出口食品_副溶血性弧菌_檢驗(yàn)

1、MM_FS_CNJ_0337出口食品 副溶血性弧菌 檢驗(yàn)MM_FS_CNJ_0337出口食品副溶血性弧菌檢驗(yàn)方法1.適用范圍本方法適用于海產(chǎn)食品中副溶血性弧菌檢驗(yàn)，其他食品可參照使用。2.主要試劑和儀器30gL氯化鈉稀釋液：見6.1；60gL氯化鈉蛋白胨水（PW）：見6.2；氯化鈉多粘菌素B肉湯（SPB）：見6.3；硫代硫酸鈉、檸檬酸鈉、膽鹽、蔗糖瓊脂（TCBS）：見6.4；氯化鈉三糖鐵瓊脂（TSI）：見6.5；嗜鹽性試驗(yàn)用胰胨水（TB）：見6.6；胰胨大豆瓊脂斜面（TSA）：見6.7；靛基質(zhì)試驗(yàn)用培養(yǎng)基（I）：見6.8；氨基酸試驗(yàn)用培養(yǎng)基：見6.9；VP半固體瓊脂（VP）：見6.10；糖類分

2、解試驗(yàn)用培養(yǎng)基：見6.11；42生長試驗(yàn)用培養(yǎng)基：見6.12；OF試驗(yàn)用培養(yǎng)基（HLGB）：見6.13；神奈川現(xiàn)象試驗(yàn)用我妻氏瓊脂（WA）：見6.14。2.2.儀器試管：17mm×170mm、15mm×150mm、10mm×100mm；吸管：1mL、10mL；培養(yǎng)皿：直徑90mm；廣口瓶或三角瓶；電動(dòng)均質(zhì)器；電動(dòng)試管振蕩器；37恒溫箱；42恒溫水浴箱；試管架。3.過程簡述3.1.樣品制備.冷凍樣品應(yīng)在45以下不超過15min或在25不超過18h解凍。若不能及時(shí)檢驗(yàn)，應(yīng)放于15左右保存；非冷凍而易腐的樣品應(yīng)盡可能及時(shí)檢驗(yàn)，若不能及時(shí)檢驗(yàn)，應(yīng)置于610冰箱保存，在24

3、h內(nèi)檢驗(yàn)。.取樣：以無菌操作進(jìn)行。.1.魚類：取魚體不同部位。.2.貝類：取內(nèi)臟或含內(nèi)臟的全部貝肉；如為帶殼貝類，則應(yīng)先在清潔的流水中洗刷凈外殼，然后以無菌操作打開貝殼，取出內(nèi)臟或含內(nèi)臟的全部貝肉和貝液。.3.甲殼類：取包括鰓及腸的部分或整體。.以無菌操作稱取50g檢樣放于均質(zhì)杯中，以滅菌剪刀充分剪碎。.加30gL氯化鈉稀釋水450mL，均質(zhì)（8000rmin）1min，使成110稀釋液（如無均質(zhì)器，則應(yīng)以剪刀盡量剪碎，加450mL稀釋水使成110稀釋液，并充分振蕩）。.用1mL滅菌吸管吸取110稀釋液1mL，注入裝有9mL30gL氯化鈉稀釋水的試管內(nèi)，振搖試管混合均勻，制成1100稀釋液。.

4、每一稀釋度換取1支1mL滅菌吸管，按上項(xiàng)操作順序進(jìn)行10倍遞增稀釋。稀釋倍數(shù)要依據(jù)有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)、規(guī)定、要求或樣品污染情況而定。3.2.增菌培養(yǎng)和分離.對新鮮樣品，可選擇3個(gè)連續(xù)適宜的稀釋度，分別以1mL無菌吸管各吸取1mL稀釋液，接種10mL單料氯化鈉多粘菌素B肉湯中，進(jìn)行選擇性增菌培養(yǎng)，每一稀釋度接種3管（若選擇的稀釋度為接種1g樣品時(shí)，則應(yīng)以10mL滅菌吸管吸取110稀釋液10mL，接種10mL雙料氯化鈉多粘菌素B肉湯中）。對經(jīng)加熱、輻射處理或冷藏、凍結(jié)的樣品，可按以上操作先將樣品接種于60gL氯化鈉蛋白胨水于37前增菌1824h，然后將培養(yǎng)物以接種環(huán)轉(zhuǎn)種到氯化鈉多粘菌素B肉湯中進(jìn)行選擇性增菌

