益生注射液抗大鼠腹主動(dòng)脈移植硬化的實(shí)驗(yàn)研究

1、益生注射液抗大鼠腹主動(dòng)脈移植硬化的實(shí)驗(yàn)研究摘要目的：探討不同濃度益生注射液A、B兩種組分及聯(lián)合用藥對(duì)移植物慢性失功（CAD）的防治效果及作用環(huán)節(jié)。方法：利用組織形態(tài)觀察;計(jì)算機(jī)象分析;過氧化脂質(zhì)測(cè)定和免疫組織化學(xué)分析大鼠腹主動(dòng)脈移植硬化加快模型。結(jié)果：術(shù)后6周A+B及驍悉（MMF）治療組能顯著抑制血管內(nèi)膜的增厚，B（10 mg.kg-1）、B(1 mg.kg-1)、A+B組術(shù)后各期過氧化脂質(zhì)（LPO）與術(shù)前比無明顯差異，各組TGF-1表達(dá)高峰在術(shù)后2周，空白對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)最強(qiáng)，A+B及MMF組表達(dá)最弱。結(jié)論：A組分通過抑制T、B淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)，間接下調(diào)TGF-1的表達(dá)，B組

2、分對(duì)氧自由基引起的損傷有明顯保護(hù)作用，A+B有協(xié)同作用，其作用與MMF單用相當(dāng)。關(guān)鍵詞益生注射液；大鼠；腹主動(dòng)脈移植中分類號(hào)：R969文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1006-0103（2000）03-0185-04EXPERIMENTAL STUDY ON YISHENG HERBAL INJECTION ANTIABDOMINAL AORTA SCLEROSIS OF TRANSPLANTATIONBU Hong CHEN Wei-guoLIU Yu-binWU Da-rongCHENG Jing-qiuWANG Li（The First University Hospital, West Chi

3、na University of Medical Sciences, Chengdu 610041 China）Abstract OEJECTIVE:To investigate the precluding effect and processing step of the Yisheng herbal injection in different concentration and coalition usage against CAD. METHODS: By abdominal aorta transplantational sclerosis model in rats.RESULT

4、S: Thickenning of endovascular could be inhibited significantly in 6 weeks after operation and MMF treatment group.There is no significant difference in LPO of B(10 mg.kg-1)、B(1 mg.kg-1)、AB(5 mg.kg-1) between pre-operation and after operation. The peak of TGF-1 expression was in 2 weeks after operat

5、ion. Each time point in control has the highest expression, where as A+B and MMF group have the lower expressions. CONCLUSION: The results suggest that a medicine down-regulate indirectly TGF-1 expression by inhibiting hyperplasia and infiltration of T、B lymphocytes and macrophage. B medicine plays

6、a protection role for injury caused by oxygen free redical. A+B have the coordinated action which is the same as MMF Key wordsYisheng injection; Abdominal aorta transplantation慢性失功（CAD）是影響移植物長(zhǎng)期存活的主要障礙之一，腎移植術(shù)后10年，CAD發(fā)生比例仍高達(dá)20%30%1。迄今尚無滿意的治療藥物，常規(guī)三聯(lián)免疫抑制劑不能阻止CAD進(jìn)程。從傳統(tǒng)中醫(yī)藥寶庫中去探索治療CAD的有效藥物具有重要意義。1材料與方法1.1材

7、料雄性封閉群SD與Wistar大鼠(華西醫(yī)大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)各105只，23月齡，體重（20020）g采用腹主動(dòng)脈移植硬化加快模型（移植段血管缺血24 h），行SDWistar腹主動(dòng)脈移植。丙二醛試劑盒（100人份，南京建成公司)。TGF-1多抗（130）(北京中山公司)。益生注射液A組分（30 mgml-1）、B組分（20 mgml-1）(成都市藥物制劑研究所)，該注射液是由巖黃連、四棱草、鳳凰爪等多種天然藥物提取而得的靜脈注射液,其有效成分已分別用于臨床，但尚未見用于抗移植慢性失功的報(bào)道。術(shù)后第一天起，經(jīng)腹腔注射給藥。MMF（每粒500 mg，瑞士羅氏公司）術(shù)后第一天起灌胃給藥（20mgkg

