幾種常見的基因測序技術(shù)的優(yōu)缺點及應(yīng)用

1、幾種常見的基因測序技術(shù)的優(yōu)缺點及應(yīng)用 發(fā)布時間 :2014-07-19來源 :畢業(yè)論文網(wǎng)隨著人類基因組計劃的完成，人類對自身遺傳信息的了解和掌握有了前所未有的進步。 與此同時， 分子水平的基因檢測技術(shù)平臺不斷發(fā)展和完善， 使得基因檢測技術(shù)得到了迅猛發(fā) 展，基因檢測效率不斷提高。從最初第一代以 Sanger 測序為代表的直接檢測技術(shù)和以連鎖 分析為代表的間接測序技術(shù)，到 2005 年，以 Illumina 公司的 Solexa 技術(shù)和 ABI 公司的 SOLiD 技術(shù)為標志的新一代測 序 (next-generation sequencing ， NGS) 的 相 繼 出現(xiàn)，測序 效率明顯提升，

2、 時間明顯縮短， 費用明顯降低，基因檢測手段有了革命性的變化。 其技術(shù)正 向著大規(guī)模、 工業(yè)化的方向發(fā)展， 極大地提高了基因檢測的檢出率， 并擴展了疾病在基因水 平的研究范圍。2009年3月，約翰霍普金斯大學的研究人員在Science雜志上發(fā)表了通過NGS外顯子測序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了一個新的遺傳性胰腺癌的致病基因PALB2標志著NGS測序技術(shù)成功應(yīng)用于致病基因的鑒定研究。同年，Nature發(fā)表了采用 NGS技術(shù)發(fā)現(xiàn)罕見弗里曼謝爾登綜合征 MYH3致病基因突變和Nat Genet發(fā)表了遺傳疾病米勒綜合征致病 基因。此后，通過 NGS 技術(shù)，與遺傳相關(guān)的致病基因不斷被發(fā)現(xiàn)， NGS 技術(shù)已成為里程碑 式

3、的進步。2010年，Science雜志將這一技術(shù)評選為當年"十大科學進展”。近兩年，基因檢測成為臨床診斷和科學研究的熱點， 得到了突飛猛進和日新月異的發(fā)展， 越來越多的臨床和科研成果不斷涌現(xiàn)出來。 同時，基因檢測已經(jīng)從單一的遺傳疾病專業(yè)范疇 擴展到復雜疾病和個體化應(yīng)用更加廣闊的領(lǐng)域， 其臨床檢測范圍包括高危疾病的新生兒篩查、 遺傳疾病的診斷和基因攜帶的檢測以及基因藥物檢測用于指導個體化用藥劑量、選擇和藥物反應(yīng)等諸多方面的研究。 目前， 基因檢測在臨床診斷和醫(yī)學研究的應(yīng)用正越來越受到醫(yī)生的 普遍重視和引起研究人員的極大的興趣。本文介紹了幾種 DNA 水平基因檢測常見的方法， 比較其優(yōu)缺

4、點和在臨床診斷和科學研 究中的應(yīng)用， 對指導研究生和臨床醫(yī)生課外學習， 推進臨床科研工作和提升科研教學水平有 著指導意義。1 、第一代測序1.1 Sanger 測序 采用的是直接測序法。 1977年， Frederick Sanger 等發(fā)明了雙脫氧鏈 末端終止法， 這一技術(shù)隨后成為最為常用的基因測序技術(shù)。 2001 年， Allan Maxam 和 Walter Gibert 發(fā) 明了 Sanger 測序法，并在此后的 10 年里成為基因檢測的金標準。其基本原理 即雙脫氧核苷三磷酸 (dideoxyribonucleoside triphosphate ， ddNTP) 缺乏 PCR 延伸所

5、需的 3'-OH,因此每當 DNA鏈加入分子ddNTP，延伸便終止。每一次DNA測序是由4個獨立的反應(yīng)組成，將模板、引物和 4 種含有不同的放射性同位素標記的核苷酸的 ddNTP 分別 與 DNA 聚合酶混合形成長短不一的片段，大量起始點相同、終止點不同的DNA 片段存在于反應(yīng)體系中，具有單個堿基差別的 DNA 序列可以被聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離出來， 得到放射性同位素自顯影條帶。依據(jù)電泳條帶讀取 DNA 雙鏈的堿基序列。人類基因組的測序正是基于該技術(shù)完成的。 Sanger 測序這種直接測序方法具有高度的 準確性和簡單、 快捷等特點。 目前， 依然對于一些臨床上小樣本遺傳疾病基因的鑒

6、定具有很 高的實用價值。 例如， 臨床上采用 Sanger 直接測序 FGFR 2 基因證實單基因Apert 綜合征和直接測序 TCOF1 基因可以檢出多達 90% 的與 Treacher Collins 綜合征相關(guān)的突變。 值得 注意的是， Sanger 測序是針對已知致病基因的突變位點設(shè)計引物， 進行 PCR 直接擴增測序。不必將該點所在基因的全部外顯子都單個突變點的擴增包括該位點在內(nèi)的外顯子片段即可， 擴增。因此， 應(yīng)明確定位要擴增的位點所在的基因外顯子和該點的具體位置，設(shè)計包括該點在內(nèi)的上下游 150 200 bp 的外顯子片段引物。此外，盡管有 NGS 的出現(xiàn)，但 Sanger 測序

