骨髓增生異常綜合征淋巴細(xì)胞亞群及其激活狀態(tài)的分析

1、骨髓增生異常綜合征淋巴細(xì)胞亞群及其激活狀態(tài)的分析作者：楊雋，王椿，謝匡成，顏式可，高彥榮，蔡琦，秦尤文，萬理萍，蔡宇 【摘要】 本研究探討骨髓增生異常綜合征（MDS）患者外周血T細(xì)胞亞群，B細(xì)胞，NK細(xì)胞數(shù)量及激活狀態(tài)的臨床意義。采用流式細(xì)胞術(shù)對30例MDS患者外周血T細(xì)胞，B細(xì)胞，NK細(xì)胞及其表面活化分子CD28，CD45RA，CD45RO，CD69，HLA-DR的表達(dá)進(jìn)行檢測和分析。30例MDS患者中低危組（RA RAS）22例，高危組(RAEB RAEBT)8例。結(jié)果表明：MDS組T細(xì)胞（CD3 細(xì)胞）的百分率低于正常對照組，CD4 CD45RA 細(xì)胞（未致敏CD4 細(xì)胞）的數(shù)值低于正常

2、對照組。MSD組早期活化T細(xì)胞（CD3 CD69 細(xì)胞）和晚期活化T細(xì)胞（CD3 HLA-DR 細(xì)胞）的數(shù)值均顯著高于正常對照組。低危組(RA和RAS)主要表現(xiàn)為T細(xì)胞活化功能的改變：早期活化T細(xì)胞（CD3 CD69 細(xì)胞）和晚期活化T細(xì)胞（CD3 HLA-DR 細(xì)胞）比例均增高，以及B細(xì)胞數(shù)量的減少。高危組（RAEB和RAEBT）主要表現(xiàn)為T細(xì)胞亞群數(shù)量的改變：CD3 細(xì)胞，CD3 CD4 CD8-細(xì)胞(T輔助細(xì)胞)數(shù)量的減少，CD3 細(xì)胞HLA-DR和CD69的表達(dá)并不增高。NK細(xì)胞數(shù)量減少。結(jié)論：MDS病人存在有T細(xì)胞數(shù)量和功能的異常，且隨著病情的進(jìn)展而發(fā)生改變，所以T細(xì)胞亞群及活化功能

3、的檢測對于判斷疾病的進(jìn)程和指導(dǎo)治療具有重要的意義?！娟P(guān)鍵詞】 骨髓增生異常綜合征；T細(xì)胞亞群；B細(xì)胞；NK細(xì)胞；激活標(biāo)志 Evaluation of the Subsetsof Lymphocytes and Their Activated Status in Patients with Myelodysplastic SyndromeAbstractThis study was purposed to investigate the clinical significance of the amount and activated status of T cell subsets，B cel

4、ls，NK cells in peripheral blood from patients with myelodysplastic syndrome (MDS). The proportion of T cells，B cells，NK cells in peripheral blood from 30 patients with MDS and their surface activation markers of CD28，CD45RA，CD45RO，CD69，HLA-DR were analyzed by flow cytometry. Twenty-two patients were

5、 in the low risk group (RA RAS) while eight patients were in the high risk group (RAEB RAEBT). The result showed that the amounts of T cells (CD3 cells) in peripheral blood from patients with MDS were lower than those in control group .The amounts of naived CD4 cells (CD4 CD45RA cells) in MDS patien

6、ts were lower than those in control. The expression rates of early activation marker (CD69) and late activation marker (HLA-DR) on CD3 cells in MDS patients were significantly higher than those in control. The abnormalities of the immunologically competent cells were mainly observed in the low risk

7、group (RA RAS)，and were characterized by the high expression rates of CD69 and HLA-DR on CD3 cells，the decrease of B cell amounts. The amount abnormalities of T cell subsets were mainly observed in high risk group (RAEB RAEBT)，and were characterized by the decrease of CD3 cells and CD3 CD4 CD8-cells

