酵母雜交技術(shù)原理及應(yīng)用課件

1、酵母雜交技術(shù)原理及應(yīng)用目的基因的分離目的基因的功能克隆序列克隆法篩選目的基因片段的差別雜交及減法雜交技術(shù)利用差示分析法分離目的基因克隆DNA插入誘變法分離目的基因根據(jù)生物大分子間的相互作用分離目的cDNA克隆酵母雜交技術(shù)原理及應(yīng)用目的基因的功能克隆通過聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他蛋白分離技術(shù)分離出一定發(fā)育時(shí)期的特異蛋白通過聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他蛋白分離技術(shù)分離出一定發(fā)育時(shí)期的特異蛋白應(yīng)用蛋白質(zhì)測序技術(shù)測定特異氨基酸序列，應(yīng)用蛋白質(zhì)測序技術(shù)測定特異氨基酸序列，推測編碼該蛋白的核苷酸序列，人工合成一段寡核苷酸片段作為探針推測編碼該蛋白的核苷酸序列，人工合成一段寡核苷酸片段作為探針從從cDNA文庫或基

2、因組文庫中篩選相應(yīng)的基因文庫或基因組文庫中篩選相應(yīng)的基因?qū)⒎蛛x純化的特定編碼蛋白作為抗原，利用免疫動(dòng)物制備抗體將分離純化的特定編碼蛋白作為抗原，利用免疫動(dòng)物制備抗體用特異的蛋白質(zhì)抗體篩選含有目的基因插入序列的用特異的蛋白質(zhì)抗體篩選含有目的基因插入序列的cDNA表達(dá)文庫，分離出含有表達(dá)文庫，分離出含有目的基因的克隆。目的基因的克隆。酵母雜交技術(shù)原理及應(yīng)用在平板上涂布涂布文庫和制備硝酸纖維濾膜的拷貝然后將濾膜處理濾膜處理（但不能在80度烘烤），暴露菌落或噬菌斑中的蛋白，在將濾膜放入含有抗體抗體的溶液中，溫育溫育一定時(shí)間后，洗去未結(jié)合的抗體洗去未結(jié)合的抗體，在加入第二抗體加入第二抗體或葡萄球菌蛋白A

3、。第二抗體是用放射性同位素或生物素或酶標(biāo)記的，通過該標(biāo)記找到表達(dá)產(chǎn)物能與抗體結(jié)合的克隆，從而篩選出目的cDNA克隆。返 回酵母雜交技術(shù)原理及應(yīng)用自然界中有一些蛋白質(zhì)的核苷酸編碼序列，在其進(jìn)化的過程中保持著高度的保守性，這樣就使核酸的種間雜交成為可能。已知組蛋白在因、肌動(dòng)蛋白基因及-神經(jīng)生長因子（-nerve hrowth factor，NGF）等基因的核苷酸序列，都是有效的同源DNA探針，并已成功地用于分離相關(guān)的基因。在同一蛋白質(zhì)家族內(nèi)，也存在著具有共同氨基酸序列的區(qū)段，即所謂的保守區(qū)保守區(qū)。這些保守區(qū)往往是由彼此相鄰的6-7個(gè)氨基酸組成，這樣的長度顯然適合于推導(dǎo)合成寡核苷酸探針庫，用來分離編

4、碼相關(guān)蛋白質(zhì)的cDNA。序列克隆法根據(jù)已知基因序列或同源基因序列分離目的基因表達(dá)序列標(biāo)簽法分離目的基因ESTs基因表達(dá)序列分析法返 回酵母雜交技術(shù)原理及應(yīng)用利用差示分析法分離目的基因克隆mRNA差別顯示技術(shù)mRNA差別顯示技術(shù)抑制性減法雜交技術(shù)返 回酵母雙雜交酵母雜交技術(shù)原理及應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)的建立 酵母雙雜交系統(tǒng)的建立得力于對真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認(rèn)識。 細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。 80年代的工作表明， 轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)上是組件式組件式的， 即這些因子往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成， 其中有DNA結(jié)結(jié)合結(jié)構(gòu)域合結(jié)構(gòu)域(DNA bindin