8、-1）。1.2方法將受鼠隨機(jī)分為I、II、III、IV、V、VI、VII七組，每組15只，分別于術(shù)后1周、2周、6周各處死5只，其中I組為空白對(duì)照組、VII組為MMF陽性對(duì)照組，以上兩組供鼠腹主動(dòng)脈取下后置04高滲枸櫞酸腺嘌呤液(HCA)保存?zhèn)溆?，II、III、IV、V、VI組分別為A大（6 mgkg-1）、A?。? mgkg-1）、B大（10 mgkg-1）、B小(1 mgkg-1)、A（3 mgkg-1）+B（5 mgkg-1）給藥組，供鼠腹主動(dòng)脈取下后分別置于04A大（480 gml-1）、A?。?20 gml-1）、B大（500 gml-1）、B小（125 gml-1）、A（240 g

9、ml-1）+B（250 gml-1）中保存?zhèn)溆谩?.3標(biāo)本采集與檢測(cè)按觀察時(shí)間點(diǎn)切取植入段腹主動(dòng)脈，石蠟切片，行HE染色，光鏡觀察組織學(xué)改變。采用計(jì)算機(jī)像分析系統(tǒng)，將HE染色結(jié)果經(jīng)光鏡放大400倍后輸入計(jì)算機(jī)，對(duì)像進(jìn)行灰度換算，自動(dòng)測(cè)出移植的腹主動(dòng)脈內(nèi)膜、中膜層面積，計(jì)算出內(nèi)膜厚度內(nèi)膜厚度=內(nèi)膜面積（內(nèi)膜面積+中膜面積）2。1.3.1過氧化脂質(zhì)（LPO）測(cè)定受試鼠術(shù)前頸外靜脈插管，分別于術(shù)前、術(shù)后2、4及24 h抽取靜脈血0.3 ml，肝素抗凝，1500 rmin-1離心10min。取0.1 ml血清，用丙二醛試劑盒在UV-1601PC（日本島津）紫外分光光度儀下測(cè)定氧自由基代謝產(chǎn)物之一的丙二

10、醛水平，以反映氧自由基對(duì)細(xì)胞損傷程度。1.3.2免疫組化檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1（TGF-1）在移植段血管壁的表達(dá)石蠟切片，LSAB法3，由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生光鏡下盲法讀片，按著色程度不同分為0級(jí)（無明顯著色），1級(jí)（少量著色），2級(jí)（中量著色），3級(jí)（大量著色）。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)資料結(jié)果均以SD表示，采用SPSSV8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1腹主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度的變化2周時(shí)，I組內(nèi)膜厚度為0.2250.120，與術(shù)前比明顯增厚，治療組內(nèi)膜增厚不明顯，6周時(shí)，VI、VII組內(nèi)膜厚度分別為0.1270.097、0.1280.076，組間無顯著差異（P0.05），

11、而與A組同期（0.2710.087）相比差異顯著（P0.01）(1)。1腹主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度的變化Fig1 Changes in thickness of the endothelium of abdominal aorta2.2腹主動(dòng)脈組織病理變化正常大鼠腹主動(dòng)脈，內(nèi)皮細(xì)胞扁平，呈單層緊密連接，中膜由46層彈力纖維構(gòu)成，其間散在多量梭形平滑肌細(xì)胞（SMC），外膜較薄，由致密結(jié)締組織組成。缺血24 h組SDWistar移植后6周，內(nèi)膜明顯增厚，中膜SMC壞死較重，各層炎細(xì)胞浸潤(rùn)較重。缺血24 h組SDWistar移植，A+B治療后6周，內(nèi)皮細(xì)胞稍多，中膜層SMC可見壞死，各層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)均較輕。缺

