時間分辨熒光免疫分析法乙型肝炎血清標志物分析靈敏度

1、時間分辨熒光免疫分析法乙型肝炎血清標志物分析靈敏度的建立與分析Establishment and analysis of analytic sensitivity of hepatitis B virus serum markers by Time-resolved Fluoroimmunoassay譚玉華 陳鮮美 盧順舵 沈 ?。◤V州市豐華生物工程有限公司，廣東 廣州 510730）摘 要 對乙型肝炎表面抗原和表面抗體定量測定試劑盒（時間分辨熒光免疫分析法）的分析靈敏度進行建立與分析，以便更好的指導(dǎo)臨床診斷和進行流行病學(xué)研究。通過實驗研究，乙型肝炎病毒表面抗原定量檢測試劑盒和表面抗體定量檢測

2、試劑盒的檢測低限分別為0.0356ng/mL和0.548 mIU/mL，生物檢測限分別為0.200 ng/mL和5.00 mIU/mL，功能靈敏度分別為0.200 ng/mL和5.00 mIU/mL，線性范圍分別為0.200 ng/mL-300 ng/mL和5.00 mIU/mL-1200 mIU/mL，并達到中國藥品生物制品檢定所檢定要求。時間分辨熒光免疫分析法乙型肝炎病毒定量檢測試劑盒具有靈敏度高，線性范圍寬，特異性強的特點，已能有效應(yīng)用于臨床體外診斷和流行病學(xué)研究。關(guān)鍵詞 時間分辨熒光免疫分析；乙型肝炎；標志物；分析靈敏Establishment and analysis of anal

3、ytic sensitivity of hepatitis B virus serum markers by Time-resolved FluoroimmunoassayTAN Yu-hua,CHEN Xian-mei,LU Shun-duo,et al. Guangzhou Fenghua Bio-engineering Co.,LTD,Guangzhou 510730 ChinaAbstract To establish and analyse the analytic sensitivity for the quantification kits for hepatitis B vir

4、us(HBV) surface antigen(HBsAg) and antibody to HBsAg (anti-HBs),the kits were measured by Time-resolved Fluoroimmunoassay(TRFIA),in order to the better instruction clinical diagnosis and conducts the epidemiology research. Through the study,the lower limit of detection of the quantification kits for

5、 HBsAg and anti-HBs for 0.0356ng/mL and 0.548 mIU/mL respectively, the biological limit of detection is 0.200 ng/mL and 5.00 mIU/mL respectively, the function sensitivity is 0.200 ng/mL and 5.00 mIU/mL respectively, the linear scope is 0.200 ng/mL-300 ng/mL and 5.00 mIU/mL-1200 mIU/mL respectively,

6、and passed the examination of the National Institute for Control of Pharmaceutical and Biological Products. The quantification kits for HBV serum markers by TRFIA ,which has the high sensitivity, the wide linear scope,the good specificity,could have the effect to use in the clinical in vitro diagnos

7、is and the epidemiology research.Key words Time-resolved Fluoroimmunoassay; Hepatitis B virus;Marker;Analytic sensitivity乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的檢出是乙型肝炎病毒（HBV）感染的金標準。乙型肝炎病毒表面抗體（抗-HBs）是對HBV具有保護性的免疫指標，它的檢出有助于乙型肝炎（簡稱：乙肝）的預(yù)防與接種。隨著時間分辨熒光免疫分析法（TRFIA）在定量檢測HBsAg和抗-HBs中的應(yīng)用，對HBsAg和抗-HBs的分析靈敏度有了進一步提高，并且定量結(jié)果取代了定性報告，為

8、臨床診斷提供了更多的信息。在實驗室，對試劑盒和方法學(xué)有必要建立自己的可定量報告的生物檢測限或?qū)υ噭┖泻头椒▽W(xué)說明的檢測限進行確認1-2，以便更好的指導(dǎo)臨床的診斷。作者在此對乙型肝炎HBsAg和抗-HBs定量測定試劑盒（時間分辨熒光免疫分析法）的分析靈敏度進行了建立與分析。1 材料與方法1.1 材料與儀器 高濃度HBsAg和抗-HBs血清各5.00mL，乙型肝炎病毒表面抗原定量檢測試劑盒（國藥準字S20050108）和表面抗體定量測定試劑盒（國藥準字S20050110）（時間分辨熒光免疫分析法），以及DEM-III自動酶標洗板機和FWZ-I振蕩儀均由廣州市豐華生物工程有限公司提供?！皺z測HBsA

