組合化學(xué)的高通量合成策略

1、組合化學(xué)的高通量合成策略         10-05-19 08:55:00     作者：段梅莉     編輯：studa20【摘 要】本文對(duì)一門(mén)新興的用于新藥開(kāi)發(fā)的組合化學(xué)技術(shù)進(jìn)行了簡(jiǎn)要的歸納和總結(jié)。組合化學(xué)的高通量合成策略從合成方法學(xué)上歸納為三類(lèi)方法:平行合成法、裂分合成法、集組式合成。并概括介紹了高通量合成的重要輔助因子固相載體技術(shù)和自動(dòng)化技術(shù)。 【關(guān)鍵詞】組合化學(xué) 高通量合成 新藥開(kāi)發(fā) 20世紀(jì)80年代末興起的組合化學(xué)技術(shù)在新

2、藥開(kāi)發(fā)的過(guò)程中,在先導(dǎo)物的發(fā)現(xiàn)和結(jié)構(gòu)優(yōu)化上取得了卓有成效的研發(fā)結(jié)果。組合化學(xué)所運(yùn)用的高通量合成技術(shù)與傳統(tǒng)的有機(jī)合成有顯著的不同。如圖1所示,一般有機(jī)合成方法每次合成得到一個(gè)產(chǎn)物。高通量合成技術(shù)則是進(jìn)行組合合成,用一個(gè)構(gòu)建模塊A與另一個(gè)構(gòu)建模塊B的n個(gè)單元同時(shí)進(jìn)行一步反應(yīng),可以得到n個(gè)產(chǎn)物。用一個(gè)構(gòu)建模塊A的m個(gè)單元與另一個(gè)構(gòu)建模塊B的n個(gè)單元同時(shí)進(jìn)行一步反應(yīng),則得到m×n個(gè)化合物;若進(jìn)行Y步反應(yīng),則得到n×n×Y或m×n×Y個(gè)化合物。有人作過(guò)統(tǒng)計(jì),一個(gè)化學(xué)家用組合合成在26周完成的工作量,相當(dāng)于十個(gè)化學(xué)家用傳統(tǒng)方法花費(fèi)一年時(shí)間才能合成得到的化合

3、物數(shù)目。由此可見(jiàn),高通量合成大幅度提高了新化合物的合成效率,減少了時(shí)間和資金的消耗,成為繼20世紀(jì)末至今化學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。 高通量合成可以分為固相組合合成和液相組合合成兩大類(lèi),組合化合物庫(kù)也相應(yīng)的分類(lèi)為固相庫(kù)和液相庫(kù)。因此庫(kù)化合物的合成策略應(yīng)當(dāng)圍繞著這二大類(lèi)組合合成展開(kāi)進(jìn)行。高通量合成從合成方法學(xué)上來(lái)說(shuō),可歸納為以下三種方式:平行合成法;裂分合成法;集組式合成。 1 平行合成法(Parallel synthesis) 也稱(chēng)間隔平行式合成。間隔平行式合成的基本原理是一孔一化合物。與傳統(tǒng)有機(jī)合成的原理相似,通過(guò)空間隔開(kāi)的整齊排列的反應(yīng)器皿來(lái)平行合成化合物。由于在特定區(qū)域可得到很純的化合物,因此化