5、g domain， 簡稱為簡稱為BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain， 簡稱為簡稱為AD)， BD可識別DNA上的特異序列，并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)節(jié)的基因的上游 ；AD可同轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的其他成分作用，啟動(dòng)它所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。單獨(dú)的BD雖然能和啟動(dòng)子結(jié)合， 但是不能激活轉(zhuǎn)錄。 不同轉(zhuǎn)錄激活因子的BD和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉(zhuǎn)錄的功能 （如酵母細(xì)胞的Gal4蛋白的BD與大腸桿菌的一個(gè)酸性激活結(jié)構(gòu)域B42融合得到的雜合蛋白仍然可結(jié)合到Gal4結(jié)合位點(diǎn)并激活轉(zhuǎn)錄）酵母雜交技術(shù)原理及應(yīng)用如果誘餌蛋白誘餌蛋白和靶蛋白靶蛋白能夠相互作用，那么GAL4

6、DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和GAL4激活結(jié)構(gòu)域就會相互作用，從而激活lacZ報(bào)道基因的表達(dá)。所以我們可以通過轉(zhuǎn)化的酵母的表型來確定誘餌蛋白和靶蛋白是否有相互作用。 酵母雜交技術(shù)原理及應(yīng)用1）將編碼DNA-BD的基因與已知蛋白質(zhì)已知蛋白質(zhì)Bait protein （誘餌蛋白）的基因構(gòu)建在同一個(gè)表達(dá)載體上，在酵母中表達(dá)兩者的融合蛋白BD-Bait protein。2）將編碼AD的基因和cDNA文庫的基因構(gòu)建在AD-LIBRARY表達(dá)載體上。同時(shí)將上述兩種載體轉(zhuǎn)化改造后的酵母改造后的酵母（這種改造后的酵母細(xì)胞的基因組中既不能產(chǎn)生既不能產(chǎn)生GAL4，又不能合成，又不能合成ADE、 HIS 、LEU、TRP，因

7、此，酵母在缺乏這些營養(yǎng)的培養(yǎng)基缺乏這些營養(yǎng)的培養(yǎng)基上無法正常生長。）3）當(dāng)上述兩種載體所表達(dá)的融合蛋白能夠相互作用時(shí)，功能重建的反式作用因子能夠激活酵母基因組中的報(bào)告基因酵母基因組中的報(bào)告基因ADE、 HIS、LACZ、MEL1，從而通過功能互補(bǔ)和顯色反應(yīng)篩選到陽性菌落。將陽性反應(yīng)的酵母菌株中的AD-LIBRARY載體提取分離出來，從而對載體中插入的文庫基因進(jìn)行測序和分析工作。 酵母雜交技術(shù)原理及應(yīng)用酵母雜交技術(shù)原理及應(yīng)用酵母雜交技術(shù)原理及應(yīng)用主要有二類載體: a 含DNA -binding domain的載體； b 含DNA-activating domain的載體。這二類載體在構(gòu)建融合基因

8、時(shí)， 測試蛋白基因與結(jié)構(gòu)域基因必須在閱讀框內(nèi)融合。融合基因在報(bào)告株中表達(dá)， 其表達(dá)產(chǎn)物只有定位于核內(nèi)定位于核內(nèi)才能驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)， 而GAL4-ad沒有。因此， 在GAL4-ad氨基端或羧基端應(yīng)克隆來自SV40的T-抗原的一段序列作為核定位的序列。 目前研究中常用binding-domain基因有： GAL4(1-147)； LexA (E coli轉(zhuǎn)錄抑制因子)的DNA-bd編碼序列。常用的activating-domain基因有： GAL4(768-881)和皰疹病毒VP16的編碼序列等。酵

9、母雙雜交系統(tǒng)的建立 酵母雜交技術(shù)原理及應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)的另一個(gè)重要的元件是報(bào)道株報(bào)道株。報(bào)道株指經(jīng)改造的、含報(bào)道基因含報(bào)道基因(reporter gene)的重組質(zhì)粒的重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。 最常用的是酵母細(xì)胞酵母細(xì)胞， 酵母細(xì)胞作為報(bào)道株具有許多優(yōu)點(diǎn): 1 易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴(kuò)增質(zhì)粒。2具有可直接進(jìn)行選擇的標(biāo)記基因和特征性報(bào)道基因。3酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來源于哺乳動(dòng)物的蛋白結(jié)合。 一般編碼一個(gè)蛋白的基因融合到明確的明確的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(如 GAL4-bd， LexA-bd)； 另一個(gè)基因融合到轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(如GAL4-ad， VP16)。激活結(jié)構(gòu)域融合基因轉(zhuǎn)入表達(dá)結(jié)合結(jié)構(gòu)

