瘧原蟲(chóng)血片制作

1、瘧原蟲(chóng)血片的制作一、需要材料1. 采血器材： 75% 酒精棉球、一次性采血針、玻片、推片、鉛筆、干凈的綢布或化纖布。2. 染色材料： 姬氏原液 .蒸餾水或純凈水:稀釋姬氏原液 染色時(shí)沖洗染液固定劑： 用甲醇或無(wú)水乙醇（乙醇含量達(dá) 99.9% ），固定薄血膜用無(wú)水乙醇擦洗油鏡頭。 脫油劑： 無(wú)水乙醚或二甲苯：鏡檢后的血片脫鏡油。油鏡頭脫油可用無(wú)水乙醚：無(wú)水乙醇的 7:3 混合液擦拭。 擦鏡紙。二、采血前準(zhǔn)備：1. 玻片準(zhǔn)備我們現(xiàn)在用的玻片都是除去油漬的脫脂玻片， 使用前可用綢布擦去玻片上纖維和浮灰，即可使用。新的尚未脫油脂的玻片：用洗衣粉水洗凈后，一一浸泡于 95% 的酒精中約一周時(shí)間，然后一一

2、取出，用軟而潔凈并沒(méi)有棉花纖維的細(xì)布擦干，擦亮，收藏好。已用過(guò)的舊玻片：先消毒后用洗滌劑清洗，去除污漬，再一一浸泡于95% 的酒精中約一周時(shí)間，然后一一取出， 用軟而潔凈并沒(méi)有棉花纖維的細(xì)布擦干，擦亮，收藏好。2. 玻片編號(hào)：在玻片的磨砂端用鉛筆進(jìn)行編號(hào)。玻片編號(hào)、檢驗(yàn)報(bào)告單號(hào)和登記號(hào)應(yīng)一致，并具有唯一性。3. 采血時(shí)間：間日瘧、三日瘧原蟲(chóng)患者可在發(fā)作的任何時(shí)間進(jìn)行采血，但由于患者剛發(fā)冷發(fā)熱以后，大部分是在環(huán)狀體期，故這一時(shí)期區(qū)別瘧原蟲(chóng)種類(lèi)是不容易的。所以在發(fā)作后的6 8 小時(shí)內(nèi)采血為最佳，這時(shí)環(huán)狀體以滋養(yǎng)發(fā)育成晚期滋養(yǎng)體，較易識(shí)別。惡性瘧原蟲(chóng) ;從理論上講， 因?yàn)閻盒辕懺x(chóng)的裂體生殖是在內(nèi)臟

3、的毛細(xì)血管內(nèi)進(jìn)行的，所以在發(fā)作之前，患者的末梢血液中不易查到，但實(shí)際情況不盡如此，一般在受感染者的末梢血液中，隨時(shí)能見(jiàn)到少量的惡性瘧原蟲(chóng)的環(huán)狀滋養(yǎng)體；雖然如此，較理想的采血時(shí)間，是在發(fā)作后的 20 小時(shí)左右，因?yàn)檫@個(gè)時(shí)候，環(huán)狀體雖已發(fā)育至最高峰，但尚未回到內(nèi)臟毛細(xì)血管中去進(jìn)行裂體生殖。環(huán)狀體的數(shù)量和構(gòu)造。有助于瘧原蟲(chóng)種類(lèi)的鑒別，惡性瘧原蟲(chóng)的配子體很容易識(shí)別，但在初發(fā)時(shí)，一般需要在發(fā)作 7 10 日后才能在末梢血液在出現(xiàn)，應(yīng)當(dāng)注意。4. 采血的部位和方法；部位：以耳垂采血為主。若由指頭取血?jiǎng)t受檢者痛楚較大，且容易引起創(chuàng)口感染，一般不易采用。嬰兒可采集足跟或拇指。方法：讓受檢者位于我們右前方，采集