5、。.37培養(yǎng)1824h。.氯化鈉多粘菌素B肉湯管如有菌生長，則以3mm直徑接種環(huán)分別取一環(huán)菌液，劃線于硫代硫酸鈉、檸檬酸鈉、膽鹽、蔗糖瓊脂（TCBS）平板上。.37培養(yǎng)1824h。.副溶血性弧菌在蔗糖瓊脂（TCBS）平板上的典型菌落呈圓形，邊緣整齊、濕潤、稍混濁、半透明，多數(shù)具尖心、斗笠狀，藍(lán)綠色菌落，直么24mm。3.3.生化鑒定.在蔗糖瓊脂（TCBS）平板上如出現(xiàn)典型或可疑菌落，每個(gè)平板至少挑取兩個(gè)菌落，每個(gè)菌落分別順次接種到下列培養(yǎng)基進(jìn)行鑒別試驗(yàn)。.1.無鹽胰胨水。.2.30gL氯化鈉胰胨水。.3.氯化鈉三糖鐵瓊脂：先穿刺后劃線。.37培養(yǎng)1824h。.選取在氯化鈉三糖鐵斜面上產(chǎn)堿，在底

6、層產(chǎn)酸，不產(chǎn)氣，不產(chǎn)硫化氫；在無鹽胰胨水中幾乎不生長；在30gL氯化鈉胰胨水中生長旺盛的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢，副溶血性弧菌為革蘭氏陰性，呈棒狀、弧狀、卵圓狀等多形態(tài)，兩端濃染、無芽胞。如符合，繼續(xù)進(jìn)行以下生化鑒定。.1.嗜鹽性試驗(yàn)：各取一環(huán)30gL氯化鈉胰胨水培養(yǎng)物，分別接種到70gL及100gL氯化鈉胰胨水中，37培養(yǎng)1824h。.2.細(xì)胞色素氧化酶試驗(yàn)：取一環(huán)30gL氯化鈉胰胨水培養(yǎng)物劃線到胰胨大豆瓊脂斜面上，37培養(yǎng)1824h。.3.靛基質(zhì)試驗(yàn)：在的30gL氯化鈉胰胨水培養(yǎng)物中加靛基質(zhì)試劑后觀察反應(yīng)。.4.賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)：由氯化鈉三糖鐵斜面以接種針取少許培養(yǎng)物接種到賴氨酸試驗(yàn)用培養(yǎng)

7、基中，37培養(yǎng)1824h。.5.精氨酸雙水解酶試驗(yàn)：按上項(xiàng)同樣操作，將培養(yǎng)物接種到精氨酸試驗(yàn)用培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)18°24h。.6.VP試驗(yàn)：以接種針由氯化鈉三糖鐵斜面取少許培養(yǎng)物穿刺VP半固體瓊脂，37培養(yǎng)1824h。在加VP試劑前應(yīng)先觀察動(dòng)力。沿穿刺線周圍呈擴(kuò)散性生長為動(dòng)力陽性。.副溶血性弧菌生化特性的判定及進(jìn)一步試驗(yàn)如下。.1.如所分離的菌株符合表1特性，按第7章報(bào)告結(jié)果。表 1.副溶血性弧菌的生化特性鑒 定 程 序生 化 項(xiàng) 目反 應(yīng)初篩氯化鈉三糖鐵斜面產(chǎn)堿底層產(chǎn)酸，不產(chǎn)氣硫化氫陰性嗜鹽性無鹽胰胨水幾乎不生長30gL氯化鈉胰胨水生長旺盛生化鑒別70gL氯化鈉胰胨水明顯生長10

8、0gL氯化鈉胰胨水幾乎不生長靛基質(zhì)陽性VP陰性動(dòng)力陽性細(xì)胞色素氧化酶陽性賴氨酸脫羧酶陽性精氨酸雙水解酶陰性擴(kuò)大生化鑒別42生長陽性蔗糖不分解OF試驗(yàn)發(fā)酵型.2.如表1生化項(xiàng)目（擴(kuò)大生化試驗(yàn)項(xiàng)目除外）中，僅有一項(xiàng)生化試驗(yàn)不符合時(shí)，按以下步驟做進(jìn)一步鑒定。.2.1.蔗糖分解試驗(yàn)，42生長試驗(yàn)，OF試驗(yàn)。如仍符合副溶血性弧菌特性，可按第7章報(bào)告結(jié)果，如其中有一項(xiàng)不符合，即可排除。.2.2.副溶血性弧菌與有關(guān)細(xì)菌的鑒別可參考表2進(jìn)行。表 2.副溶血性弧菌與有關(guān)細(xì)菌鑒別表試 驗(yàn)副溶血性弧菌溶藻膠弧菌鰻弧菌創(chuàng)傷弧菌河弧菌麥?zhǔn)匣【人畾鈫伟愔举R鄰單胞菌TCBS（藍(lán)綠色菌落）42生長vv鹽耐受性試驗(yàn)（生長