8、 (Th cells)amounts without high expression of the CD69 and HLA-DR，the decrease of NK cells amounts. It is concluded that there are the abnormalities of T cell subsets and function in the patients with MDS and may change with disease progression，so the measurement of amonnt and activated status of T

9、cell subsets in peripherat blood from MDS patients can have predictive role for diagnosis of disease progression and guide of therapy. Key wordsmyelodysplastic syndrome; T cell subset; B cell; NK cell; activation marker骨髓增生異常綜合征（MDS）是一組由于造血干細(xì)胞突變而引起的惡性克隆增殖性疾病，該病具有異質(zhì)性，以骨髓無效造血，三系細(xì)胞減少和形態(tài)學(xué)異常為特征?，F(xiàn)有的臨床資料表明

10、，部分MDS病人用免疫抑制劑（如ATG，環(huán)孢菌素） 治療有效，且MDS和其它各種腫瘤一樣，可出現(xiàn)副瘤免疫現(xiàn)象，如血管炎，關(guān)節(jié)炎，Sweet綜合癥，Crohns病等。這些免疫紊亂的表現(xiàn)可出現(xiàn)在MDS發(fā)病之前、之后或同時發(fā)生。以上事實(shí)提示了MDS可能與免疫功能異常有關(guān)，但確切的機(jī)理尚不清楚1。本研究通過流式細(xì)胞儀三色熒光標(biāo)記的方法對MDS患者外周血（PB）淋巴細(xì)胞功能及激活狀態(tài)進(jìn)行了分析，并探討其臨床意義。 材料和方法 研究對象 所有病例均系我院2003年5月至2004年12月住院或門診的患者，共30例，根據(jù)FAB分型，難治性貧血RA 20例，RAS 2例，RAEB 6例，RAEBT 2例。其中女

11、性13例，男性17例，中位年齡58歲（16-87歲），均為初治的病例。將RA和RAS分為低危組，RAEB和RAEBT分為高危組，病人情況詳見表1。對照組15例，男性8例，女性7例，為我院工作人員和正常獻(xiàn)血者，中位年齡45歲。Table 1. Clinical characteristics of the MDS patients 方法 取肘靜脈血2 ml，2EDTA-Na2抗凝，然后取抗凝血100 l，加入放有三色熒光標(biāo)記單克隆抗體組合(PE/FITC/CY5)的試管：CD3/CD4/CD8，CD3/CD(16 56)/CD19，CD3/CD4/CD28，CD3/CD8/CD28，CD4/CD

12、45RA/CD45RO，CD8/CD45RA/CD45RO，CD3/HLA-DR/CD69（法國Coulter公司），混勻后室溫閉光溫育30分鐘，用Coulter公司Immuno-PREP全血標(biāo)本處理儀，經(jīng)配套產(chǎn)品進(jìn)行溶血，稀釋和固定后，4小時內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測，配套軟件取數(shù)和分析，以CD3 細(xì)胞設(shè)門圈定淋巴細(xì)胞進(jìn)行分析（圖1）。每個樣本分析20 000個細(xì)胞，結(jié)果以陽性細(xì)胞的百分率（）表示。 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有資料均采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)經(jīng)過正態(tài)性檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，故采用t檢驗(yàn)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（XSD）表示。 結(jié) 果 MDS和對照組外周血中不同淋巴細(xì)胞亞群表型比較

13、MDS患者外周血中CD3 細(xì)胞（T淋巴細(xì)胞）的百分率低于正常對照組(P0.05)，其中CD4 CD45RA 細(xì)胞（未致敏CD4 細(xì)胞）的數(shù)值明顯低于正常對照組(P0.05)。CD3-CD19 細(xì)胞（B細(xì)胞）的數(shù)值低于正常對照組。CD3-CD(16 56) 細(xì)胞（NK細(xì)胞）、T細(xì)胞共刺激因子的表達(dá)（CD3 CD4 CD28 ，CD3 CD8 CD28 ）與正常對照組相比無顯著差異(P0.05)。早期活化T細(xì)胞（CD3 CD69 細(xì)胞）和晚期活化T細(xì)胞（CD3 HLA-DR 細(xì)胞）的絕對值均顯著高于正常對照組(P0.05)。但CD4 CD45RA 細(xì)胞（未致敏CD4 細(xì)胞）的數(shù)值低于正常對照組(P