4、右耳垂血液，這樣便于方便操作，以75% 酒精棉球消毒耳垂， （在消毒前擠出多余酒精）待酒精干后，左手拇指和食指緊捏耳垂，右手持一次性采血針迅速刺入，稍用力擠壓（酒精不干不能擠壓，以免血液流出不成滴狀，也不可用干棉花拭去多余酒精，因干棉花中碎纖維較多而污染血膜），采血后應(yīng)盡快制作血片，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)形成纖維蛋白，出現(xiàn)凝血。5. 厚、薄血膜制作，染色：厚、薄血膜的形態(tài)和位置：薄血膜：寬 2 ，長(zhǎng) 2.5 .厚血膜直徑0.8 1.0 .假定將玻片劃成三等分，則厚血膜應(yīng)位于中格靠右側(cè)線(xiàn)處，薄血膜則從玻片中央起至左格中部止，右端空格供記錄姓名，編號(hào)或貼標(biāo)簽用。厚血膜制作： 待血液滴呈綠豆大小時(shí)，血量大約4

5、5ul 用推片的左端下角刮取血滴，放于載玻片的右側(cè)，自?xún)?nèi)向外涂成0.8 1.0cm 直徑的血膜，涂片結(jié)束前回轉(zhuǎn)一下， 使厚血膜均勻。厚血膜制作完畢，用酒精棉球擦去玻片上的血跡，再用干的干凈的布拭去殘留的酒精，厚血膜的厚度以一個(gè)油鏡視野內(nèi)可見(jiàn)到 510 個(gè)白細(xì)胞為宜。薄血膜的制備：用推片中央沾取一小滴血 , 在玻片左側(cè)距離厚血膜約 0.5cm 處，與載玻片接觸， 推片與玻片約成 25 °35 °夾角，當(dāng)血液沿推片的邊緣擴(kuò)展至2 寬 時(shí)向左邊勻速推成舌狀薄血膜。推成的血膜約成 2cm 寬×2.5cm 長(zhǎng)的薄血膜，薄血膜的用血量較少， 約是厚血膜的 1/10 約為 1.

6、0ul 1.5 ul（有推薦用 0.5ul 1.0 ul ）即可。推片速度的快慢和角度均影響薄血膜的厚薄程度，最理想的薄血膜是一層血細(xì)胞，血細(xì)胞的分布排列比較均勻，無(wú)裂縫、無(wú)空泡。采血完畢，用干棉花擦拭耳垂上的血液，推片上的血跡用酒精棉球擦去，再用干布擦干待用（不能使用掉纖維的布）。無(wú)論在擦拭玻片，制作血片或染色血片時(shí)，手指切勿觸及玻片之上下面以免手上油脂污及玻片面，使薄血膜涂布不均厚血膜易于脫落。另外推片手持端應(yīng)作標(biāo)記，兩端盡量不要混拿，以免人手經(jīng)常拿捏，推片受到手上的油漬污染而影響血膜質(zhì)量。血片干燥制成的血膜必須完全干燥后方可進(jìn)行固定染色，否則薄血膜中紅細(xì)胞邊緣褶皺，厚血膜染色時(shí)易脫落，而

7、出現(xiàn)網(wǎng)狀的背景。反之，血片放置過(guò)久則有霉菌及枯草桿菌生長(zhǎng)，血紅蛋白凝固，也不能鏡檢。薄血膜在自然情況下約需10 分鐘，厚血膜需 30 分鐘。應(yīng)將血片用有蓋器皿罩住，防灰塵落入，放37 溫箱， 20 分鐘可干透。 放入溫箱干燥時(shí)間不能超過(guò)1 周，否則染色后厚血膜背景顏色較深，影響觀察。厚血膜如不能及時(shí)染色時(shí)，先將薄血膜固定，夏天應(yīng)在48 小時(shí)內(nèi)，冬天應(yīng)在 72 小時(shí)內(nèi)對(duì)厚血膜進(jìn)行溶血處理（不適用抗凝血） ，干燥后再保存。否則厚血膜會(huì)自然固定而不能溶血，影響鏡檢。注意：制成的血片切勿用火烤、日曬或放在新購(gòu)置的標(biāo)本盒內(nèi)，以免血紅蛋白凝固無(wú)法脫掉。血片放置待干時(shí)不可傾斜，否則厚血膜中血細(xì)胞沉在一邊，可