9、）0氯化鈉60gL氯化鈉80gL氯化鈉vv100gL氯化鈉賴氨酸脫羧酶v精氨酸雙水解酶vv鳥氨酸脫羧酶vvv蔗糖發(fā)酵v乳糖發(fā)酵vvv甘露醇發(fā)酵v阿拉伯糖發(fā)酵vVP試驗(yàn)vv注：空白處表示未試驗(yàn)；v表示可變的。4.報(bào)告結(jié)果生化試驗(yàn)符合副溶血性弧菌特性的菌株，按增菌培養(yǎng)陽性管數(shù)，應(yīng)用表3（3管法），查出每100g樣品中的副溶血性弧菌MPN值。檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告為每100g樣品中副溶血性弧菌的最近似值為××個(gè)。表 3.每克樣品的最近似值（3管法MPN）陽 性 管 數(shù)MPN陽 性 管 數(shù)MPN0.10.010.0010.10.010.0010003031130013032160026033

10、1900391003.601031017.20116.1102110129.210315013121107.30206.2111110219.311215022121131902316120110309.4121151222023136123242324413016233531312030023132243013913329302642009.1303952011431043202203117520326312120210153131602112032093212273211502133432221022021323290221283302402223533146022342332110023

11、0293331100注：當(dāng)報(bào)告每100g樣品中副溶血性弧菌的最近似值時(shí)，可將查表所得數(shù)字乘以100。5.神奈川現(xiàn)象及血清學(xué)實(shí)驗(yàn)（根據(jù)需要進(jìn)行）5.1.神奈川現(xiàn)象試驗(yàn)5.1.1.以接種環(huán)將30gL氯化鈉胰胨水培養(yǎng)物點(diǎn)種于充分干燥的我妻氏血瓊脂平板上?？上仍谄桨灞趁嬉圆ＡсU筆劃出若干小區(qū)，使一個(gè)平板能做多個(gè)試驗(yàn)。5.1.2.37培養(yǎng)1824h。5.1.3.在24h以內(nèi)觀察結(jié)果，陽性結(jié)果在菌落周圍有一清晰的透明環(huán)。5.2.血清學(xué)鑒定：副溶血性弧菌的抗原分為O、K、H三種。血清學(xué)分型以O(shè)及K抗原進(jìn)行鑒定。5.2.1.K抗原凝集試驗(yàn)5.2.1.1.將經(jīng)生化試驗(yàn)證實(shí)為副溶血性弧菌的菌株轉(zhuǎn)種在兩支30gL氯

12、化鈉普通瓊脂斜面上，37培養(yǎng)18h。5.2.1.2.以2mL20gL氯化鈉溶液洗下一支瓊脂斜面培養(yǎng)物，制成濃厚菌懸液。5.2.1.3.先以K多價(jià)抗血清與菌懸液進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)。在1min內(nèi)觀察反應(yīng)。陽性凝集者，另進(jìn)行自然凝集試驗(yàn)，若自然凝集試驗(yàn)為陰性，再以該K多價(jià)抗血清中的單因子K抗血清進(jìn)行試驗(yàn)。5.2.1.4.與單因子K抗血清出現(xiàn)陽性凝集的，為該菌株的相應(yīng)K抗原。5.2.2.O抗原凝集試驗(yàn)5.2.2.1.以20gL氯化鈉含5（VV）甘油溶液洗另一支瓊脂斜面培養(yǎng)物，將菌懸液經(jīng)121高壓滅菌1h。5.2.2.2.以離心沉淀法去上清液，再以20gL氯化鈉溶液4000rmin離心15min，洗兩次沉