14、0.05) （表2）。CD3-CD(16 56) 細(xì)胞（NK細(xì)胞）的數(shù)值低于正常對照組。CD3-CD19 細(xì)胞（B細(xì)胞），T細(xì)胞共刺激因子的表達(dá)（CD3 CD4 CD28 ，CD3 CD8 CD28 ）與正常對照組相比無顯著差異(P0.05)。早期活化T細(xì)胞（CD3 CD69 細(xì)胞）和晚期活化T細(xì)胞（CD3 高危組和對照組PB不同淋巴細(xì)胞亞群表型比較高?；颊逷B中CD3 細(xì)胞（T淋巴細(xì)胞）總數(shù)明顯低于正常對照組(P0.01) （表2），CD3 CD4 CD8-細(xì)胞（T輔助細(xì)胞）絕對值明顯低于正常對照組(P0.05)，CD4 CD45RA 細(xì)胞（未致敏CD4 細(xì)胞）數(shù)值明顯低于正常對照組(P0.

15、05)。CD3-CD(16 56) 細(xì)胞（NK細(xì)胞）的絕對值明顯低于正常對照組，CD4 細(xì)胞共刺激因子的表達(dá)（CD3 CD4 CD28 ）明顯低于正常對照組。CD3-CD19 細(xì)胞（B細(xì)胞）和 CD3 CD8 CD28 細(xì)胞與正常對照組相比無顯著差異(P0.05)。早期活化T細(xì)胞（CD3 CD69 細(xì)胞）和晚期活化T細(xì)胞（CD3 HLA-DR 細(xì)胞）的絕對值與正常對照組相比無顯著差異(P0.05)。 討論 目前，國內(nèi)外對MDS免疫功能的研究報(bào)道大多數(shù)為T淋巴細(xì)胞亞群變化的研究，而對細(xì)胞的功能狀態(tài)的研究報(bào)道較少見。靜止的T細(xì)胞只有通過內(nèi)源性或外源性激活物刺激激活后才能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和造血調(diào)控作用。

16、我們對MDS患者外周血淋巴細(xì)胞亞群的檢測觀察到CD3 細(xì)胞的百分率數(shù)較正常對照組減少，但CD3 細(xì)胞、T輔助細(xì)胞（CD3 CD4 CD8-細(xì)胞）和T細(xì)胞毒性/抑制細(xì)胞（CD3 CD4-CD8 細(xì)胞）數(shù)量無明顯改變。我們對MDS病人進(jìn)一步分組后發(fā)現(xiàn)，高危組病人CD3 細(xì)胞的總數(shù)和T輔助細(xì)胞（CD3 CD4 CD8-細(xì)胞）數(shù)量均低于正常對照組，而低危組病人則與正常對照組無明顯差異，這一結(jié)果提示MDS患者T淋巴細(xì)胞絕對數(shù)值的變化可能是MDS惡性轉(zhuǎn)化的前兆。有文獻(xiàn)報(bào)道，MDS病人存在NK細(xì)胞功能的異常，主要表現(xiàn)為NKT細(xì)胞功能的活化2，而本研究發(fā)現(xiàn)高危組病人NK細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，而低危組病人的NK細(xì)

