超氧化物歧化酶修飾改造的研究進展

1、超氧化物歧化酶修飾改造的研究進展    作者：史春艷,左夏林,丁宇,李謹,丁克祥作者單位：長春市中心醫(yī)院，吉林 長春 130051 南方醫(yī)科大學研究生學院 華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院 漢川市人民醫(yī)院皮膚科 南方醫(yī)科大學科研部                           &#

2、160;                         【關鍵詞】  超氧化物歧化酶；修飾；基因重組；模擬物     超氧化物歧化酶（SOD）廣泛存在于自然界一切生物體內，通過催化超氧陰離子自由基(O-2)發(fā)生歧化反應，減輕或消除O-2對機體的氧化或過氧化損害。研究表明，機體的衰老、病變及輻射傷害都與自由基（包括O-

3、2）的形成和損傷有關，故SOD有抗衰老1、抗輻射、抗炎癥、抗自身免疫性疾病、抑制腫瘤和癌癥2，3的功能。研究還表明，SOD與胃病2、帕金森綜合癥、老年癡呆癥、心血管疾病等有著密切關系。目前，在醫(yī)藥、食品、保健品、化妝品、美容等行業(yè)也已開始使用SOD。SOD具有許多獨特的生物學特性和生理學功能，但天然的SOD穩(wěn)定性較差，分子量較大，且多來源于異源性，具免疫原性，而限制了其在相關領域的應用4。目前國內外已有很多的研究，如采用化學修飾、基因重組、SOD模擬化合物來解決天然SOD所帶來的問題，這已成為當今SOD研究中的一個熱點。本文對目前國內外此方面的研究進行綜述。    

4、; 1  化學修飾     大部分酶分子中可供修飾的功能基團主要是氨基、巰基、胍基、咪唑基、酚基、羥基和吲哚基等，SOD的修飾目前主要限于Cu，ZnSOD的氨基和胍基。國內外已進行了大量的SOD的化學修飾的研究工作，并已取得了理想的結果。所用的修飾劑包括聚乙二醇(PEG)、右旋糖酐、玻璃酸、環(huán)糊精、低抗凝活性肝素、多糖類物質等。有些已投入生產(chǎn)，但這些修飾的SOD還沒有作為藥物應用。在美國，已經(jīng)進行了PEGSOD用于治療腦外傷的期臨床試驗。因此，從開發(fā)新藥的角度，研究修飾SOD大有可為，如口服超氧化物歧化酶Glisodin是經(jīng)過修飾后能不被胃液破壞的SOD

5、。     1.1  聚乙二醇SOD  有學者為了解決SOD半衰期短，易受蛋白酶水解而失活，分子量偏大，不易透過細胞膜等問題，嘗試對SOD進行分子修飾，國內外用水溶性高分子物質聚乙二醇(PEG)作為修飾材料，與SOD分子表面賴氨酸殘基上的NH2縮合，形成無毒，無免疫原性，半衰期長的修飾物，其活化簡單但回收率低。動物實驗結果顯示，PEG修飾的SOD較其他修飾的SOD對小鼠肌肉缺血再灌注損傷具有更好的保護作用。Noda5將Cu，ZnSOD與琥珀酸角蛋白片段連接，小鼠靜脈注射后，半衰期由4.7 min延長到20.5 min，并且能夠迅速被肝臟吸收，失

6、活速度也低于未修飾對照。孫桂玲6等用相對分子質量為2×1032×104的PEG并修飾SOD，發(fā)現(xiàn)分子質量為6×103的PEG修飾效果最佳，其耐熱、耐酸、耐堿和抗酶解能力均有顯著的提高（在70下3 h后活性存留率比天然SOD提高37.2%，在pH4.4和pH11的緩沖液中3 h后活性存留率分別比天然SOD提高33.8%和25.9%，在人工胃液和人工腸液中3 h活性殘余率分別比天然SOD提高32.1%和17.4%）?？讘c勝等7研究證明，PEG修飾的SOD的血漿半衰期為30 h，遠遠大于天然SOD 8 min左右的半衰期,且PEGSOD免疫原性消失，不能引起免疫反應。

7、    1.2  右旋糖酐修飾SOD  右旋糖酐對SOD進行化學修飾已獲得成功，它是利用右旋糖酐分子結構中的羥基經(jīng)過BrCN或NaIO4活化，形成有活性的衍生物，再與SOD共價結合。SOD經(jīng)化學修飾后不僅保留了天然酶活性，而且在耐熱、耐酸堿及抗蛋白酶水解能力等方面明顯優(yōu)于天然酶，特別是酶經(jīng)修飾后大大延長了在體內停留時間，如天然牛血SOD的1/2為6 min，而右旋糖酐SOD、低分子聚蔗糖(Ficoll)SOD、高分子聚蔗糖SOD、聚乙二醇SOD的1/2分別為7、14、24、35 h。     1.3  月

