高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定食品中苯甲酸山梨酸脫氫乙酸的步驟

1、高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定食品中苯甲酸山梨酸脫氫乙酸的步驟1材料與方法：1.1儀器：(1)高效液相色譜儀(2) 分析天平，(3 )酸度計(jì)，(4)離心機(jī)，(5 )振蕩器，(6)超純水儀；試劑：(1)苯甲酸，(2) 山梨酸，(3) 脫氫乙酸，(4) 甲醇；提取試劑：(1)0.3%鹽酸乙醇溶液，(2) 0.02mol/L磷酸氫二鉀溶液1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精密稱取苯甲酸，山梨酸，脫氫乙酸對(duì)照品各適量，加乙醇溶解，配制成1.0mg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。1.3色譜參數(shù)和條件(1) 色譜柱：DIONEX Acclaim 120 C18(4.6*250mm,5 m)(2) 流動(dòng)相：甲醇一0.02mol/L磷酸氫

2、二鉀溶液(10:90)(3) 流速：1.0ml/min(4) 進(jìn)樣量：10丄(5) 檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm(苯甲酸，山梨酸)，293nm (脫氫乙酸)1.4樣品處理1.4.1固體樣品(如熟肉制品.豆制品及糕點(diǎn)類)(1) 稱取搗碎混勻的樣品5g (精確至0.01g )于具塞三角瓶中，(2) 精密加入25ml提取溶劑，振蕩1h后，于4C放置24h，(3) 離心，取上清液3ml，用水定量稀釋至10ml，離心，經(jīng)0.45 ym濾膜過濾,(4) 進(jìn)液相色譜儀分析。1.4.2液體樣品(如冷凍飲品)(1) 將樣品于室溫下解凍后，稱取 10g (精確至0.001g )于25ml量瓶中，(2) 用提取溶劑定容至刻

3、度，混勻，于 4C放置24h，(3) 離心，取上清液3ml，用水定量稀釋至10ml，離心，經(jīng)0.45 ym濾膜過濾,進(jìn)液相色譜儀分析。2數(shù)據(jù)處理2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液適量，用提取溶劑定量稀釋制成每ml中含0.1舊,0.5血,1血,4舊,8舊,12舊,16舊,20舊 的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，按前述色譜條件進(jìn)行 測(cè)定，且每個(gè)濃度做兩組平行試驗(yàn)，以濃度 C(g/ml)為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱 坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；標(biāo)準(zhǔn)混 合溶液 的濃度(pg/ml)0.10.5148121620峰面積以濃度C( pg/ml)對(duì)峰面積A進(jìn)行線性回歸，按信噪比3,計(jì)算檢出限2.2精密度和方法回收率試驗(yàn)(1)精密度

4、實(shí)驗(yàn)：取同一對(duì)照品溶液(各濃度均為10/ml )，重復(fù)進(jìn)樣，測(cè)出各峰面積的RSD值。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviationRSD)，又稱為變異系數(shù)(Coefficie nt of variatio n,C.V.)，通常用百分?jǐn)?shù)表示用來評(píng)價(jià)定量分析結(jié)果精密度的量度，是對(duì)同一樣品多次測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性和再現(xiàn)性的評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)采取8次樣品的結(jié)果測(cè)定而計(jì)算最后測(cè)得數(shù)據(jù)的RSD RSD計(jì)算如下公式：sRSD100%x其中：S標(biāo)準(zhǔn)偏差(Std Dev,Standard Deviation)xn次測(cè)定值的算術(shù)平均值精密度的測(cè)定通過測(cè)定多組數(shù)據(jù)而測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)偏差來評(píng)價(jià)，本方法通過測(cè)定10

5、舊/ml的對(duì)照品溶液測(cè)定9組，且每組做2個(gè)平行；樣品名峰面積（卩S*mir）濃度（mg/L）精密度10 g/ml-1精密度10 g/ml-1精密度10 g/ml-2精密度10 g/ml-2精密度10舊/ml-3精密度10舊/ml-3精密度10舊/ml-4精密度 10（_g/ml-4精密度 10（_g/ml-5精密度 10（_g/ml-5精密度10舊/ml-6精密度10舊/ml-6精密度10舊/ml-7精密度10舊/ml-7精密度10舊/ml-8精密度10舊/ml-8精密度10舊/ml-9精密度10©/ml-9將每?jī)山M平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值且通過計(jì)算出來的平均值通過excel計(jì)算出其標(biāo)準(zhǔn)