17、胞數(shù)量無明顯異常。此外，低危組病人B細(xì)胞的數(shù)量是明顯低于正常對照組，而高危組病人中無明顯差異，這提示低危組病人可能存在有體液免疫的異常。CD28是T細(xì)胞的表面標(biāo)記物之一，CD28與它的配體（抗原呈遞細(xì)胞上的B7）相結(jié)合使T細(xì)胞活化，一旦T細(xì)胞表面不表達(dá)CD28，則T細(xì)胞將處于無能狀態(tài)3，4。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高危組病人的CD4陽性細(xì)胞CD28的表達(dá)明顯減少，提示此組病人可能存在有CD4表達(dá)的無能。根據(jù)表達(dá)CD45分子的不同，可將T細(xì)胞分為CD45RA 細(xì)胞（未致敏T細(xì)胞）和CD45RO 細(xì)胞（活化和記憶T細(xì)胞），MDS患者的CD4 CD45RA 細(xì)胞數(shù)下降，原因可能是在抗原刺激下轉(zhuǎn)化為CD4 C

18、D45RO 細(xì)胞5，6。CD69抗原，也叫早期激活抗原（EA-1），是由同型二聚體組成的型糖基化細(xì)胞膜蛋白，屬于C-植物凝血素家族，分子量為60 kD，在B淋巴細(xì)胞，NK細(xì)胞和激活的T細(xì)胞上均可表達(dá)，在靜止的T細(xì)胞上不表達(dá)，在絲裂原和抗原刺激激活的淋巴細(xì)胞表面表達(dá)，這是T細(xì)胞激活后最早表達(dá)的表面抗原7，8。HLA-DR屬于主要組織相容復(fù)合體MHC類分子，受體是CD4，由和兩條重鏈通過非共價鍵連接分子量分別為34 kD和29 kD，是免疫反應(yīng)中重要的參與者，在抗原呈遞和胸腺選擇中起作用，通常表達(dá)于免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。HLA-DR在炎性刺激24小時后表達(dá)升高，持續(xù)數(shù)周，MHC限制

19、性是免疫細(xì)胞間相互識別和協(xié)作的前提，是淋巴細(xì)胞激活的晚期標(biāo)志9，10。目前，國內(nèi)外對MDS淋巴細(xì)胞激活方面的研究多數(shù)是研究CD25，而對CD69和HLA-DR的研究較少見。本研究觀察到MDS低危組患者體內(nèi)的T細(xì)胞CD69和HLA-DR的表達(dá)均明顯升高，這可能是機(jī)體的免疫系統(tǒng)對MDS異?？寺≡鲋车姆磻?yīng)，此反應(yīng)為持續(xù)性的，從而使CD69和HLA-DR的表達(dá)升高。而高危組病人CD3 HLA-DR 細(xì)胞和CD3 CD69 細(xì)胞并不增高，但伴有CD3細(xì)胞數(shù)量的減少，提示隨著疾病的進(jìn)展T細(xì)胞亞群出現(xiàn)功能的異?；驒C(jī)體免疫能力下降。臨床上，對早期的病人，尤其是RA病人，由于T細(xì)胞處于激活狀態(tài)，故使用一些免疫抑

20、制劑（如環(huán)孢菌素，ATG等）可能對其有效，此實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為免疫抑制劑的臨床使用提供了理論的依據(jù)。而對于高危期MDS病人由于T細(xì)胞的活化功能在疾病的發(fā)病中已經(jīng)不起主要作用，表現(xiàn)為T細(xì)胞亞群功能的異常，所以用免疫抑制劑對此類病人可能無效，需要采取更積極的治療措施（如化療或骨髓移植等）來防止疾病向白血病轉(zhuǎn)化。綜上所述，T細(xì)胞亞群及活化功能的研究對判斷疾病進(jìn)程，預(yù)測疾病的轉(zhuǎn)歸，指導(dǎo)臨床用藥，判斷預(yù)后具有重要的價值，是目前測定體內(nèi)免疫功能的最適指標(biāo)。 【參考文獻(xiàn)】 1 Roy-Peaud F，Paccalin M，Le-Moal G，et al. Association of systemic disea

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