10、域融合基因的酵母細(xì)胞系中， 蛋白間的作用使得轉(zhuǎn)錄因子重建導(dǎo)致相鄰的報(bào)道基因表達(dá)(如lacZ)， 從而可分析蛋白間的結(jié)合作用。酵母雙雜交系統(tǒng)的建立 酵母雜交技術(shù)原理及應(yīng)用 酵母雙雜交系統(tǒng)通過兩個(gè)雜交蛋白在酵母細(xì)胞中的相互結(jié)合及對報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄激活來捕獲新的蛋白質(zhì)，其大致步驟為:1、視已知蛋白的cDNA序列為誘餌(bait)，將其與DNA結(jié)合域融合，構(gòu)建成誘餌質(zhì)粒誘餌質(zhì)粒。2、將待篩選蛋白的cDNA序列與轉(zhuǎn)錄激活域融合，構(gòu)建成文庫質(zhì)粒文庫質(zhì)粒。3、將這兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化于酵母細(xì)胞中。4、酵母細(xì)胞中，已分離的DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域不會相互作用，但誘餌蛋白若能與待篩選的未知蛋白特異性地相互作用，則可激活

11、報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄；反之，則不能。利用4種報(bào)告基因的表達(dá)，便可捕捉到新的蛋白質(zhì)。酵母雙雜交系統(tǒng)的建立 酵母雜交技術(shù)原理及應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)的建立 酵母雙雜交系統(tǒng)能在體內(nèi)測定蛋白質(zhì)的結(jié)合作用， 具有高度敏感性。主要是由于：采用高拷貝和強(qiáng)啟動(dòng)子的表達(dá)載體使雜合蛋白過量表達(dá)雜合蛋白過量表達(dá)。信號測定是在自然平衡濃度條件下進(jìn)行， 而如免疫共沉淀等物理方法為達(dá)到此條件需進(jìn)行多次洗滌，降低了信號強(qiáng)度。雜交蛋白間穩(wěn)定度雜交蛋白間穩(wěn)定度可被激活結(jié)構(gòu)域激活結(jié)構(gòu)域和結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物而增強(qiáng)， 后者又與啟動(dòng)子DNA結(jié)合， 此三元復(fù)合體使其中各組分的結(jié)合趨于穩(wěn)定。通過mRNA產(chǎn)生多種穩(wěn)定的酶使信號

12、放大。 同時(shí)， 酵母表型， X-Gal及HIS3蛋白表達(dá)等檢測方法均很敏感。 酵母雜交技術(shù)原理及應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn) 酵母雙雜交系統(tǒng)檢測蛋白之間的相互作用具有以下優(yōu)點(diǎn): 作用信號是在融合基因表達(dá)后， 在細(xì)胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因子的作用而給出的， 省去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。 檢測在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行， 可以在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況。 檢測的結(jié)果可以是基因表達(dá)產(chǎn)物的積累效應(yīng)， 因而可檢測存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時(shí)的相互作用。 酵母雙雜交系統(tǒng)可采用不同組織、器官、細(xì)胞類型和分化時(shí)期材料構(gòu)建cDNA文庫， 能分析細(xì)胞漿、細(xì)胞核及膜結(jié)合蛋白等多種不同亞細(xì)胞部位及功能的蛋白。例如已報(bào)道成功分析了

13、RAP1與RIF1ii、P21cip1與CDK2iii、p16與CDK4iv等之間的相互作用。酵母雜交技術(shù)原理及應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用 2、利用酵母雙雜交在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用 利用酶聯(lián)免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技術(shù)都是利用抗原和抗體間的免疫反應(yīng)，可以研究抗原和抗體之間的相互作用，但是，它們都是基于體外非細(xì)胞的環(huán)境中研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用。 而在細(xì)胞體內(nèi)的抗原和抗體的聚積反應(yīng)則可以通過酵母雙雜交進(jìn)行檢測。1、利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能當(dāng)我們將已知基因作為誘餌，在選定的cDNA文庫中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽性酵母菌株中可以

