(yàn)原理首先破碎（或消化）細(xì)胞壁釋放出細(xì)胞內(nèi)容物，必須破壞細(xì)胞膜使DNA釋放到提取緩沖液中。去污劑還可以保護(hù)DNA免受內(nèi)源核酸酶的降解。大多數(shù)蛋白可通過氯仿或苯酚處理后變性、沉淀除去，絕大部分RNA則可經(jīng)通過過的RNase A 除去。三、儀器和試劑（一）材料 細(xì)菌培養(yǎng)物。 （二）設(shè)備 移液管, 高速冷凍離心機(jī), 臺(tái)式離心機(jī)，水浴鍋。 （三）試劑 1、CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H2 O,緩慢加入10g CTAB,加水至100ml。 2、其它試劑：氯仿:異戊醇(24:1)，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，異丙醇，70% 乙醇，TE，10

3、% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉劑)，5mol/L NaCl。 四、操作步驟：1. 100ml 細(xì)菌過夜培養(yǎng)液, 5000rpm離心10分鐘, 去上清液。 2. 加9.5ml TE懸浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50l 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混勻, 37保溫1小時(shí)。 3. 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混勻。 4. 加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混勻, 65保溫20分鐘。 5. 用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm離心10分鐘, 將上清液移至干凈離心管。 6. 用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提,

4、 取上清液移至干凈管中。 7. 加1倍體積異丙醇, 顛倒混合, 室溫下靜止10分鐘，沉淀DNA。 8. 離心DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml用RNA酶A水（10g/ml）中室溫放置一段時(shí)間, -20保存。實(shí)驗(yàn)三：瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)細(xì)菌基因組DNA一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)DNA的方法和技術(shù)二、實(shí)驗(yàn)原理電泳是用于分離和純化DNA片段的最常用技術(shù)。當(dāng)裝備一塊“膠”即一塊包含電解質(zhì)的多孔支持介質(zhì)并把它置于靜電場(chǎng)中，DNA分子將向陽極移動(dòng)，這是因?yàn)镈NA分子沿起雙螺旋骨架兩側(cè)帶有負(fù)電和的磷酸根殘基。當(dāng)DNA長度增加時(shí)，來自電場(chǎng)的驅(qū)動(dòng)里和來自你叫的阻力之間的比率

5、就會(huì)降低，不同長度的DNA片段就會(huì)表現(xiàn)出不同的遷移率。因此就可以依據(jù)DNA分子的大小來使其分離。該過程可以通過把示蹤染料或分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物和樣品一起進(jìn)行電泳而得到檢測(cè)。分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物也可以提供一個(gè)用于確定DNA大小的標(biāo)準(zhǔn)。DNA在電泳過程中，與瓊脂糖中的溴化乙錠嵌合，在透射紫外儀下呈橘紅色。三、儀器和試劑（一）儀器1電泳槽和電泳儀2凝膠成像系統(tǒng)3電子天平4移液槍（二）試劑1瓊脂糖2溴化乙錠3LoadingBuffer4DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物（DNA marker）5植物基因組DNA6. 上樣緩沖液（TBE）四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）制備瓊脂糖凝膠1取0.16g瓊脂糖置入裝有20ml 0.5X TBE

6、的三角瓶中，微波爐加熱沸騰使其溶于0.5X TBE中。加0.5µl溴化乙錠貯存液，混勻。2液溫度降至65度左右，緩緩將其注入一個(gè)帶有梳子的制膠床，避免有氣泡產(chǎn)生。讓膠在室溫中冷卻至凝固。在次期間：1）準(zhǔn)備DNA樣品2）膠凝固后，將膠床置于有0.5XTBE電極緩沖液的電泳槽中。通常，緩沖液高于膠面0.5cm。輕輕移去梳子，小心，不要使膠孔破裂。（二）上樣及電泳1吸取約含10ul的植物基因組DNA溶液，加2µl 10X LoadingBuffer，用移液器吸取，緩緩注入凝膠上的加樣孔。2加樣畢，用電源線連接電泳槽和電泳儀（注意正負(fù)極，DNA片段從負(fù)極向正極移動(dòng)），打開電源，設(shè)定