13、淀后加0.5mL2氯化鈉溶液制成濃厚的菌懸液。5.2.2.3.以已知K抗原對應(yīng)的O群抗血清進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)，同時(shí)以20gL氯化鈉溶液代替抗血清做自然凝集對照試驗(yàn)。5.2.2.4.與抗血清出現(xiàn)強(qiáng)陽性凝集的，為該菌株的O抗原。5.2.3.根據(jù)以上血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果，可報(bào)告為發(fā)現(xiàn)副溶血性弧菌O×K×血清型。6.培養(yǎng)基及試劑gL氯化鈉稀釋液氯化鈉30.0蒸餾水1000mL加熱溶解，調(diào)至pH7.0，121高壓滅菌15min，以無菌操作分裝于500mL廣口瓶或500mL三角瓶，每瓶450mL以及17mm×170mm試管，每管9mL，做稀釋樣品用。L氯化鈉蛋白胨水（PW）蛋白胨10

14、.0g氯化鈉60.0g蒸餾水1000mL將各成分加熱溶解，調(diào)至pH7.2，分裝于17mm×170mm試管，每管10mL。121高壓滅菌15min。6.3.氯化鈉多粘菌素B肉湯（SPB）酵母浸膏3.0g蛋白胨10.0g氯化鈉20.0g多粘菌素B250單位毫升培養(yǎng)基蒸餾水1000mL將各成分（除多粘菌素B外）加熱溶解，稍冷后加入多粘菌素B，調(diào)至pH7.4。分裝于17mm×170mm試管，每管10mL。121高壓滅菌15min。滅菌后，立即將培養(yǎng)基取出放涼。6.4.硫代硫酸鈉、檸檬酸鈉、膽鹽、蔗糖瓊脂（TCBS）酵母浸膏5.0g蛋白胨10.0g氯化鈉10.0g檸檬酸鈉10.0g硫

15、代硫酸鈉10.0g膽酸鈉（以牛膽酸鈉代替）3.0g牛膽汁粉（以混合膽鹽代替）5.0g蔗糖20.0g檸檬酸鐵1.0g瓊脂18.0g溴麝香草酚藍(lán)0.04g麝香草酚藍(lán)0.04g蒸餾水1000mL除指示劑外，將各種成分加熱溶解，調(diào)至pH8.6，加入指示劑。此培養(yǎng)基不必高壓滅菌，煮沸12min，待培養(yǎng)基稍涼后傾注平板。在該平板上，溶藻膠弧菌為黃色菌落，而副溶血性弧菌為藍(lán)綠色菌落。腸球菌、變形菌及大腸菌群有時(shí)也會(huì)生長，但其菌落一般較小，易與副溶血性弧菌區(qū)別。6.5.氯化鈉三糖鐵瓊脂（TSI）牛肉浸膏3.0g蛋白胨20.0g乳糖10.0g蔗糖10.0g葡萄糖1.0g硫酸亞鐵0.5g硫代硫酸鈉0.5g氯化鈉3

16、0.0g瓊脂12.0g酚紅0.024g除瓊脂和酚紅外，將其他成分用蒸餾水400mL微火加熱溶解，同時(shí)將瓊脂置于600mL蒸餾水中，浸泡數(shù)分鐘后，加熱煮沸使完全溶解。然后將以上兩液混合均勻。調(diào)至pH7.4，加入指示劑混勻，分裝于15mm×150mm試管，每管34mL，115高壓滅菌15min。滅菌后擺成斜面，使高層和斜面各約3cm。6.6.嗜鹽性試驗(yàn)用胰胨水（TB）胰胨40.0g酵母浸膏12.0g蒸餾水4000mL完全溶解后，分成4份，其中3份分別加入30g、70g、100g氯化鈉，使成0、30gL、70gL、100gL不同濃度的氯化鈉胰胨水。調(diào)至pH7.5。分裝15mm×1

17、50mm試管，每管7mL。121高壓滅菌15min。6.7.胰胨大豆瓊脂斜面（TSA）胰胨15.0g植物蛋白胨5.0g氯化鈉30.0g瓊脂15.0g蒸餾水1000mL將各成分加入水中，要不斷攪拌，加熱至煮沸1min。分裝于15mm×150mm試管，每管3mL。121高壓滅菌15min后制成斜面，最終pH7.3±0.2。試劑：10gL鹽酸四甲基對苯二胺水溶液10gl萘酚乙醇溶液將配好后的10gL鹽酸四甲基對苯二胺溶液置于密塞棕色玻璃瓶中，于510存放。此試劑極易氧化，宜現(xiàn)用現(xiàn)配。試驗(yàn)時(shí)，取37 1824h的胰胨大豆瓊脂斜面培養(yǎng)物1支。將兩種試劑各23滴從斜面上端流下，2min

