從業(yè)人員健康體檢沙門氏菌、志賀氏菌檢測操作程序(討論稿)

1、從業(yè)人員健康體檢沙門氏菌、志賀氏菌檢測操作程序一、目的本程序用于對從業(yè)人員健康體檢進(jìn)行沙門氏菌、志賀氏菌檢測等致病菌檢測 的方法，以規(guī)范操作程序，保證檢測數(shù)據(jù)的有效性。二、適用范圍：本方法適用于從人體糞便中沙沙門氏菌、志賀氏菌的分離、鑒定及保存的梯相關(guān)操作。三、生物安全要求標(biāo)本及相應(yīng)的致病菌操作必須在 BSL-2生物安全實(shí)驗(yàn)室的生物安全 柜中進(jìn)行。四、試劑及儀器設(shè)備4.1 試劑采便盒、Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基、亞硒酸增菌液（SF）、改良亞硒酸鹽 磺綠增菌肉湯（SBG）、沙門志賀培養(yǎng)液、木糖-賴氨酸-脫氧膽酸瓊脂（XLD）、麥康凱瓊脂、沙門顯色培養(yǎng)基、結(jié)晶紫沙門培養(yǎng)基（ YS）、 三糖鐵（

2、TSI）、動力-呻噪-尿素培養(yǎng)基（MIU）、沙門氏菌屬診斷血清、志賀氏菌屬診斷血清、API20E生化試劑條、磁珠菌種保存管4.2 儀器設(shè)備恒溫培養(yǎng)箱、微生物鑒定儀五、采樣方法5.1 標(biāo)本應(yīng)為新鮮的或轉(zhuǎn)移至 Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基的糞便或肛拭 子，最優(yōu)標(biāo)本是轉(zhuǎn)移到Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基的糞便拭子。肛拭子不 是最佳標(biāo)本，僅在病人無糞便標(biāo)本時采用。5.2 糞便標(biāo)本：應(yīng)采集自然排出的新鮮糞便，取稀水樣、粘血樣、膿 血樣，黏液樣部分。盛于清潔、干燥、無吸水性的無菌容器，避免混 入尿液、水和其他物質(zhì)。5.3 肛拭標(biāo)本：若無法獲得糞便（如排便困難或嬰幼兒），也可以采 用肛拭子，即無菌棉拭子用

3、生理鹽水濕潤后，插入肛門內(nèi)4-5cm處兒 童約2-3cm）,同一方向輕輕旋轉(zhuǎn)2-3周。以目測能見到糞便為準(zhǔn)。插 入Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基。5.4 標(biāo)本采集后立即送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測，若室溫保存，不能超過1h; 如不能立即送檢，應(yīng)放入 Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基中冷藏條件下24小 時內(nèi)送檢。六、檢驗(yàn)程序七、操作步驟7.1 分別標(biāo)記一個XLD平板（或YS平板、麥康凱平板）和1管9ml改良亞硒酸鹽磺綠增菌肉湯（SBG）（或SF增菌液或沙門志賀培 養(yǎng)液）。7.2 用1個無菌拭子取少量標(biāo)本（不要使拭子 粘得太多，盡量從 可見血或黏液的部位收集）接種在 XLD平板的第一區(qū)，接著把拭子 放入SBG

4、增菌液。再滅菌接種環(huán)在XLD平板的其余區(qū)進(jìn)行劃線接種。 如果是Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基的糞便拭子，則輕攪混合標(biāo)本后接種增 菌液與平板。7.3 所有培養(yǎng)基均放入36c ±1C培養(yǎng)，SBG的最佳增菌時間是 1618h （建議每天下午45時接種標(biāo)本，第二天早上810時用增菌 液劃平板）。7.4 觀察平板：取培養(yǎng)后的平板，觀察有無可疑菌落。7.4.1 XLD平板可疑菌落觀察：志賀菌在 XLD平板上為粉紅或無 色、透明、光滑、濕潤、邊緣整齊、圓形菌落，直徑 1-2mm,而大部 分的大腸桿菌類的菌落為黃色、混濁、凸起、濕潤、邊緣整齊或不規(guī) 則，直徑2-3mm。大多數(shù)沙門菌在XLD平板上中心

5、黑色的透明、光 滑、濕潤、邊緣整齊、圓形的菌落。（圖2）7.4 . 2 YS平板可疑菌落觀察：7.4.3 麥康凱平板可疑菌落觀察：志賀菌在麥康凱平板上為無色至 淺粉色、半透明、光滑、濕潤、邊緣整齊或不規(guī)則、圓形菌落，直徑 2-3mm;大多數(shù)沙門菌為無色菌落，粉紅色，帶或不帶黑心，傷寒沙 門菌為無色菌落；而大部分的大腸桿菌類的菌落為粉紅或紅色、混濁、 凸起、濕潤、邊緣整齊或不規(guī)則，直徑 3-4mm。7.4.4 SBG肉湯增菌：SBG增菌1618小時后，劃線接種 XLE 平板或沙門顯色平板，放入 36c ±1C培養(yǎng)1824h。沙門顯色平板 可疑菌落觀察：典型的沙門菌在沙門顯色平板上為紫色

