補陽還五湯對沙鼠腦缺血損傷細胞凋亡的影響及機理研究

1、補陽還五湯對沙鼠腦缺血損傷細胞凋亡的影響及機理研究摘要：目的：研究補陽還五湯對沙鼠腦缺血損傷后神經細胞凋亡的作用及可能的作用機理。方法：采用沙土鼠雙側頸總動脈夾閉腦缺血再灌注模型，于再灌后120h取大腦半球，在解剖顯微鏡下切取海馬，電鏡觀察神經細胞凋亡的情況；同樣模型，于缺血再灌注后48h取腦組織測定Na+、K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶活性、乳酸含量、NO含量、一氧化氮合酶(NOS)活性、氨基酸含量等。結果：補陽還五湯可使發(fā)生海馬CA1區(qū)神經細胞凋亡的例數明顯減少；可防止缺血再灌注后腦組織Na+、K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性的降低；增加NO含量，提高NOS活

2、性；可使缺血再灌注48h后腦內谷氨酸(Glu)含量降低。結論：補陽還五湯可對抗沙鼠腦缺血再灌注損傷后的神經細胞凋亡，其作用機理與改善腦能量代謝、調節(jié)NO的合成、拮抗興奮性氨基酸毒性等方面有關。主題詞：腦缺血/病理生理學；腦缺血/病理學；腦缺血/中藥療法；腦/超微結構；補陽還五湯/治療應用中分類號：R285.5文獻標識碼：A文章編號：1007-3213(2000)04-0318-05Effect of Buyang Huanwu Decoction on Neural Cell Apoptosis After Cerebral Ischemia in Gerbils and Its Mechan

3、ismLIU Zhilong,SONG Hanping,HAN Shaojuan(Dept. of TCM, Zhuhai Peoples Hospital of Guangdong Province, Zhuhai 519000, China)DENG Changqing(The First Affiliated Hospital, Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405, China)Abstract: To study the effect of Buyang Huanwu Decoction (BHD) on neural cell

4、apoptosis after cerebral ischemia in gerbils and its mechanism, gerbil model with cerebral ischemia was established by clamping of bilateral carotid arteries and then reperfusion. Neural cell apoptosis of hippocampal gyrus slides was observed under electron microscope 120 hours after reperfusion. Th

5、e activities of Na+-K+ ATPase, Ca2+ ATPase, Mg2+ ATPase and NOS, and the contents of lactic acid, NO and amino acid in cerebral tissues were detected 120 hours after reperfusion. The results showed that BHD can reduce the incidence of neural cell apoptosis of hippocampal gyrus, prevent the decrease

6、of Na+-K+ ATPase and Ca2+ ATPase activities, increase NO content and NOS activity, and reduce cerebral glucose content. It is indicated that BHD can counteract neural cell apoptosis after cerebral ischemia in gerbils and its mechanism may be related to the improvement of cerebral energy metabolism,

7、regulation of NO synthesis and antagonism of toxic effect of excitatory amino acid.Key words: CEREBRAL ISCHEMIA/pathophysiology;CEREBRAL ISCHEMIA /pathology;CEREBRAL ISCHEMIA/TCD therapy;BRAIN/ultrastructure;BUYANG HUANWU DECOCTION/ther. use近年來的研究表明，腦缺血引起的神經元死亡與“凋亡”密切相關，在缺血性腦損傷的發(fā)生過程中，既存在神經細胞壞死，但在再灌注

8、數天后，海馬CA1區(qū)神經元的遲發(fā)性死亡則表現(xiàn)為細胞凋亡1。提示腦缺血的神經細胞損傷不完全是壞死，而有的是凋亡。補陽還五湯是治療缺血性腦血管疾病的有效方劑，其作用機理研究國內已有許多報道，但尚未見從細胞凋亡角度研究的報道。本研究觀察了補陽還五湯對沙土鼠腦缺血再灌注損傷后海馬CA1區(qū)細胞凋亡的影響。并對其可能的作用機理從能量代謝、一氧化氮、興奮性氨基酸毒性等方面進行了探討，現(xiàn)將結果報道如下。1材料與方法1區(qū)細胞凋亡取大腦半球，在解剖顯微鏡下定位海馬，切取海馬，取海馬CA1區(qū)以3%戊二醛磷酸緩沖液(0.1mol/LpH7.4)再固定2h，1%鋨酸后固定1h；梯度丙酮脫水，Epon-812環(huán)氧樹脂包埋