9、g血清Panel國家參考品”（批準文號：91衛(wèi)生參字0003）和“檢測抗-HBs血清Panel國家參考品”（批準文號：91衛(wèi)生參字0004）購于中國藥品生物制品檢定所。VICTOR2TMD 1420 MULTILABEL COUNTER（時間分辨熒光免疫檢測儀）為Wallac產(chǎn)品。1.2 方法 采用試劑盒0標準品為空白液（BLANK），將高濃度HBsAg和抗-HBs血清加入空白液做系列稀釋，組成0.000ng/mL、0.200 ng/mL、0.500 ng/mL、1.00ng/mL、2.00ng/mL和5.00 ng/mL的HBsAg系列檢測限品，以及0.000mIU/mL、5.00mIU/m

10、L、10.0mIU/mL、20.0mIU/mL、30.0 mIU/mL和40.0 mIU/mL的抗-HBs系列檢測限品。并將高濃度HBsAg和抗-HBs血清分別用空白液按一定比例稀釋，各配得線性檢測品。各用三批試劑測定“檢測HBsAg血清Panel國家參考品”和“檢測抗-HBs血清Panel國家參考品”，同時做標準曲線。HBsAg采用雙抗體夾心法，抗-HBs采用雙抗原夾心法，均按試劑盒說明書嚴格操作?？瞻讟悠纷?0次批內(nèi)重復(fù)測定；對其它系列檢測限品做天間重復(fù)測定，共連續(xù)做20天。實驗均在VICTOR2TMD 1420 MULTILABEL COUNTER上測定熒光值（RF值）。收集數(shù)據(jù)，按文獻

11、3的方法分析TRFIA 法HBsAg和抗-HBs定量檢測試劑盒的檢測低限（LLD）、生物檢測限（BLD）、及功能靈敏度（FS），參考文獻4及血清Panel國家參考品說明書對試劑盒進行檢定。2 結(jié)果2.1 分析靈敏度 空白樣品做20次批內(nèi)重復(fù)測定，其它系列檢測限品做天間重復(fù)測定，共連續(xù)做20天。其系列檢測限品的RF值檢測結(jié)果詳見表1。表1 乙型肝炎表面抗原和表面抗體系列檢測限品的熒光值檢測結(jié)果HBsAg（ng/mL） 0.000 0.200 0.500 1.00 2.00 5.00 抗-HBs（mIU/mL） 0.000 5.00 10.0 20.0 30.0 40.0 熒光值 1633 334

12、8 5631 10012 17291 41064 1680 5556 8431 15687 21148 30837 1533 3413 5513 10467 17581 39757 1432 4573 7575 14897 21475 34700 1531 3528 6122 9676 17033 38015 1513 5524 9817 19904 28048 40068 1491 3564 5682 9863 17343 38165 1548 6951 8710 19352 28842 37691 1341 3244 5593 10089 17872 43463 1387 6680 897

13、6 19765 29942 39438 1323 3342 5366 12011 19000 42757 1507 6364 9398 21100 30173 37480 1368 3390 5216 9788 15650 34988 1491 4828 8203 14884 21327 30372 1429 3344 5650 10031 13658 32543 1438 4839 7078 21327 21511 31768 1568 3269 5294 9229 17106 37854 1453 5982 9473 21818 30211 38842 1694 3217 5719 949

14、5 15873 35898 1537 6397 9096 20755 29400 35215 1486 3742 6111 12882 18023 41683 1565 4691 7946 20640 30406 40363 1360 3739 7493 10442 18826 40926 1654 5336 7919 20793 30447 40290 1464 3923 6356 12242 18878 43489 1744 4877 7255 15315 25061 35287 1379 4507 6574 10561 18640 41151 1271 4348 7296 13874 2

15、6548 30282 1281 3462 6732 10951 19045 48530 1275 5138 6980 17095 24667 34689 1768 3650 6244 12122 19336 48206 1227 5522 6501 17520 24377 34756 1423 3384 5548 11514 21054 49362 1254 5801 10753 20927 32882 38814 1377 4654 5157 12210 20808 47127 1339 5894 9022 20192 32474 40697 1499 3581 5115 13329 220

16、10 46388 1291 5245 9003 17775 26589 38917 1418 3673 6133 12587 23149 40269 1433 5211 9622 19076 29227 40990 檢測低限 HBsAg空白平均值BLANK 均值）為 1468.30，標準偏差（SD）為126.56，抗-HBs空白平均值為1451.95 ，標準偏差（SD）為147.49 。這里采用99.7%的可能性來計算檢測低限。按文獻1的方法分析：LLDHBsAg= BLANK 均值+3S0 = 1468.30+3×126.56=1847.98；LLD抗-HBs=1894.42。HB