6、的菌落， 直徑 2-3mm。7.4.5 建議的初步篩查方案（初步生化特征見表 1）:表1 沙門菌、傷寒沙門菌、志賀菌及常見腸道菌的初步生化特征大部分 沙門菌傷寒 沙門菌志賀 氏菌大腸 桿菌枸檬酸 桿菌變形 桿菌TSI （斜面）K （紅色）K （紅色）K （紅色）A （黃色）A （黃色）K （紅色）TSI (底面)A （黃色）A （黃色）A （黃色）A （黃色）A （黃色）A （黃色）TSI (H2S)+ （黑色）小部分-+ （黑色）+ （黑色）TSI （產(chǎn)氣）+ （氣泡）-+ （氣泡）+ （氣泡）+ （氣泡）MIU （動力）+ （彌漫 生長）+ （彌漫 生長）-（沿接種 線生長）+ （彌漫 生

7、長）+ （彌漫 生長）+ （彌漫 生長）MIU （口引噪）-（黃色 圓環(huán)）-（黃色 圓環(huán)）-（黃色 圓環(huán)）+ （加試劑 變紅色）+ （加試劑 變紅色）-（黃色 圓環(huán)）MIU （尿素）-（黃色）-（黃色）-（黃色）-（黃色）-（黃色）+ （紅色）A :糞便（或肛拭子）一 SBG或SF增菌XLD分離一接種TSI和MIUB:糞便（或肛拭子）-SBG或SF增菌一YS分離一接種TSI和MIUC：糞便（或肛拭子） 一 SBG或SF增菌 一 XLD和麥康凱分離一接種TSI和MIUD：糞便（或肛拭子） f SBG或SF增菌 f YS和沙門顯色分離 f接種TSI和MIUE：糞便（或肛拭子）-SBG或SF增菌 X

8、LD和沙門顯色分離一接種TSI和MIU7.5 生化初步鑒定每個平板挑取35個分離較好的單個可疑菌落，分別接種到三糖鐵（TSI）和動力-呻噪-尿素培養(yǎng)基（MIU）, 36c ±1C培養(yǎng)1824h。沙門菌和志賀菌的生化特征見表 2。7.6 系統(tǒng)生化試驗(yàn)沙門菌和志賀菌初步鑒定陽性菌經(jīng)轉(zhuǎn)種營養(yǎng)瓊脂單，取單個菌落 進(jìn)行系統(tǒng)生化鑒定（可以使用APE20E或全自動生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行）。7.7 血清學(xué)試驗(yàn)7.7.3 志賀菌血清學(xué)試驗(yàn)7.7.3.1 挑取生化反應(yīng)實(shí)篩符合志賀菌的營養(yǎng)瓊脂斜面，首先用四種多價血清做玻片凝集反應(yīng)（4種多價包括：A群1、2型；B群和D群）。凝集者則用B群多價、D群和A1、A2、

9、血清分別凝集。7.7.3.2 若多價血清不凝集，可能為C群或A群的312型，應(yīng)進(jìn) 行C群的四種多價和A群另三種多價血清做玻片凝集。7.7.4 沙門菌血清學(xué)試驗(yàn)7.7.4.1 挑取生化反應(yīng)實(shí)篩符合沙門菌的營養(yǎng)瓊脂斜面，首先用A-F群O多價血清做玻片凝集反應(yīng)。7.7.4.2 若凝集可按常見O因子檢出頻率，按照O4-O10-O9-07-0801902011 順序凝集。7.7.4.3 H抗原凝集7.7.5 所有凝集陽性的菌落，都要同時用生理鹽水做凝集試驗(yàn)，只 有不出現(xiàn)自凝時，才可以報告陽性結(jié)果。8結(jié)果報告8.1 在初步生化鑒定符合后，可以先將可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色， 最后綜合生化及血清學(xué)結(jié)果，可以報告檢出（或未檢出）沙門菌（或 志賀菌）。8.2 對于從業(yè)人員體檢結(jié)果已經(jīng)納入檢驗(yàn)軟件管理的單位，可以直 接在檢驗(yàn)軟件中錄入相應(yīng)結(jié)果。8.3 其他單位可以設(shè)計(jì)專門的報告格式反饋給送檢單位或送檢科 室，檢驗(yàn)報告中應(yīng)至少包括姓名，性別，年齡，體檢編號，檢測結(jié)果。8.4 檢測結(jié)果為陰性，可以報告為未檢出腸道沙門菌和志賀菌； 檢測結(jié)果為陽性，根據(jù)