6、偏差s樣品名各組平行實(shí)驗(yàn)濃度平均值 （mg/L） 平均值X標(biāo)準(zhǔn)偏差S精密度10舊/ml-1精密度10舊/ml-2精密度10舊/ml-3精密度10舊/ml-4精密度10舊/ml-5精密度10舊/ml-6精密度10舊/ml-7精密度10舊/ml-8精密度10舊/ml-9S0 07949RSD = M 匯 100% = 0.07949 漢 100% = 0.0410%x1.9399(2)回收率實(shí)驗(yàn)：準(zhǔn)確度的計(jì)算通過測(cè)定加標(biāo)回收率，配制一定濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按8mg/kg,10mg/kg,12mg/kg的量加入樣品中，且每個(gè)濃度做3組，每組均做2個(gè)平 行試驗(yàn)，使數(shù)據(jù)更為精準(zhǔn)。按1.4方法處理，做

7、回收率試驗(yàn)樣品名峰面積(卩S*mir)濃度(mg/L)回收率8mg/kg-1回收率8mg/kg-1回收率8mg/kg-2回收率8mg/kg-2回收率8mg/kg-3回收率8mg/kg-3回收率10mg/kg-1回收率10mg/kg-1回收率10mg/kg-2回收率10mg/kg-2回收率10mg/kg-3回收率10mg/kg-3回收率12mg/kg-1回收率12mg/kg-1回收率12mg/kg-2回收率12mg/kg-2回收率12mg/kg-3回收率12mg/kg-3未加標(biāo)0.0000準(zhǔn)確度的評(píng)價(jià)通過測(cè)定回收率的方法，將被測(cè)樣品分為兩份，其中一份加入已知量的欲測(cè)組分，然后用同樣的方法分析這兩

8、份樣品，按公式計(jì)算回收率：XI00%冋收率 加入欲測(cè)組分樣品的測(cè)定結(jié)果一未加入欲測(cè)組份樣品測(cè)定結(jié)果 率=加入欲測(cè)組份量測(cè)出加標(biāo)的回收率越接近100%，說明此定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確度就越高樣品名平行實(shí)驗(yàn)濃度平均值回收率各加標(biāo)量回收率平均值(mg/L)回收率8mg/kg -1回收率8mg/kg 2回收率8mg/kg 3回收率10mg/kg -1回收率10mg/kg -2回收率10mg/kg -3回收率12mg/kg -1回收率12mg/kg -2回收率12mg/kg -33.結(jié)果與討論3.1流動(dòng)相及檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中測(cè)定防腐劑時(shí)流動(dòng)相采用甲醇一乙酸銨溶液系統(tǒng)，而乙酸銨溶液緩沖 能力較弱，部分樣品

9、溶液對(duì)PH較為敏感，從而導(dǎo)致脫氫乙酸峰出現(xiàn)拖尾，甚至 與山梨酸峰無法完全分離有機(jī)酸的 HPLC分析中，甲醇一磷酸鹽緩沖液系統(tǒng)是在 反相C18柱中最為常用的流動(dòng)相，能更好更穩(wěn)定的控制溶液的PH，本實(shí)驗(yàn)采用甲醇一0.02mol/L磷酸氫二鉀溶液PH7.0作為流動(dòng)相標(biāo)準(zhǔn)混合溶液色譜圖見圖（1） 有文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)苯甲酸山梨酸脫氫乙酸均通過230nm波長(zhǎng)檢測(cè)。利用紫外分光光度計(jì)對(duì)脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，在230nm及290nm處均有最大吸收，大量試驗(yàn)表明，不同基質(zhì)的樣品對(duì)色譜圖有不同程 度的基線干擾，293nm波長(zhǎng)的色譜圖基線平滑，優(yōu)于 230nm波長(zhǎng)的色譜圖，兩者計(jì)算的檢測(cè)限無明顯差別，因此，本

10、法沿用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T23377-2009和GB/T23495-2009的方法，脫氫乙酸通過293nm波長(zhǎng)檢測(cè)，苯甲酸山梨酸及糖精鈉通過 230nm波長(zhǎng)檢測(cè)。3.2提取方法的選擇樣品中蛋白質(zhì)及脂肪含量的高低直接影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性及色譜柱的使用壽 命，因此，沉淀蛋白質(zhì)成為樣品前處理的首要考量常用的沉淀蛋白質(zhì)方法有鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法重金屬鹽沉淀法及生物堿試劑沉淀法等，其中亞鐵氰化鉀 乙酸鋅溶液是最常用的蛋白質(zhì)沉淀劑，具有沉淀快速，濾液澄清的特點(diǎn)，然而大量實(shí)驗(yàn)證明，除樣品本身外，沉淀劑自身會(huì)產(chǎn)生大量絮狀沉淀， 對(duì)目標(biāo)物有不 同程度的吸附作用，從而使樣品回收率很難達(dá)到要求本法采用0.3%鹽酸乙醇溶 液作為提取溶劑，在酸性條件下，各組分都以分子狀態(tài)存在，易溶于乙醇中。乙醇具有