12、血24 h組SDWistar移植，MMF治療后6周，內(nèi)皮細(xì)胞稍多，中膜層SMC可見壞死，各層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)均較輕。2.3血清LPO變化I、II、III三組術(shù)后2 h血清LPO值較術(shù)前明顯升高（P0.05），術(shù)后4、24h與術(shù)前比無明顯變化，使用B組分治療的IV、V、VI組，術(shù)后各期與術(shù)前比無明顯差別(2)。2血清LPO變化Fig 2 Changes in serumal LPO2.4腹主動(dòng)脈壁TGF-1的變化各組TGF-1表達(dá)高峰均在術(shù)后2周，A組各時(shí)間點(diǎn)TGF-1的表達(dá)最強(qiáng)，、組表達(dá)最弱，其余各組介于其間(表1)。表1TGF-1在各組中的表達(dá)Table 1 Expression of TGF-

13、1 in each groupGroup1week2week6week0123023012313141122322322122122212122322122124112213131131113321313討論 CAD是免疫因素和非免疫因素共同對(duì)移植物的損傷形式，前者指由于組織不相容而導(dǎo)致的對(duì)外來抗原的免疫反應(yīng)，在移植失功中起關(guān)鍵作用。后者包括缺血/再灌注（I/R）損傷、巨細(xì)胞病毒感染、高脂血癥、術(shù)后高血壓、免疫抑制劑的毒性作用等。隨著對(duì)CAD機(jī)理了解的不斷深入，非免疫因素在CAD中的作用越來越受到重視。Land4等提出理想的免疫抑制劑需具備以下五個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)改善患者生存質(zhì)量無負(fù)面影響；能有效抑制

14、和防治急、慢性排斥反應(yīng)；能最大限度降低與CsA相關(guān)的腎毒性、感染發(fā)生率及腫瘤發(fā)生率；適用于各種臨床移植；價(jià)格合理。目前尚無一種既能逆轉(zhuǎn)急性排斥反應(yīng)，又能抑制CAD的理想藥物。因此，尋找有效、安全、價(jià)廉的防治藥物迫在眉睫。3.1LPO在CAD中的作用血清中LPO由氧自由基氧化細(xì)胞膜及血中低密度脂蛋白而來，有顯著致動(dòng)脈粥樣硬化作用。由于氧自由基對(duì)移植物的損傷是I/R損傷的同義詞，隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)，I/R損傷加重LPO值逐漸升高。檢測(cè)血清中LPO值可反映I/R對(duì)移植物的損傷程度。本研究顯示各組LPO峰值均在術(shù)后2小時(shí)，提示血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷高峰發(fā)生在術(shù)后2小時(shí)，早期抗I/R損傷意義重大。3.2TGF-1

15、在CAD中的作用TGF-1由血小板、T細(xì)胞、系膜細(xì)胞和單核、巨噬細(xì)胞等分泌，具有多向調(diào)節(jié)功能，最終導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)合成增加，降解減少，刺激SMC增殖、遷移，引起移植物功能不斷惡化5。本研究顯示各組TGF-1高峰均出現(xiàn)在術(shù)后2周，此時(shí)SMC增殖、遷移明顯，6周時(shí)TGF-1表達(dá)下降，SMC增殖、遷移減弱。提示早期抗炎治療可能延緩CAD的發(fā)展。3.3MMF的作用6,7MMF通過可逆性抑制次黃嘌呤單核苷酸脫氫酶，特異性抑制T和B淋巴細(xì)胞中的嘌呤經(jīng)典合成途徑抑制淋巴細(xì)胞增殖，繼而抑制抗體形成和SMC增生，是目前公認(rèn)既能抑制急性排斥反應(yīng)，又能用于治療慢性排斥的藥物。故選作陽性對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)中見到MMF組術(shù)后各

