蛋白質(zhì)定量BCA法

1、工作液，充分混勻。BCA工作液室溫下24h內(nèi)穩(wěn)定實驗原理BCA（bicinchoninic acid）是一種穩(wěn)定的水溶性復(fù)合物，在堿性條件下，二價銅離 子可以被蛋白質(zhì)還原成一價銅離子，一價銅離子可以和BCA相互作用，兩分子的BCA螯合一個銅離子，形成紫色的絡(luò)合物，該復(fù)合物為水溶性，在562nm處顯示強(qiáng)吸光性，在一定濃度范圍內(nèi)，吸光度與蛋白質(zhì)含量呈良好的線性關(guān)系， 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此可以根據(jù)待測蛋白在562nm處的吸光度計算待測蛋白濃度。STEP 1.Protein + W原理圏：步驟丄實驗準(zhǔn)備1. BCA定量試劑盒：含A液和B液A液：BCA堿性溶液（配方：1%BCA二鈉鹽，%氫氧化鈉，%酒石酸

2、鈉，2%無水碳酸鈉，%碳酸氫鈉，這些液體混合后再調(diào)PH至）B液：4%硫酸銅2.牛蛋白血清（BSA）3待測的蛋白樣品實驗步驟工作液，充分混勻。BCA工作液室溫下24h內(nèi)穩(wěn)定1.配置BCA工作液：將A液和B液搖晃混勻，按照A:B=50:1的比例配置BCA2.配置不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白液（BSA） ,1ug/ul,ug/ul,5 ug/ul,ug/ul,10 ug/ul，待測蛋白樣品在什么溶液中，就用該溶液來稀釋標(biāo)準(zhǔn)蛋白液（如待測樣品溶于強(qiáng)RIPA裂解液，則用強(qiáng)RIPA裂解液來稀釋標(biāo)準(zhǔn)蛋白液）。3.取空白組（Oug/ul BSA）各濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白液5ul加入96孔板中，另取待測 的蛋白樣品5ul，加入9

3、6孔板。Od ml sample + 2.0 ml working reagentPS:上圖加樣的量僅作為參考，蛋白液和BCA工作液的比例符合即可4.向各孔的蛋白液中加入300ul的BCA工作液，混勻，37度放置30分鐘,（加樣時應(yīng)當(dāng)動作輕柔，防止產(chǎn)生氣泡影響讀數(shù)） 。PS:溫度和放置時間可以調(diào)整，可在60度放置30分鐘or室溫放置2小時。5.靜置結(jié)束后，冷卻至室溫，用酶標(biāo)儀測定 線。Incubate: 30 mil. at 37 C6.根據(jù)待測樣品的吸光度，比對標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算蛋白的濃度注意事項50 parts44A +1 part BMix workinq reaqentMix well56

4、2nm出的吸光度，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲SpectropholometerRead 3(56；rmThen coalBCA法測定蛋白濃度時，吸光度可隨時間的延長不斷加深，且顯色反應(yīng)會隨溫 度升高而加快，故如果濃度較低，適合較高溫度孵育or延長孵育時間。標(biāo)準(zhǔn)蛋白液的加量應(yīng)當(dāng)準(zhǔn)確，如果加量不準(zhǔn)確，會導(dǎo)致制作出來的標(biāo)準(zhǔn)曲線出 現(xiàn)偏差，影響待測樣品的濃度計算，所以一方面需要用梯度稀釋的方法來配置 標(biāo)準(zhǔn)蛋白液，另一方面應(yīng)使用精確度高的移液槍。A液和B液混合可能出現(xiàn)渾濁，此時應(yīng)成分振蕩混勻，最后可見透明溶液。為加快BCA法測定蛋白濃度的速度可以適當(dāng)用微波爐加熱，但切勿過熱。當(dāng)結(jié)果出現(xiàn)空白組本身就有較高的背景，可用B

5、radford法重新測定蛋白濃度。優(yōu)缺點優(yōu)點：測定快速簡便，45分鐘內(nèi)完成準(zhǔn)確靈敏，檢測濃度為5-200 mg/ml干擾物質(zhì)少，BCA法不受大部分樣品中的去垢劑等化學(xué)物質(zhì)影響，可兼容樣品中高達(dá)5%的SDS，5%Triton X-100,5%的Tween 20在一定濃度范圍內(nèi)，有良好的線性關(guān)系檢測不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)小于考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量缺點：與熒光蛋白質(zhì)定量等方法相比，屬于化學(xué)呈色法的BCA法檢測靈敏度尚不夠蔗糖、尿素、NH4+和EDTA影響測定結(jié)果BCA 蛋白定量和 Bradford 法蛋白定量的區(qū)別:2、BCA 法蛋白濃度定量是二價銅離子在堿性的條件下，可以被蛋白質(zhì)還原成一價銅離子(

6、biuret reaction )，價銅離子和獨特的BCA Solution A (含有 BCA)相互1、Bradford 法測得的主要是堿性氨基酸和芳香族氨基酸,BCA 則沒有選擇性作用產(chǎn)生敏感的顏色反應(yīng)。兩分子的BCA 螯合一個銅離子，形成紫色的反應(yīng)復(fù)合物。該水溶性的復(fù)合物在562nm 處顯示強(qiáng)烈的吸光性，吸光度和蛋白濃度在廣泛范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，因此根據(jù)吸光值可以推算出蛋白濃度。Bradford 法蛋白定量是染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后引起染料最大吸收的改變，從465nm 變?yōu)?595nm，光吸收增加。蛋白質(zhì)染料復(fù)合物具有高的消光系數(shù)，因此大大提高了蛋白 質(zhì)測定的靈敏度，最低檢出量為1蛋白。染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合是很迅速的過程，大約需 2min，結(jié)合物的顏色在 1h 內(nèi)是穩(wěn)定的。一些陽離子，如K+ , Na+ , Mg2+ ,(NH 4 ) 2 SO 4 ，乙醇