8、桂酰氯修飾SOD  國內均坤生物工程有限公司以低分子月桂酰氯為修飾劑，對SOD進行共價修飾，獲得了半衰期長、比活高、穩(wěn)定性強、無毒性、低分子量的月桂酰氯修飾SOD（LauricacidSOD，LASOD），并進行了透皮吸收、穩(wěn)定性等試驗和化妝品應用效果的觀察，結果表明LASOD的熱穩(wěn)定性顯著高于未修飾SOD，SOD的修飾是通過將SOD與月桂酰氯分子中存在的多個活性反應基團形成多點交聯(lián)，使酶的天然構象產(chǎn)生“剛性”，不易伸展打開，同時減小酶分子內部基團的熱震動，從而增強了酶的穩(wěn)定性。SOD經(jīng)月桂酰氯修飾后擴大了pH穩(wěn)定范圍，這是由于修飾酶被“固定”于更活潑狀態(tài)，當基質pH下降、上升時酶仍

9、能保持這種活性狀態(tài)，使催化劑功能不受影響。另外，將同一濃度的LASOD和天然SOD分別加入10%胃蛋白酶溶液，導致蛋白多肽鍵斷裂，交聯(lián)于SOD上的月桂酰氯能產(chǎn)生空間障礙，阻擋蛋白水解酶接近SOD，能“遮蓋”SOD分子敏感鍵遭破壞，說明其具有抗蛋白酶水解能力。     1.4  多糖物質修飾SOD  此類修飾劑主要為低抗凝活性肝素(LAAH)、羧甲基纖維(CMC)，羧甲基幾丁質、硫酸軟骨素(CHS)和甘露聚糖。LAAH和SOD一樣,都是體內氧自由基的天然清除劑，用LAAH對SOD進行修飾，在SOD抗輻射和抗炎的應用中能發(fā)揮協(xié)同作用，且可以加強SO

10、D的抗心血管疾病的能力8。Valdivia 等9將羧甲基纖維素氧化后與活化的環(huán)糊精（CD）連接，所得CDCMC聚合物使SOD糖苷化，獲得的SODCDCMC血漿內半衰期達到天然酶的90倍，抗炎活性達到天然酶的2.2倍。CHS廣泛存在于人和動物軟骨組織中,具有防治冠心病，防治動脈粥樣硬化、抗炎、抗腫瘤、加速傷口愈合的作用。Maksimenko等10將SOD 和過氧化氫酶（CAT）用硫酸軟骨素一起共價修飾,生成SODCHSCAT修飾結合物，其具有良好的抗血栓協(xié)同作用，其中SODCHS能消除血栓，而CATCHS則保持血流暢通，延緩血管閉塞。同時CAT的存在能消除對SOD具有毒性的H2O2產(chǎn)生的協(xié)同效用

11、使SODCHSCAT的效功效加大。     2  重組SOD     為解決天然SOD免疫源性的問題，美、日、英、德等國相繼開發(fā)了人源SOD基因工程產(chǎn)品，已進入到期、期臨床研究，但其療效不一。根據(jù)Jadot等同源SOD不被細胞膜受體辨認而無活性的觀點，應對重組人源SOD的研究開發(fā)持謹慎態(tài)度，注意其應用領域。中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所和中國藥品生物制品檢定所及海軍總醫(yī)院分子生物學研究室已經(jīng)成功在大腸桿菌中表達了人Cu，ZnSOD，表達率高達50%。有學者分別以人胎肝組織及人肝細胞株(L02)總RNA為模板，以RTPCR法獲得

12、hCuZnSOD和hMnSOD cDNA，構建表達質粒pETSOD，并導入E.coli細胞中使之表達，結果分別獲得了38%和50%的高表達率，且表達的SOD有酶活性。目前，國外應用基因重組人源SOD(rhSOD)對類風濕關節(jié)炎及免疫系統(tǒng)疾病的治療做了大量研究，并取得顯著效果，已進入期、期臨床階段。國際生物學界采用的基因重組法制取人源SOD（rhSOD）是SOD制備的最前沿技術，具有高安全、高活性、高質量等優(yōu)勢。重組SOD雖然在一定程度上解決了免疫反應的等問題，但仍有其他問題，目前重組SOD存在的問題：(1)半衰期很短；(2)重組SOD要恢復有活性的天然構象比較困難，因此其活性比天然SOD低；（