16、時(shí)相炎性細(xì)胞浸潤(rùn)均較輕，2周、6周內(nèi)膜增厚也不明顯。3.4益生注射液A組分的作用A組分的有效成份為生物堿，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)苊黠@抑制小鼠T、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活性，具有抗菌消炎，抑制紅細(xì)胞溶血等作用。移植段腹主動(dòng)脈受到I/R損傷后，淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增加，分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1（TGF-1）并提高SMC上血小板樣生長(zhǎng)因子（PDGF）-、受體表達(dá)及其對(duì)外源性PDGF的反應(yīng)性，使SMC增殖、遷移，啟動(dòng)動(dòng)脈硬化進(jìn)程8。采用A藥治療后LPO未見明顯下降，但內(nèi)膜增厚及TGF-1的表達(dá)較未治療組輕，推測(cè)其通過下調(diào)TGF-1的表達(dá)而發(fā)揮治療作用，A大作用強(qiáng)于A小，提示作用呈劑量效應(yīng)關(guān)系。3.5益生注射液B組

17、分的作用缺血時(shí)由于氧及能量缺乏可導(dǎo)致細(xì)胞腫脹，甚至破裂；再灌注更加重受損細(xì)胞及白細(xì)胞釋放氧自由基及毒性代謝產(chǎn)物，氧化細(xì)胞膜及血中的低密度脂蛋白，形成具有很強(qiáng)致動(dòng)脈粥樣硬化作用的氧化型低密度脂蛋白。B是活血化淤類中藥，能明顯抑制血小板聚集，降低血流粘滯度，促進(jìn)微動(dòng)脈血流恢復(fù)，改善微循環(huán)。同時(shí)對(duì)動(dòng)脈硬化進(jìn)程中的組胺有明顯抑制作用，并可通過明顯抑制血中及缺血再灌注時(shí)組織中氧自由基損傷的主要代謝產(chǎn)物之一的丙二醛（MDA），保護(hù)抗氧化酶系統(tǒng)和ATP酶活性，減輕氧自由基對(duì)組織的損害。B治療后LPO值于術(shù)后2小時(shí)未見明顯升高，術(shù)后內(nèi)膜增厚及TGF-1的表達(dá)均較未治療組輕。B小較B大有效，推測(cè)可能因大劑量B對(duì)

18、一氧化氮合成酶有輕度的抑制作用；另外大劑量B可減少抗氧化劑如谷胱苷肽的產(chǎn)生。3.6A+B的作用影響CAD的因素眾多，包括免疫因素和非免疫因素，這兩類因素之間有協(xié)同作用。A、B兩藥聯(lián)合使用分別作用于不同環(huán)節(jié)，從不同環(huán)節(jié)打斷CAD的惡性循環(huán)，因而效果較好，其作用與MMF單用相當(dāng)或略優(yōu)。本研究顯示，A、B、A+B、MMF均可不同程度緩解CAD發(fā)展。A可下調(diào)TGF-1的表達(dá)（A大作用強(qiáng)于A?。?；B能降低LPO（B小作用強(qiáng)于B大），A+B有協(xié)同作用，其作用與目前公認(rèn)最好的抗慢排藥MMF單用相當(dāng)或略優(yōu)，但價(jià)格較MMF明顯降低，可望推向臨床。作者簡(jiǎn)介： 步宏，男，醫(yī)學(xué)博士，副教授，從事移植病理學(xué)工作。*現(xiàn)工

19、作單位成都軍區(qū)總醫(yī)院步宏（華西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，四川 成都610041）陳衛(wèi)國(guó)（華西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，四川 成都610041）劉于賓（華西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，四川 成都610041）吳大蓉（成都市藥物制劑研究所，四川 成都610072）程驚秋（華西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，四川 成都610041）王莉（華西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，四川 成都610041）參考文獻(xiàn)1，Knechtle S. Chronic rejection: The clinical problem. J.Graft, 1998, 1(2 supple II): 472，Motomura N, Lon H, Maurice

20、 P, et al. Acceleration of arteriosclerosis of the rat aorta allograft by insulin growth factor-1J. Transplantation, 1997, 63(7): 9343，蘇紅，谷代平，胡海霞LSAB法與ABC法免疫組化染色敏感性的對(duì)比研究J中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,1995, 4：2964，Land W. Clinical immunosuppressive matrix in organ transplantationJTransplant Proc.1994, 26:24795.5，Sharma VK, Li B, Ding R, et al. Chronic allograft n