14、分離得到AD-LIBRARY載體，并從載體中進(jìn)一步克隆得到隨機(jī)插入的cDNA片段，并對該片段的編碼序列在GENEBANK中進(jìn)行比較，研究與已知基因在生物學(xué)功能上的聯(lián)系與已知基因在生物學(xué)功能上的聯(lián)系。 另外，也可作為研究已知基因的新功能或多個(gè)篩選到的已知基因之間功能相關(guān)的主要方法。酵母雜交技術(shù)原理及應(yīng)用3、利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點(diǎn)以及藥物對蛋白質(zhì)之間相互作用的影響 酵母雙雜交的報(bào)告基因能否表達(dá)在于誘餌蛋白與靶蛋白之間的相互作用。對于能夠引發(fā)疾病反應(yīng)的蛋白互作可以采取藥物干擾的方法，阻止它們的相互作用以達(dá)到治療疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黃熱病、肝炎等疾病，研究發(fā)現(xiàn)它的病毒RN

15、A復(fù)制與依賴于RNA的RNA聚合酶（NS5）與拓?fù)洚悩?gòu)酶NS3，以及細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)受體BETA-importin的相互作用有關(guān)。研究人員通過酵母雙雜交技術(shù)找到了這些蛋白之間相互作用的氨基酸序列。如果能找到相應(yīng)的基因藥物阻斷這些蛋白之間的相互作用，就可以阻止RNA病毒的復(fù)制，從而達(dá)到治療這種疾病的目的。酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用 酵母雜交技術(shù)原理及應(yīng)用4、利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖 眾多的蛋白質(zhì)之間在許多重要的生命活動(dòng)中都是彼此協(xié)調(diào)和控制的。基因組中的編碼蛋白質(zhì)的基因之間存在著功能上的聯(lián)系。通過基因組的測序和序列分析發(fā)現(xiàn)了很多新的基因和EST序列，HUA等人利用酵母雙雜交技術(shù)，將所有已知基因和ES

16、T序列為誘餌，在表達(dá)文庫中篩選與誘餌相互作用的蛋白，從而找到基因之間的聯(lián)系，建立基因組蛋白連鎖圖。對于認(rèn)識一些重要的生命活動(dòng)：如信號傳導(dǎo)、代謝途徑等有重要意義 酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用 酵母雜交技術(shù)原理及應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)局限性和存在的問題酵母雙雜交系統(tǒng)是分析蛋白-蛋白間相互作用的有效和快速的方法， 有多方面的應(yīng)用， 但仍存在一些局限性。 雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細(xì)胞核內(nèi)， 而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等， 這些反應(yīng)在核內(nèi)無法進(jìn)行。 另外有些蛋白的正確折疊和功能有賴于其他非酵母蛋白的輔助， 這限制了某些細(xì)胞外蛋白和細(xì)胞膜受體蛋白等的研究。 酵母雙雜交系統(tǒng)的

17、一個(gè)重要的問題是假陽性。由于某些蛋白本身具有激活轉(zhuǎn)錄功能或在酵母中表達(dá)時(shí)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用， 使DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域雜交蛋白在無特異激活結(jié)構(gòu)域的情況下可激活轉(zhuǎn)錄。另外某些蛋白表面含有對多種蛋白質(zhì)的低親和力區(qū)域， 能與其他蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合物， 從而引起報(bào)告基因的表達(dá)， 產(chǎn)生假陽性結(jié)果。 酵母雜交技術(shù)原理及應(yīng)用酵母單雜交技術(shù)最早是從酵母雙雜交技術(shù)發(fā)展而來，酵母雙雜交技術(shù)通過對報(bào)告基因的表型進(jìn)行檢測以實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)間相互作用的研究，而酵母單雜交技術(shù)則通過對報(bào)告基因的表型檢測，分析DNA、蛋白之間的相互作用、蛋白之間的相互作用，以研究真核細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)調(diào)控。 酵母單雜交酵母單雜交在酵母雙雜交的基礎(chǔ)上，又發(fā)