13、3）臨床使用劑量偏大。所以在重組人源SOD的開發(fā)中，需要更深入的研究，尋找更先進的方法來解決重組人源SOD所帶來的問題。     3  SOD 的模擬化合物     與天然SOD相比，SOD的模擬物有著更顯著的優(yōu)點11，12。SOD的模擬化合物的獲取和制備比天然SOD簡單，且天然SOD產(chǎn)量不高。模擬SOD可以用化學方法來人工合成，其物質和能量消耗低，且產(chǎn)量不會受到限制。另外，天然SOD作為一種生物大分子,穿透力弱、細胞滲透性差、在血中半衰期短、免疫原性、不能口服、價格昂貴。目前,研究者合成了一系列含銅、錳、鐵等金屬離子的小分

14、子配合物來模擬SOD，期待將來能用小分子模擬化合物代替SOD應用于臨床13，14。其中研究最多的含銅絡合物是3,5二異丙基水楊酸銅,這是一種低分子量的親脂性絡合物,具有天然CuZn SOD樣活性,可以起到抗炎及減輕由鏈脲菌素誘導產(chǎn)生的糖尿病。劉京萍等15合成的鐵()酪氨酸模擬SOD 金屬酶, 分子量比天然酶小得多,與天然SOD 活性差距較小，且毒性小，從而大大推進了人工合成具有分子質量較小、穩(wěn)定性高、毒性較底、活性較高等優(yōu)點的SOD模擬物的研究工作及應用。     4  結  語     SOD在臨床上主要用于延緩

15、人體衰老，防止色素沉著，消除局部炎癥，特別是治療風濕性關節(jié)炎、慢性多發(fā)性關節(jié)炎及輻射防護，是很有臨床價值的治療酶。但半衰期短、穩(wěn)定性差、免疫原性等因素限制了SOD的臨床應用。為解決這些問題，目前國內外用化學修飾、基因重組和SOD修飾物等改造方法來延長半衰期、增強酶的穩(wěn)定性、降低酶的免疫原性，且取得了很大的進展。這對于SOD未來的應用前景有著重要的意義。 【參考文獻】   1 Huang JZ, Lemire BD.Mutations in the C. elegans succinate dehydrogenase ironsulfur subunit promote superox

16、ide generation and premature agingJ. J Mol Biol，2009；387:55969.   2 Monari M，Trinchero A，Calabrese C.Superoxide dismutase in gastric adenocarcinoma: is it a clinical biomarker in the development of cancerJ? Biomarkers，2006；11(6):57484.   3 Weydert CJ，Waugh TA，Ritchie JM.Overexpression of m

17、anganese or copperzinc superoxide dismutase inhibits breast cancer growthJ.Free Radic Biol Med，2006；41(2):22637.   4 丁克祥,曾爾亢.抗衰老酶SOD應用的局限性及對策J.國外醫(yī)學社會學分冊，1994；11(3):1057.   5 Noda J，Otagifi M，Akaike T，et al.Pharmacological advantages of conjugation of Cu，Znsuperoxide dismutase with succinyl

18、ated keratin fragment：improvement of biological properties and resistance to oxidative damageJ.J Pharmacol Exp Ther，1996；279(1)：16271.   6 孫桂玲，季 波，趙樹進,等.聚乙二醇修飾超氧化物歧化酶衍生物的制備及其放射性碘標記J.中國藥房，2006；17(12):9112.   7 孔慶勝，迮玉官.聚乙二醇修飾超氧化物歧化酶的基礎研究J.濟寧醫(yī)學院學報，2006；29(1):167.   8 Tasaki Hreleased ext

19、racellular superoxide dismutase is reduced in patients with coronary artery atherosclerosis J. Atherosclerosis (Amsterdam, Netherlands)，2006；187(1)：1318.   9 Valdivia A，Perez Y，Ramirez H，et al. Improved pharmacological properties for superoxide dismutase modified with cyclodextrin carboxymethyl

20、cellulose polymerJ.Biotechnology Letters，2006；28(18):146570.   10 Maksimenko AV.Experimental antioxidant biotherapy for protection of the vascular wall by modified forms of super oxide dismutase and catalaseJ.Current Pharmaceutical Design，2005；11(16):200716.   11 Pong K.Oxidative stress in

21、 neurodegenerative diseases: therapeutic implications for superoxide dismutase mimeticsJ.Expert Opin Biol Ther，2003；3(1):12739.   12 Peng J，Stevenson FF，Doctrow SR，et al.Superoxide dismutase/catalase mimetics are neuroprotective against selective paraquatmediated dopaminergic neuron death in the