9、，在定位海馬CA1區(qū)后，用LKB型(瑞典)超薄切片機切片，切片厚度為60nm。經醋酸雙氧鈾檸檬酸鉛電子染色后，以日立H-600型透射電鏡觀察神經細胞凋亡情況。凡觀察到CA1區(qū)有暗細胞(系凋亡前細胞)、凋亡細胞和凋亡小體者，均屬CA1+、K+-ATP酶)、鈣三磷酸腺苷酶(Ca2+-ATP酶)、鎂三磷酸腺苷酶(Mg2+3方法，以高效液相色譜儀按內標法進行測定，進樣量為100L。1.5統(tǒng)計分析計數資料以22結果2.1對神經細胞凋亡的影響假手術組未發(fā)現(xiàn)凋亡細胞(見1-a)；模型組6例中有5例可以見到凋亡細胞或凋亡小體(見1-b)；補陽還五湯組6例均未見到凋亡細胞，神經元超微結構基本正常，僅可見到膠質細

10、胞及神經元周圍輕度水腫(見1-c)。經2檢驗分析表明，模型組CA1區(qū)出現(xiàn)神經元凋亡的例數明顯升高(2=15.11，2 0.01,3=11.345，P0.01)。而補陽還五湯組CA1區(qū)出現(xiàn)神經元凋亡的例數明顯低于模型組(P0.01)。2.2對腦組織NO含量和NOS活性的影響見表1。模型組腦組織NO含量明顯低于假手術組；補陽還五湯組NO含量也低于假手術組，但顯著高于模型組(P0.01)。模型組NOS活性顯著低于假手術組；補陽還五湯組NOS活性明顯升高，與假手術組之間差異無顯著性(P0.05)。表1各組NO和NOS的比較#組別N/只bNO/(mol.g-1)bNOS/(mol.g-1)假手術組82.

11、602.0216.712.21模型組80.790.4011.611.64補陽還五湯組81.330.7715.471.95 #：計算每g蛋白中物質的量2.3對能量代謝的影響見表2。沙鼠腦缺血再灌注48h后，模型組腦組織Na+、K+-ATP酶活性較假手術組明顯降低，補陽還五湯組該酶活性也明顯低于假手術組，但明顯高于模型組(P0.05)；模型組Ca2+-ATP酶活性較假手術組明顯降低，補陽還五湯組該酶活性雖高于模型組，但差異無顯著性(P0.05)。2.4對腦組織氨基酸含量的影響見表3。模型組腦組織谷氨酸(Glu)含量高于假手 表2各組能量代謝指標比較#組別N/只JNa+、K+-ATP酶/(nmols

12、-1)JCa2+-ATP酶/(nmols-1)JMg2+-ATP酶/(nmols-1)假手術組80.970.130.810.100.820.06模型組80.200.160.260.250.240.24補陽還五湯組80.520.23*0.350.110.310.08 *與模型組比P0.05，P0.01(下同)；與假手術組比P0.05，P0.01(下同)；#均計算每s酶觸反應將每mg蛋白轉化有機磷的量 表3各組腦組織氨基酸含量比較#組別N/只bGlu/(molg-1)bAsp/(molkg-1)bGABA/(molg-1)bGly/(molg-1)假手術組86.700.927.020.320.89

13、0.340.930.17模型組68.700.491.410.311.030.210.910.15補陽還五湯組67.621.55*1.000.261.080.210.930.36 #：計算每g腦組織中物質的量 a.(6000)假手術組：示海馬CA1區(qū)神經元形態(tài)正常；b.模型組(5000)：示CA1區(qū)神經元和細胞核固縮變小，核染色質密集，核膜皺縮不平，胞質內細胞器密集，線粒體和粗面內質網均輕度腫脹，相鄰可見暗細胞(凋亡細胞)、膠質細胞和毛細血管周圍水腫空泡化；c.補陽還五湯組：示海馬CA1區(qū)神經元形態(tài)基本正常，毛細血管周圍膠質泡可見水腫術組(P0.05)，補陽還五湯組Glu含量低于模型組(P0.0