18、展出了 酵母單雜交、酵母單雜交、酵母三雜交酵母三雜交和酵酵母的反向雜交母的反向雜交技術(shù)。它們被分別用于核酸和文庫蛋白之間核酸和文庫蛋白之間的研究、三種三種不同蛋白之間不同蛋白之間的互作研究和兩種蛋白相互作用兩種蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)和位點(diǎn)。酵母雜交技術(shù)原理及應(yīng)用 用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白即是一種典型的轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子。研究表明GAL4 的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合結(jié)構(gòu)域靠近羧基端，含有幾個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(diǎn)(UAS)；而轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可與RNA 聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子TFIID相互作用，提高RNA 聚合酶的活性。在這一過程中，DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)

19、域可完全獨(dú)立地發(fā)揮作用。據(jù)此，我們可將GAL4 的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域置換置換為其他蛋白，只要他能與與我們想要了解的我們想要了解的目的基因目的基因相互作用，相互作用，就照樣可以通過其轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域激活RNA聚合酶，從而啟動(dòng)對下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。酵母單雜交系統(tǒng)的原理酵母雜交技術(shù)原理及應(yīng)用正是基于這一理論，酵母單雜交系統(tǒng)由2 部分組成：(1) 將與GAL4 轉(zhuǎn)錄激活域轉(zhuǎn)錄激活域 融合表達(dá)的cDNA 文庫質(zhì)粒文庫質(zhì)粒；含有目的基因目的基因和下游報(bào)告基因的報(bào)告質(zhì)粒報(bào)告質(zhì)粒. 首先將報(bào)告質(zhì)粒報(bào)告質(zhì)粒整合入酵母基因組,產(chǎn)生帶有目的基因的酵母報(bào)告株; 再將文庫質(zhì)粒文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入報(bào)告株; 若存在文庫蛋白與目的基因

20、的相互作用,可通過對報(bào)告基因的表達(dá)將文庫蛋白的基因篩選出來.酵母雜交技術(shù)原理及應(yīng)用酵母三雜交系統(tǒng)的原理與酵母雙雜交相似，利用了酵母細(xì)胞的GAL4蛋白調(diào)節(jié)目的基因(半乳糖苷酶基因及His3基因)轉(zhuǎn)錄的特點(diǎn)。GAL4蛋白具有兩個(gè)可分離的功能區(qū)，N端是DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，C端為轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。只要這兩個(gè)相對獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域能夠通過一定的方式在空間上足夠的靠近(如借助其他分子的相互結(jié)合使其足夠靠近)，即使它們之間沒有共價(jià)結(jié)合也可激活轉(zhuǎn)錄，這為研究蛋白質(zhì)與其他分子的相互作用提供了可能。酵母三雜交的原理酵母雜交技術(shù)原理及應(yīng)用酵母雜交技術(shù)原理及應(yīng)用上圖顯示了酵母三雜交系統(tǒng)的原理。在酵母三雜交系統(tǒng)，lexA啟動(dòng)子調(diào)

21、控下游LacZ基因和His3基因的表達(dá)，而lexA啟動(dòng)子的激活取決于DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域能否在空間上相互靠近。其中第一個(gè)融合蛋白第一個(gè)融合蛋白由兩部分組成，一部分為能結(jié)合lexA啟動(dòng)子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，另一部分為噬菌體衣殼蛋白MS2。第二個(gè)融合蛋白第二個(gè)融合蛋白也由兩部分組成，一部分為能激活lexA啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，另一部分為有待研究的有待研究的RNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白“Y”。這兩個(gè)融合蛋白通過第三個(gè)融合第三個(gè)融合的RNA分子相連，其一端為含有噬菌體衣殼蛋白MS2結(jié)合位點(diǎn)的MS2RNA，另一端為有待研究的有待研究的RNA“X”。一旦“X”和“Y”能有相互作用就使得這個(gè)復(fù)合物形

22、成一個(gè)功能性的轉(zhuǎn)錄激活因子，從而使得下游的LacZ基因和His3基因得以表達(dá)。LacZ基因的表達(dá)水平能夠通過在體外檢測半乳糖苷酶的活性來確定,His3基因的表達(dá)賦予了酵母細(xì)胞在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上生存的能力。通過缺陷培養(yǎng)基及半乳糖苷酶的活性的測定就能判斷在酵母菌內(nèi)是否發(fā)生了RNA“X”和蛋白質(zhì)“Y”的相互作用。酵母雜交技術(shù)原理及應(yīng)用 噬菌體展示技術(shù)能將表達(dá)的外源多肽或蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌體的表面，進(jìn)而通過親和富集法親和富集法篩選表達(dá)有特異肽或蛋白質(zhì)的噬菌體，為篩選到目的蛋白或多肽奠定了基礎(chǔ)。噬菌體展示技術(shù)酵母雜交技術(shù)原理及應(yīng)用原理原理 噬菌體展示技術(shù)是將外源DNA 通過基因工程技術(shù)克