7、電壓或電流，開始電泳。（三）染色及觀察當(dāng)指示劑遷移至凝膠約1-2cm處時(shí)，關(guān)閉電源取出凝膠，染色、脫色后在紫外燈上觀察并拍照。實(shí)驗(yàn)四：運(yùn)用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)進(jìn)行基因擴(kuò)增一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)PCR反應(yīng)基本原理和實(shí)驗(yàn)技術(shù)二、實(shí)驗(yàn)原理PCR（polymerase chain reaction, PCR）技術(shù)快速敏感、簡(jiǎn)便易行，其原理與細(xì)胞體內(nèi)發(fā)生的DNA復(fù)制過程十分相似。首先是雙鏈DNA在臨近沸點(diǎn)的溫度下變性分離成兩條DNA分子單鏈，然后DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，以反應(yīng)混合物中的寡聚核苷酸為引物，利用四種脫氧核苷三磷酸（dNTPs）合成新生的DNA互補(bǔ)鏈。PCR反應(yīng)中所用的引物是按照與

8、被擴(kuò)增區(qū)段兩端序列互補(bǔ)的原則設(shè)計(jì)的，這樣每一條新生鏈的合成都是從引物的退火結(jié)合位點(diǎn)開始合成，沿著相反鏈延伸。因此，每一條新鏈上的起點(diǎn)就是下一輪擴(kuò)增反應(yīng)引物的結(jié)合位點(diǎn)。從理論上講，PCR反應(yīng)n個(gè)循環(huán)之后的DNA的拷貝數(shù)應(yīng)當(dāng)是2n-2，經(jīng)過30個(gè)循環(huán)反應(yīng)，靶DNA在理論上可以得到109的擴(kuò)增，實(shí)際上得到的大約是106到107倍的擴(kuò)增。因此，靶DNA得以在體外快速大量合成。典型的PCR反應(yīng)體系由以下組分組成：DNA模板，反應(yīng)緩沖液，dNTPs，MgCl2，引物TaqDNA聚合酶。PCR反應(yīng)多次重復(fù)進(jìn)行的溫度循環(huán)周期均是由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個(gè)步驟組成。一般，在變性溫度為94到95度條件下，

9、DNA變性分離成兩條DNA分子單鏈；退火溫度在不同的反應(yīng)體系有所不同，主要是根據(jù)引物的解鏈溫度來確定的，在此條件下，引物得以與變性單鏈發(fā)生退火；延伸溫度是根據(jù)聚合酶的最適反應(yīng)溫度來確定的，一般為72度，在此溫度條件下，DNA聚合酶使得四種脫氧核苷三磷酸從引物的3端開始摻入，并沿著模板分子按5端到3端的方向延伸，合成出新生的DNA分子。Taq DNA聚合酶是一種熱穩(wěn)定的DNA聚合酶。1986年，H.A.Erlich等人從黃石公園熱泉中的棲熱水生菌(Thermus aquaticus)分離出來的。1988年，R.K.Saiki等人成功地將熱穩(wěn)定的DNA聚合酶用于PCR擴(kuò)增。Taq DNA聚合酶在進(jìn)

10、行DNA合成反應(yīng)時(shí)，不象大腸桿菌DNA聚合酶具有3到5方向的校正活性，因此在典型的一個(gè)PCR反應(yīng)中，堿基摻入錯(cuò)誤率為萬分之一。為了減少這種錯(cuò)誤，人們采用多種方法來克服。如分離更精確復(fù)制的酶，改善反應(yīng)條件等。三、儀器、試劑和材料（一）儀器設(shè)備及耗材1基因擴(kuò)增儀（PCR儀）2瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)3微量離心機(jī)4微量移液器（110µl和10100µl）及吸頭（二）材料1 模板DNA2 dNTPs3 引物4 Taq DNA Polymerase5 瓊脂糖6 DNA Marker（三）試劑1 10XPCR反應(yīng)緩沖液（由經(jīng)銷商提供）2 2.5Mm dNTPs (必須使用高質(zhì)量的dNTPs，