8、使厚薄不均。此外，還要防止蒼蠅吮吸和 灰塵污染。 .固定、染色（姬氏染色法）干燥后的血片用棉簽蘸取甲醇或無(wú)水乙醇在薄血膜上輕輕涂抹（最好是將甲醇倒入一個(gè)干凈的50mL 小燒杯中，將薄血膜浸沒(méi)其中，以減少棉簽中的灰塵和碎纖維的污染） ，注意不要碰到厚血膜，否則使血紅蛋白凝固，厚血膜不能鏡檢，約 1 2 分鐘血片干后，即可進(jìn)行染色。染液的稀釋?zhuān)喝疽涸谂R用前要進(jìn)行稀釋?zhuān)厦姘l(fā)放的姬氏為原液。其稀釋方法： 8m水 ( 到空染色瓶的頸部)加 10 滴原液，染20 25min，實(shí)際工作中我們經(jīng)過(guò)比對(duì)，覺(jué)得8mL水加14 滴原液能達(dá)到較為滿(mǎn)意的效果，并根據(jù)血片的數(shù)量，按每張血片滴加染液1.5 2mL 的量，

9、配制稀釋液量，稀釋后的染色液最好一次用完，放置過(guò)久影響著色效果。若厚血膜過(guò)厚，可先滴加蒸餾水?dāng)?shù)滴溶去血紅蛋白，約需2min ，時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則血膜易脫落，傾去蒸餾水，待血膜干后再滴加染液染色，或直接在厚血膜上滴加2 滴蒸餾水后， 不倒去蒸餾水即刻直接滴加稀釋染液（注：這兩種方法對(duì)抗凝血不適用）使染液覆蓋整個(gè)血膜。 夏天染 25 30min 即可，冬天需 40 60min 能達(dá)到較為滿(mǎn)意的效果。沖洗、干燥： 血片染到時(shí)間后，用蒸餾水沖洗，沖洗時(shí)不能對(duì)準(zhǔn)血膜沖，應(yīng)在無(wú)血膜地方注加蒸餾水，使染液溢出，直到染液沖洗完，切不可先倒去染液，否則染液殘?jiān)皆谘ど霞幢阍贈(zèng)_洗多遍也無(wú)濟(jì)于事，或在一個(gè)盆中放

10、入足夠多水，將血片和染液一同浸入水中漂洗并在水中擺動(dòng)幾下 (對(duì)于用抗凝血制成的血片，在沖洗時(shí)厚血膜極易脫落，所以只能用此種方法漂洗 )，對(duì)去除灰塵和染液殘?jiān)Ч容^好。 沖洗好的血片放于自然環(huán)境下 1 2h ，或 37 溫箱 20min 左右即可鏡檢。染色效果判斷：著色較好的血膜，紅細(xì)胞呈淡紅色，嗜酸性粒細(xì)胞的顆粒呈桔紅色，嗜中性粒細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，中性粒細(xì)胞胞漿顆粒呈淡紅色，淋巴細(xì)胞及瘧原蟲(chóng)胞漿呈藍(lán)色或淡藍(lán)色，瘧原蟲(chóng)核呈紅色。除環(huán)狀體外，其他各期均可查見(jiàn)瘧色素。影響染色效果的因素：染料和溶劑的質(zhì)量：染料、甲醇和甘油如不純， 常使配成的染液偏酸或偏堿， 影響染色結(jié)果。因此，必須用分析純的甲醇和中