23、隆到適當(dāng)?shù)氖删w載體上，使外源DNA 片段對應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物融合在噬菌體的衣殼蛋白上形成融合蛋白，呈現(xiàn)在噬菌體表面，被展示的多肽或蛋白可保持相對的空間結(jié)構(gòu)和生物活性。然后利用靶分子，采用適當(dāng)?shù)奶韵捶椒ㄏ慈シ翘禺惤Y(jié)合的噬菌體，最終從噬菌體文庫中篩選出能結(jié)合靶分子的目的噬菌體；外源多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)在噬菌體的表面,而其編碼基因作為噬菌體基因組中的一部分可通過噬菌體DNA 序列測序出來。 該技術(shù)的顯著特點(diǎn)是建立了基因型和表現(xiàn)型之間的對應(yīng)關(guān)系。酵母雜交技術(shù)原理及應(yīng)用類型 1 絲狀噬菌體展示系統(tǒng) 絲狀噬菌體屬于單鏈環(huán)狀DNA 病毒，編碼10種蛋白質(zhì)，其中與噬菌體展示有關(guān)的是p 和p 衣殼蛋白。p 蛋白蛋白位于

24、噬菌體顆粒的一端，有3 個(gè)5 個(gè)拷貝，可在N 端、近N 端或N 端與C 端的柔性連接區(qū)融合外源肽或蛋白質(zhì)。p 蛋白對展示的外源多肽或蛋白質(zhì)的大小無嚴(yán)格限制，但由于p 蛋白的拷貝數(shù)只有3 個(gè)5 個(gè)，在免疫學(xué)和生物疫苗研制中受到了限制。p 蛋白位于噬菌體顆粒的兩側(cè)，一般在N 端或近N 端融合外源序列。由于p 分子較小，只能融合較小的外源肽段，攜帶肽段太大會影響外殼的組裝，使其失去感染力。但它的拷貝數(shù)多，因此該系統(tǒng)一般用于篩選親和力較低的配體，高拷貝p 蛋白在疫苗開發(fā)上具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。酵母雜交技術(shù)原理及應(yīng)用2 噬菌體展示系統(tǒng) 噬菌體是最早使用的克隆載體，其兩端為不閉合的線形雙鏈DNA，末端為長1

25、2 個(gè)核苷酸的互補(bǔ)單鏈。 噬菌體展示系統(tǒng)是將外源序列插入噬菌體頭部組裝必需的D 蛋白的蛋白的N 端或端或C 端，端，或主要尾部蛋白主要尾部蛋白PV 的羧基端折疊區(qū)的羧基端折疊區(qū)(非功能區(qū)) ，實(shí)現(xiàn)外源蛋白的表面展示。噬菌體是在宿主細(xì)胞內(nèi)完成裝配的，無需將外源肽或蛋白分泌到細(xì)菌胞膜外，可展示有活性的大分子蛋白(100 ku 以上蛋白) 及對宿主細(xì)胞有毒性的蛋白，適用范圍極廣。酵母雜交技術(shù)原理及應(yīng)用3 T4 噬菌體展示系統(tǒng)T4 噬菌體展示系統(tǒng)是將外源肽/ 蛋白質(zhì)與T4噬菌體的小外衣殼蛋白C 端融合而被展示，展示方法是利用一個(gè)選擇性載體(或稱之為整合載體)，將融合有外源序列的小外衣殼蛋白( small outer capsidprotein ,SOC) 融合基因同源整合入缺失SOC 的T4 基因組中，選擇恢復(fù)溶菌酶生長不依賴性的噬菌體，即可將外源肽/ 蛋白質(zhì)展示于噬菌體表面。SOC具有與噬菌體顆粒表面專一結(jié)合的能力，因此還可用體外組裝的方法實(shí)現(xiàn)展示。方法是將SOC 及其融合