14、5)，但與假手術組相比差異無顯著性(P0.05)。模型組腦組織天冬氨酸(Asp)含量較假手術組明顯降低(P0.05)，補陽還五湯組Asp含量較模型組降低，但差異無顯著性(P0.05)。腦組織-氨基丁酸(GABA)含量與甘氨酸(Gly)含量各組相比差異均無顯著性(P0.05)。1各組沙鼠海馬CA1區(qū) 電鏡觀察結果3討論細胞凋亡(apoptosis)又稱細胞程序性死亡，是一種不同于細胞壞死的死亡方式，它是指細胞象秋天的樹葉凋謝一樣，在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自己結束其生命的過程，最后細胞脫落離體或裂解為若干凋亡小體(apoptotic bodies),而被其他細胞吞噬。在形態(tài)學上，

15、細胞凋亡表現(xiàn)為神經細胞核染色質斷裂、聚集；進而固縮，核膜崩解，細胞漿凝聚、固縮并空泡化，被細胞膜包裹形成凋亡小體而被巨噬細胞或小膠質細胞吞噬，沒有炎癥發(fā)生。細胞凋亡過程有其復雜的分子機制，受細胞自身基因調控。在腦卒中的病理過程中，存在細胞凋亡這一病理機制。沙鼠腦缺血再灌注后，海馬CA1區(qū)出現(xiàn)遲發(fā)性神經細胞死亡，這種遲發(fā)性神經損傷與海馬區(qū)神經元凋亡有關4。目前已有大量研究都證實缺血性腦損傷的神經元死亡與細胞凋亡關系密切，提示腦缺血的神經細胞損傷不只是壞死，而且與凋亡密切相關，特別是腦缺血后的遲發(fā)性神經元死亡，細胞凋亡為其主要的死亡方式1。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組動物大多數海馬CA1區(qū)神經元在電鏡下可見

16、到凋亡的發(fā)生，補陽還五湯可使海馬CA1區(qū)神經元發(fā)生凋亡的例數減少，提示補陽還五湯可能具有對抗腦缺血再灌注后CA1區(qū)神經細胞凋亡的作用。由于本研究是采用電鏡觀察海馬CA1區(qū)神經元，可能受觀察范圍和觀察方法的局限，因此，本研究結果還有待于其他方法證實。至于凋亡發(fā)生的確切機制目前尚不清楚，有研究表明，體外小劑量的H2O2、NO及谷胱苷肽合成抑制劑均能誘導多種細胞發(fā)生凋亡，細胞內Ca2+濃度增加也可促進凋亡的發(fā)生5，提示氧自由基和Ca2+在凋亡發(fā)生過程中起重要作用。補陽還五湯可對抗腦缺血后的氧自由基毒性，防止細胞內Ca2+超負荷，調節(jié)腦內花生烯代謝6，7，由此推測補陽還五湯抗腦缺血后海馬CA1區(qū)神經細

17、胞凋亡與上述作用有關。為了深入闡明其具體作用機理，本文還進行了進一步的研究，推測其作用可能還與以下環(huán)節(jié)有關。3.1改善能量代謝腦缺血后最早受影響的是能量代謝。腦內ATP的貯存是有限的，一旦血流供應中止，57min后ATP貯庫耗竭，腦組織神經細胞不能進行主動過程(轉運、合成等)8。補陽還五湯可防止缺血再灌注48h后腦組織Na+、K+-ATP酶的活性降低，對腦缺血損傷后腦組織的能量代謝有一定的改善作用。3.2提高NO的合成腦組織存在豐富的NOS，可產生NO。研究表明，固有型NOS(cNOS)在基礎條件下起作用，產生的NO對腦循環(huán)起重要的調節(jié)作用；而誘導型NOS(iNOS)在基礎條件下不起作用，在缺