11、性甘油，配制時(shí)所用器具必須干凈無(wú)水。染液的新舊：新配制的染液，一般著色力較弱，常呈堿性。染液放置時(shí)間稍長(zhǎng)，染色力逐漸增加，故應(yīng)在染色前 1 2 周先將染液配好。盛染液的瓶子應(yīng)密封，以免影響染液質(zhì)量染液稀釋后的使用時(shí)間：染液稀釋后，一般在半小時(shí)內(nèi)使用，時(shí)間太長(zhǎng)也會(huì)影響染色效果染液的濃度：染液濃度高，著色快，各種細(xì)胞著色深，薛氏點(diǎn)、茂氏點(diǎn)等粗大顯著；染液濃度低，著色慢，但各種細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)著色均勻、清晰，如環(huán)狀體、子孢子及瘧色素等顏色分明，但薛氏點(diǎn)、茂氏點(diǎn)不夠清楚。染色時(shí)間（應(yīng)根據(jù)染液的質(zhì)量、新舊、濃度和氣溫決定）；染色時(shí)間長(zhǎng)，染色效果好，溫度高著色快，染色用水的 PH 值（ 7.0 7.2 ）：當(dāng)

12、染色太藍(lán)，可用 PH 較低的緩沖水沖洗；如染色太紅，則用 PH 較高的緩沖水沖洗；如染色太深，可延長(zhǎng)沖洗時(shí)間，予以糾正。沖洗方法：染色后不能直接將染液倒掉。應(yīng)將玻片連同染液一起放入水中漂洗，或沿玻片及染色缸邊緣加水使染液表層溢出，并輕輕沖洗，以免染色顆粒沾污血膜。附：瑞氏染色與姬氏染色的區(qū)別瑞氏染色姬氏染色厚 血 片薄 血 片厚 血 片薄 血 片血片制作相 同相 同相 同相 同干 燥2030 分鐘2030 分鐘2030 分鐘2030 分鐘厚、薄血膜染用蒸餾水溶 不需要處理不需要處理用甲醇或無(wú)水色前的處理去血紅蛋白（若厚血膜較乙醇固定至血膜呈灰厚，可先溶血）白色，干燥染 色 液不需要稀釋臨用前用

13、蒸餾水稀釋染色時(shí)間原液染色 1分鐘。再加蒸餾氣溫 20以上染 3040 分鐘；水稀釋后染 78 分鐘。20以下染 4060 分鐘。干 燥2030 分鐘2030 分鐘鏡 檢100×（油鏡頭）姬氏染色效果穩(wěn)定，染色時(shí)間和染液濃度對(duì)結(jié)果影響較小，染色后的血膜保存時(shí)間較長(zhǎng)，同時(shí)姬氏染劑能長(zhǎng)期保存而不變質(zhì)，染色技術(shù)也易掌握，被推薦使用， 瑞氏染色法因操作簡(jiǎn)便，常用于個(gè)別血片染色。三、鏡檢工作中所注意的事項(xiàng)1. 在鏡檢中顯微鏡的使用：油鏡、凹鏡、視野需按一定的順序逐個(gè)檢查。2.瘧原蟲(chóng)鏡檢工作中，凡是發(fā)熱病人。瘧疾、疑似瘧疾、及不明原因的發(fā)熱病人均需要進(jìn)行瘧原蟲(chóng)鏡檢。3. 做好鏡檢登記： 凡是鏡檢瘧原蟲(chóng)的均需如實(shí)登記， 陰陽(yáng)性片保存待查，4.如發(fā)現(xiàn)惡性瘧以最快的通信方式上報(bào)。四、實(shí)際工作中我們發(fā)現(xiàn)的幾個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題歸納如下1. 血片制作不規(guī)范比較常 厚血膜血量較大，薄血膜用力不均勻，薄血膜制作較厚 血膜位置不規(guī)范，厚、薄血膜安排不當(dāng)。厚、薄血膜間距離相隔過(guò)大血膜太靠近玻片的邊緣。厚、薄血膜位置顛倒，方向錯(cuò)誤，將薄血膜沿著厚血膜方向推，厚、薄血膜易相觸2. 將姬氏染色方法與瑞氏染色方法混淆姬氏原液不稀釋?zhuān)苯拥渭釉谘ど?，使厚、薄血膜均被固定。厚血膜一團(tuán)黑，不能鏡檢。薄血膜未固定，直接用姬氏染色，薄血膜脫落。3. 染色時(shí)間不夠，滴加染液后很快