18、內(nèi)呈現(xiàn)藍(lán)色者為細(xì)胞色素氧化酶試驗(yàn)陽性。6.8.靛基質(zhì)試驗(yàn)用培養(yǎng)基（I）培養(yǎng)基同6.6的30gL氯化鈉胰胨水。靛基質(zhì)試劑柯凡克（KOVAS）氏試劑：對二甲氨基苯甲醛10.0g純戊醇150.0mL濃鹽酸60.0mL 將試劑溶于戊醇中，然后慢慢加鹽酸。加熱至60后，呈深黃色，靜置67h，變成黃色即可使用。試液宜小量配制，冰箱保存。久存后，試液變?yōu)辄S褐色，不可繼續(xù)使用。在30gL氯化鈉胰胨水1824h培養(yǎng)液中，滴加柯凡克試液0.1mL。出現(xiàn)紅色環(huán)者為陽性，出現(xiàn)黃棕色環(huán)者為陰性。6.9.氨基酸試驗(yàn)用培養(yǎng)基.賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基（LD）酵母浸膏3.0g葡萄糖1.0g氯化鈉30.0gL賴氨酸5.0g溴甲酚紫0

19、.016g蒸餾水1000mL除溴甲酚紫外，將各成分加入蒸餾水中，攪拌均勻，靜置約10min，加熱至完全溶解，調(diào)至pH6.7±0.1。分裝于10mm×100mm試管，每管1mL。121高壓滅菌10min。滅菌后應(yīng)立即取出放涼，接種培養(yǎng)后，培養(yǎng)基顏色變?yōu)樯钭仙臑殛栃苑磻?yīng)，變?yōu)辄S色的，為陰性反應(yīng)。.精氨酸雙水解酶試驗(yàn)用培養(yǎng)基（AD）基礎(chǔ)培養(yǎng)基同賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)用培養(yǎng)基，精氨酸加入量同賴氨酸量。P半固體瓊脂（VP）酵母浸膏1.0g蛋白胨12.0g葡萄糖10.0g氯化鈉30.0g瓊脂3.0g蒸餾水1000mL將各成分加入蒸餾水中，靜置約10min，攪拌、加熱至溶解。調(diào)pH7.3&#

20、177;0.1，分裝于10mm×100mm試管，每管1mL，121高壓滅菌10min。滅菌后，立即取出放涼。VP試劑：甲液：萘酚6.0g純乙醇100.0mL乙液：氫氧化鉀40.0g肌酸0.3g蒸餾水100.0mL 先將氫氧化鉀溶于水中，再加入肌酸。以上試劑保存于冰箱中，可使用兩個(gè)月。試驗(yàn)時(shí)，分別加甲液0.2mL（約6滴）和乙液0.1mL（約3滴）。加入試劑后呈現(xiàn)紅色者為陽性，銅色為陰性。對陰性結(jié)果1h后再做一次檢查。6.11.糖類分解試驗(yàn)用培養(yǎng)基蛋白胨10.g牛肉浸膏3.0g氯化鈉30.0g溴甲酚紫0.04g蒸餾水1000mL除溴甲酚紫外，將各成分加熱溶解，按1量加入糖類。調(diào)至pH7

21、.0±0.2，加入溴甲酚紫。分裝于10mm×100mm試管，每管1mL，112高壓滅菌15min。生長試驗(yàn)用培養(yǎng)基胰胨17.0g大豆胨3.0g氯化鈉30.0g磷酸氫二鉀2.5g葡萄糖2.5g蒸餾水1000mL除葡萄糖外，將各種成分混合溶解，煮沸12min，加入葡萄糖。調(diào)至pH7.3±0.2。分裝于15mm×150mm試管，每管7mL，121高壓滅菌15min。F試驗(yàn)用培養(yǎng)基（HLGB）蛋白胨2.0g酵母浸膏0.5g氯化鈉30.0g葡萄糖10.0g溴甲酚紫0.015g瓊脂3.0g蒸餾水1000mL將各成分（除溴甲酚紫外）加于蒸餾水中加熱溶解，調(diào)至pH7.4，加入溴甲酚紫，混