4、合物結(jié)構(gòu)測(cè)定容易,參數(shù)相對(duì)容易取得。該方法的特點(diǎn)是合成速度較快、化合物數(shù)目較大,可用于固相組合合成和液相組合合成中。平行合成法多使用96孔微量滴定板操作。平行合成法已成功用于抗菌化合物和神經(jīng)激肽-2拮抗劑類(lèi)似物等化合物庫(kù)的制備。 當(dāng)化合物庫(kù)有許多生物活性化合物供篩選時(shí),使用平行合成法最適合。因?yàn)槠叫泻铣煞ê铣傻幕衔锸且豢滓换衔?單個(gè)化合物對(duì)新藥開(kāi)發(fā)中先導(dǎo)化合物優(yōu)化和構(gòu)效關(guān)系研究(SAR)特別有價(jià)值。平行液相合成和平行固相合成均可快速、高效的合成出對(duì)應(yīng)大量單個(gè)化合物的液相庫(kù)和固相庫(kù)。固相庫(kù)的合成產(chǎn)量可以從納摩爾到毫摩爾不等,一般來(lái)說(shuō)液相庫(kù)的產(chǎn)量較固相庫(kù)高。化合物庫(kù)容量在幾千以上時(shí),多采用自動(dòng)

5、化裝置進(jìn)行合成。 1.1 多針?lè)?Polypin) 也稱(chēng)多中心合成法,它是Geyson教授發(fā)明的用于多肽合成的一種96孔微量滴定板反應(yīng)裝置。該裝置每孔對(duì)應(yīng)使用長(zhǎng)40mm,直徑4mm的聚乙烯小棒(針)固定在滴定板上進(jìn)行操作。每個(gè)小棒承載的化合物量在100納摩爾-50微摩爾不等,可合成超過(guò)25mg的產(chǎn)物。這種多針合成反應(yīng)裝置已成功地用于口蹄疫病毒抗原體的免疫學(xué)研究上。 多針合成法的具體操作是,將浸在丙烯酸水溶液中的聚乙烯(PE)或聚丙烯(PP)小棒用射線照射,使針的表面活化?；罨蟮尼槺霍然采w。這些羧基與長(zhǎng)鏈的結(jié)合分子連接后,就提供了既能增加反應(yīng)體系流動(dòng)性又可以連接構(gòu)件的氨基基團(tuán)。把不同的氨基

6、酸溶液反應(yīng)試劑移到96孔微板的每個(gè)孔中,即可對(duì)每一根針進(jìn)行獨(dú)立的合成反應(yīng)。在每步反應(yīng)完成后將小棒移開(kāi),在一個(gè)公共反應(yīng)器中對(duì)這些小棒同時(shí)進(jìn)行樹(shù)脂珠的沖洗等純化操作。重復(fù)這些操作直至拿到理想化合物。對(duì)應(yīng)小棒上的目標(biāo)產(chǎn)物可通過(guò)切割分離到滴定板的每個(gè)孔中,就使得每個(gè)孔均含有一個(gè)單獨(dú)的化合物。使用連在針上的多肽進(jìn)行生物活性測(cè)定時(shí),可與多種靶分子進(jìn)行結(jié)合試驗(yàn),操作可反復(fù)進(jìn)行多達(dá)幾十次。 多針合成法是一種有效平行合成多肽的方法,尤其是以羧基或酰胺結(jié)尾的多肽。該法也可用以合成苯并二氮雜窧類(lèi)有機(jī)小分子化合物庫(kù)。目前該技術(shù)正向著高負(fù)載量、多種官能團(tuán)化的固相載體材料以及多樣性豐富的化學(xué)反應(yīng)方向發(fā)展。在先期為抗原位點(diǎn)

7、研究進(jìn)行的多肽合成中,多針合成法產(chǎn)生了非常大的影響,已成為最有價(jià)值的組合化學(xué)合成技術(shù)的標(biāo)志。 1.2 茶葉袋法(Tea-bag) 茶葉袋法是Houghten教授1986年發(fā)明的一種組合合成技術(shù)。該技術(shù)自使用以來(lái),對(duì)探明激素分子活性片段有關(guān)的構(gòu)效關(guān)系研究、對(duì)蛋白質(zhì)片斷構(gòu)象的探察以及對(duì)RGD肽類(lèi)似物的深入研究都顯示了很大的功效。 該方法的固相載體為常見(jiàn)的Merrifield聚苯乙烯樹(shù)脂,反應(yīng)容器為化學(xué)惰性的多孔PE小袋,袋子的大小尺寸約為15mm×22mm,茶葉袋網(wǎng)眼74um,可防止樹(shù)脂珠漏出,保證溶劑等可溶性物質(zhì)的出入。為了高通量合成大容量的多肽庫(kù),節(jié)省時(shí)間和工作量,在相同的化學(xué)反應(yīng)步