18、血時表達并產生高濃度的NO，從而加速能量消耗，損傷DNA，導致神經細胞死亡。研究發(fā)現(xiàn)，iNOS的活化在原代神經細胞培養(yǎng)中引起的神經細胞死亡是以凋亡為特征的9。在大鼠局灶性腦缺血模型，腦缺血早期(阻斷大腦中動脈后510min)NO持續(xù)增加，至30min達峰值，之后逐漸降至正常，再灌注數分鐘到40min又輕度增加，之后又恢復至正常水平10，11。給予NOS抑制劑L-NANE或L-NNA等可明顯減少大鼠局灶性腦缺血區(qū)血流量12。但也有研究表明，L-NANE等可使局部腦梗塞體積縮小，NOS抑制劑對腦缺血起保護作用13?？梢?，NO既具有潛在的有益作用，又有毒性作用。NO濃度升高主要發(fā)生在缺血早期，此時對

19、神經細胞有毒性作用，而在再灌注后期，NO對腦血流等具有有益的調節(jié)作用。補陽還五湯可對抗再灌注后期NO含量和NOS活性的降低，提示該方可能通過提高NO的合成，而發(fā)揮抗缺血性損傷后細胞凋亡的作用。3.3對抗EAA的毒性興奮性氨基酸(excitatory aminoacid,EAA)主要指谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)。EAA是中樞神經系統(tǒng)中興奮性神經突觸的主要神經遞質，同時又是一種神經毒素。腦缺血缺氧時，大量EAA尤其是Glu的爆發(fā)性釋放，EAA受體過度激活，使一些受體在正常生理刺激下引起的第二信使的效應得到擴大，突觸后神經元過度興奮、潰變、壞死，這就是所謂的“興奮毒性”。腦缺血時，缺血神經

20、元大量釋放的EAA尤其是Glu對神經元的損傷起關鍵作用。由于EAA使神經元持續(xù)去極化，增強了神經元內的Glu等大量釋放。又因腦缺血后ATP降解，依賴能量而重吸收Glu的機制衰竭，影響Glu攝取功能，甚至出現(xiàn)Glu向細胞外液轉移，如此惡性循環(huán)，突觸間隙持續(xù)高濃度的Glu就引起興奮性神經毒性14，15。因此，拮抗EAA的興奮毒性，包括抑制其過度釋放，促進其再攝取，以及對抗其受體激活，對缺血性腦損傷具有良好的防治作用。本研究發(fā)現(xiàn)，補陽還五湯可使腦缺血再灌注后腦組織Glu含量降低，提示對抗EAA的興奮毒性，可能也是補陽還五湯抗缺血性腦損傷細胞凋亡的作用機制之一。腦內還存在抑制性氨基酸(inhibito

21、ryaminoacid,IAA),主要指-氨基丁酸(GABA)和甘氨酸(Gly)，為中樞神經系統(tǒng)內的抑制性遞質，可抑制神經元興奮，減少由于EAA造成的神經細胞損傷。本研究中補陽還五湯對IAA沒有明顯的作用?；痦椖浚簭V東省中醫(yī)藥管理局資助項目(編號：98453)作者簡介：劉志龍(1963-)，男，副主任醫(yī)師；劉志龍（廣東省珠海市人民醫(yī)院中醫(yī)科，珠海519000）宋含平（廣東省珠海市人民醫(yī)院中醫(yī)科，珠海519000）鄧常青（廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣州510405）韓紹娟（廣東省珠海市人民醫(yī)院中醫(yī)科，珠海519000）參考文獻：1呂曉紅，許麗艷，李恩民，等.一氧化氮在遲發(fā)性神經元壞死中與程序

22、性細胞死亡關系的研究J.中風與神經疾病雜志，1997，2：682嚴翠芬，李麟仙，王子燦，等.沙土鼠短暫性腦缺血后海馬遲發(fā)性神經元死亡機理的研究J.中國病理生理雜志，1991，7(6)：6053Chen B M, Xia L W ,Zhao R Q. Determination of NG, NG-dimethylarginine in human plasma by high-performance liquid chromatographyJ. Journal of Chromatography B，1997,692:4674Nitatori T, Sato N, Waguri S, et

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