17、sAg若以空白RF值均值為檢測的起點0,那么有99.7%的可能性,每次只做一個空白時,出現(xiàn)最高的空白RF值較該空白RF值均值高126.56的3倍,即379.68，這些RF值相當(dāng)于樣品具有的HBsAg，即為本方法HBsAg的檢測低限。同理得，較該空白RF值均值高442.47這些RF值即為本方法抗-HBs的檢測低限。將上面所有的RF值減去空白RF值均值，然后求每組的均值和標準差。見表2。表2 乙型肝炎表面抗原和表面抗體檢測系統(tǒng)分析靈敏度的計算HBsAg（ng/mL） 0.200 0.500 1.00 2.00 5.00 抗-HBs（mIU/mL） 5.00 10.0 20.0 30.0 40.0

18、X 2130.40 4394.15 9506.75 16940.55 40113.45 4035.90 6969.25 17182.85 25812.80 35122.85SD 384.94 607.06 1266.49 2223.79 4683.79 723.74 1088.42 2541.00 3826.13 3632.70CV（%） 18.07 13.82 13.32 13.13 11.68 17.93 15.62 14.79 14.82 10.34X-3×SD 975.58 2572.97 5707.28 10269.17 26062.09 1864.66 3704.00 9

19、559.86 1434.41 24224.75 > > > > > > > > > > 379.68 379.68 379.68 379.68 379.68 442.47 442.47 442.47 442.47 442.47 現(xiàn)在0.200 ng/mLHBsAg組減去空白后的RF值均值為2130.40，假定這段范圍內(nèi)HBsAg量和RF值間呈線性.因此379.68相當(dāng)于：0.200×（379.68/2130.40）=0.0356（ng/mL）。所以本法HBsAg的檢測低限為0.0356ng/mL。同理可得：本法抗-HBs的檢

20、測低限為0.548 mIU/mL。 生物檢測限 由表2得, 0.200 ng/mLHBsAg組99.7%的最低RF值為（2130.40 -3×384.94），即975.58，已大于空白RF值均值可能有的最高值379.68，說明0.200 ng/mL的樣品RF值有99.7%的可能性,一定大于空白的RF值，能定量地報告結(jié)果。0.200 ng/mL為本方法HBsAg的生物檢測限。同理可得，本方法抗-HBs的生物檢測限為5.00 mIU/mL。 功能靈敏度 從表2中可知，0.200 ng/mLHBsAg組和5.00 mIU/mL抗-HBs組的重復(fù)檢測變異系數(shù)CV%分別為18.07%和17.9

21、3%，重復(fù)檢測變異系數(shù)接近并小于20%5。所以，本方法HBsAg和抗-HBs的功能靈敏度為0.200 ng/mL和5.00 mIU/mL。2.2 線性范圍 HBsAg和抗-HBs的血清線性檢測品，經(jīng)三批試劑檢測，HBsAg線性范圍為0.200 ng/mL-300 ng/mL，抗-HBs線性范圍為5.00 mIU/mL-1200 mIU/mL。2.3 血清Panel國家參考品檢定 三批HBsAg和抗-HBs定量檢測試劑盒分別測定“檢測HBsAg血清Panel國家參考品”和“檢測抗-HBs血清Panel國家參考品”：線性參考品測定值均與標定值相關(guān)系數(shù) r >98.0%，測定值與其真實值的相對

22、誤差不大于15.0%；精密性參考品CV%10.0%；HBsAg adr亞型及抗-HBs靈敏度參考品的測定值與其真實值的相對誤差不大于10.0%，HBsAg adr、adw和ay亞型參考品最低檢出量不高于0.200ng/mL；抗-HBs靈敏度參考品最低檢出量不高于5.00 mIU/mL。3 討論 分析靈敏度（檢測限）是檢測系統(tǒng)能檢出的最低分析物濃度，包括具有定性意義的檢測低限（LLD）和具有定量意義的生物檢測限（BLD）及功能靈敏度（FS），特別是定量檢測報告能為臨床對患者的治療監(jiān)測和隨訪的正確判斷提供更多的信息。因此，在檢測系統(tǒng)正式用于實際檢測病人標本之前，實驗室必須對檢測系統(tǒng)的分析靈敏度進行建立或確認。確定檢測系統(tǒng)的可報告低限是最重要的分析性能。通過本次實驗研究，乙型肝炎病毒表面抗原定量檢測試劑盒和表面抗體定量檢測試劑盒（時間分辨免疫熒光分析法）的LLD分別為0.0356ng/mL和0.548 mIU/mL，BLD分別為0.200 ng/mL和5.00 mIU/mL，F(xiàn)S分別為0.200 ng/mL和5.00 mIU/mL，線性范圍分別為0.200 ng/mL-300 ng/mL和5.00 mIU/mL-1200 mIU/mL，并均達到中國藥品生物制品檢定所檢定要求。HBV標