11、這一點(diǎn)非常重要。dNTPs經(jīng)反復(fù)凍融后會(huì)發(fā)生降解，因此應(yīng)該分裝成小份保存。四中混合物中dNTPs的量要相等)3 TaqDNA聚合酶（5u/µl市售）4 DNA模板（1ng/µl質(zhì)粒DNA）5 礦物油6 25mM MgCl27 引物1：5'- CGT ACC GAC CGT GTC TTG AAC C -3'8 引物2：5'- GCA GAA GCA AAC AAG GAT GGG  -3'9 引物溶液濃度為4µM10. 脂糖凝膠電泳所須試劑四、實(shí)驗(yàn)步驟1打開PCR儀，預(yù)熱30分鐘2在冰上建立20µl反應(yīng)如表反應(yīng)體

12、系：3反應(yīng)物混合后，覆蓋20µl礦物油，稍做離心，將反應(yīng)管放入PCR儀中，按照如下程序操作： a) 94 預(yù)變性2minb)94 30s(變性)c)60 30s(引物退火)d)72 30s(引物延伸)e)重復(fù)步驟a-d 30次f)72 延伸7min循環(huán)結(jié)束后反應(yīng)產(chǎn)物可置于冷藏箱里長期保存表：20µlPCR反應(yīng)體系組分Ingredient1x (µl)50X (µl)Template DNA0.52510×Buffer2.0100MgCl2 (25mM)1.260dNTPs（2.5mM）1.260Primer1(4µM)1.050Pri

13、mer2(4µM)1.050Taq(5U/µl)0.210ddH2O13.1655Total Volume 20.010104瓊脂糖凝膠電泳分析PCR結(jié)果：配置1%瓊脂糖凝膠，取5µl反應(yīng)產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)EB染色后在紫外燈下檢查基因擴(kuò)增情況。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)五：瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)細(xì)菌基因組DNA一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)DNA的方法和技術(shù)二、實(shí)驗(yàn)原理電泳是用于分離和純化DNA片段的最常用技術(shù)。當(dāng)裝備一塊“膠”即一塊包含電解質(zhì)的多孔支持介質(zhì)并把它置于靜電場(chǎng)中，DNA分子將向陽極移動(dòng)，這是因?yàn)镈NA分子沿起雙螺旋骨架兩側(cè)帶有負(fù)電和的磷酸根

14、殘基。當(dāng)DNA長度增加時(shí)，來自電場(chǎng)的驅(qū)動(dòng)里和來自你叫的阻力之間的比率就會(huì)降低，不同長度的DNA片段就會(huì)表現(xiàn)出不同的遷移率。因此就可以依據(jù)DNA分子的大小來使其分離。該過程可以通過把示蹤染料或分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物和樣品一起進(jìn)行電泳而得到檢測(cè)。分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物也可以提供一個(gè)用于確定DNA大小的標(biāo)準(zhǔn)。DNA在電泳過程中，與瓊脂糖中的溴化乙錠嵌合，在透射紫外儀下呈橘紅色。三、儀器和試劑（一）儀器1電泳槽和電泳儀2凝膠成像系統(tǒng)3電子天平4移液槍（二）試劑1瓊脂糖2溴化乙錠3LoadingBuffer4DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物（DNA marker）5植物基因組DNA6. 上樣緩沖液（TBE）四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）制備瓊脂糖凝膠1取0.16g瓊脂糖置入裝有20ml 0.5X TBE的三角瓶中，微波爐加熱沸騰使其溶于0.5X TBE中。加0.5µl溴化乙錠貯存液，混勻。2液溫度降至65度左右，緩緩將其注入一個(gè)帶有梳子的制膠床，避免有氣泡產(chǎn)生。讓膠在室溫中冷卻至凝固。在次期間：1）準(zhǔn)備DNA樣品2）膠凝固后，將膠床置于有0.5XTBE電極