8、驟中,每一個(gè)反應(yīng)器內(nèi)可容納多個(gè)袋子,同時(shí)進(jìn)行相同的反應(yīng),集中進(jìn)行洗滌、脫保護(hù)和中和。再集中切除樹(shù)脂珠。根據(jù)茶葉袋的尺寸和樹(shù)脂珠的質(zhì)量,化合物庫(kù)每個(gè)產(chǎn)物的產(chǎn)量大約為7-15mg,多的可達(dá)100mg。使用這種集中進(jìn)行共同反應(yīng)步驟的方法,在制備肽庫(kù)時(shí)大大提高了合成效率,使之成為組合合成的典型范例。 1.3 點(diǎn)陣法 該法是以纖維素紙片作為固相載體的合成技術(shù)。以纖維素為基質(zhì)的紙片具有多孔性和極性,可在篩選時(shí)避免出現(xiàn)非特異性蛋白結(jié)合的副作用。但其缺點(diǎn)是不耐受強(qiáng)酸環(huán)境,僅適合Fmoc保護(hù)方式的構(gòu)件。該合成反應(yīng)操作簡(jiǎn)便,雖無(wú)制備意義,但其合成技巧可以與嫁接多針掃描法及超大規(guī)模固定化多肽合成技術(shù)相媲美。點(diǎn)陣法多

9、肽庫(kù)的合成已用于對(duì)人體巨細(xì)胞病毒蛋白抗原決定簇的定位試驗(yàn)。 點(diǎn)陣法斑點(diǎn)合成技術(shù)操作是,控制所用試劑的體積,選擇斑點(diǎn)的位置,使斑點(diǎn)布滿一張紙面而又不發(fā)生重疊。這些斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)不同的多肽,可以用鉛筆標(biāo)記斑點(diǎn)。將結(jié)合分子接到紙上后,對(duì)每個(gè)斑點(diǎn)滴加相應(yīng)高濃度的氨基酸活化酯溶液,經(jīng)洗滌-脫保護(hù)-再洗滌處理,完成一個(gè)構(gòu)件的縮合。如此反復(fù)操作進(jìn)行多肽的合成。用溴酚藍(lán)指示劑給紙片染色,通過(guò)觀察由藍(lán)到黃的顏色變化(游離的氨基被?；?來(lái)跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。 1.4 光印法(Light-directed parallel synthesis) 也稱(chēng)超大規(guī)模固定化多肽合成(very large scale immobilized peptide synthesis, VLSIPS)。光印法是將固相合成技術(shù)與光敏式印刷技術(shù)結(jié)合為一體的一種高通量合成方法。它是平行合成中較為特殊的一種方法,其關(guān)鍵技術(shù)是對(duì)光不穩(wěn)定的保護(hù)基通過(guò)特殊位置的光照會(huì)選擇性的斷裂。該法可以在一張50um2的玻璃載片上合成出容量高達(dá)5萬(wàn)的多肽或寡聚核苷酸的化合物庫(kù)。并且每種特定產(chǎn)物序列占據(jù)空間的一個(gè)特定區(qū)域。由于篩選是連在載體上進(jìn)行,經(jīng)熒光顯色篩選識(shí)別出有生物活性化合物的結(jié)構(gòu),可由其所在位置得到確認(rèn),合成十分精確。該合成技術(shù)已用于內(nèi)啡肽的抗體合成篩選試驗(yàn)。 2 裂分合成法(split-poll synthesis) 亦稱(chēng)混合-裂分式合成、一珠