7、 對于有致病基因位點明確并且數(shù)量有限的單基因遺傳疾病的致病基因的檢測是非常經(jīng)濟和 高效的。 到目前為止， Sanger 測序仍然是作為基因檢測的金標準， 也是 NGS 基因檢測后進 行家系內(nèi)和正常對照組驗證的主要手段。值得注意的是， Sanger 測序目的是尋找與疾病有關(guān)的特定的基因突變。對于沒有明確 候選基因或候選基因數(shù)量較多的大樣本病例篩查是難以完成的， 此類測序研究還要依靠具有 高通量測序能力的 NGS雖然San ger測序具有高度的分析準確性，但其準確性還取決于測序儀器以及測序條件的設(shè)定。另外， Sanger 測序不能檢測出大片段缺失或拷貝數(shù)變異等基 因突變的類型，因此對于一些與此相關(guān)

8、的遺傳性疾病還不能做出基因?qū)W診斷。1.2 連鎖分析 采用的是間接測序法。在 NGS 出現(xiàn)之前，國際通用的疾病基因定位克 隆策略是建立在大規(guī)模全基因掃描和連鎖分析基礎(chǔ)上的位置候選基因克隆。人類的染色體成對出現(xiàn)，一條來自父親， 一條來自母親， 每一對染色體在同樣的位置上擁有相同的基因，但 是其序列并不完全相同， 被稱為父系和母系等位基因。 遺傳標記是指在人群中表現(xiàn)出多態(tài)現(xiàn) 象的 DNA 序列， 可追蹤染色體、 染色體某一節(jié)段或某個基因座在家系中傳遞的任何一種遺 傳特性。它存在于每一個人，但大小和序列有差別，具有可遺傳性和可識別性。目前采用第 二代遺傳標記， 即重復序列多態(tài)性， 特別是短串聯(lián)重復序列

9、， 又稱微衛(wèi)星標記。連鎖分析是 以連鎖這種遺傳現(xiàn)象為基礎(chǔ)， 研究致病基因與遺傳性標記之間關(guān)系的方法。 如果控制某一表 型性狀的基因附近存在遺傳標記， 那么利用某個遺傳標記與某個擬定位的基因之間是否存在 連鎖關(guān)系，以及連鎖的緊密程度就能將該基因定位到染色體某一位置上。1986 年 Morton等提出優(yōu)勢對數(shù)記分法(log odds score method，LOD),主要檢測兩基因以某一重組率連鎖時的似然性。 LOD 值為正，支持連鎖 ;LOD 值為負，則否定連鎖。通過計算家系中的微衛(wèi)星 標記與致病位點之間的 LOD 值,可以初步估算二者間的遺傳距離及連鎖程度,從而確定該 基因在染色體上的粗略位

10、置。 然后利用該區(qū)域的染色體基因圖譜, 分析定位區(qū)域內(nèi)所有基因 的功能與表達,選擇合適的候選基因進行突變檢測,最終將致病基因定位或克隆。然而, 采用連鎖分析進行基因檢測存在很大的局限性。 不但所需遺傳樣本量較大, 一般 要求提供三代及以上遺傳家系患者血樣, 而且數(shù)據(jù)量大、 處理復雜、產(chǎn)出速度較慢、定位不 夠精確 ( 一般只能定位在染色體某一區(qū)間 ),這就使得研究工作繁重和定位基因的時間周 期特別長。 目前, 連鎖分析采用的單核苷酸多肽性和短串聯(lián)重復序列還在使用,但經(jīng)典的間接測序方法, 如單鏈構(gòu)象多肽性、 變性梯度凝膠電泳和異源雙鏈分析在美國已被淘汰, 而在 發(fā)展中國家作為研究手段還在有限使用。

11、2、新一代測序 (NGS)主要包括全基因組重測序(whole-ge nomeseque ncing，WGS)、全外顯子組測 序(whole-exomesequencing， WES)禾口 目標區(qū)域測序 (Targeted regionssequencing， TRS)它 們同屬于新一代測序技術(shù)。總體而言， NGS 技術(shù)具有通量大、時間短、精確度高和信息量 豐富等優(yōu)點， 使得遺傳學者可以在短時間內(nèi)對感興趣的基因進行精確定位。 但這些不同的測序技術(shù)在測序范圍、 數(shù)據(jù)分析量以及測序費用和時間等方面又有很大差別， 方法，對于臨床診斷和科學研究將起到事半功倍的作用。如果選擇適合的DNA 雜交原理，利用目

12、標基因組區(qū)域定制的探針與基因組DNA 進行芯片雜交或溶液雜交，將目標基因區(qū)域2.1 目標區(qū)域測序 目前常用的是基因芯片技術(shù)。其測序原理是基于DNA 富集，再通過 NGS 技術(shù)進行測序。其測序過程是通過把數(shù)以萬計的 cDNA 或寡聚核 苷酸置于芯片上制成列陣， 將芯片上固定好的已知序列的核苷酸探針與溶液中含有熒光標記 的相應(yīng)核酸序列進行互補配對， 根據(jù)測序儀所顯示強熒光的位置和強度， 獲取每組點陣列信 息，再利用生物信息學算法確定目的靶核苷酸的序列組成。 測序所選定的目標區(qū)域可以是連 續(xù)的 DNA 序列， 也可以是分布在同一個染色體不同區(qū)域或不同染色體上的片段。 目標區(qū)域 測序技術(shù)， 對于以往通

13、過連鎖分析將基因突變鎖定在染色體某一片段區(qū)域內(nèi)， 但無法找出突 變是一個非常好的進一步檢測手段。 2010 年， Nicholas 等使用基因分型芯片聯(lián)合連鎖分析技術(shù)，成功發(fā)現(xiàn)頭小畸形的新基因WDR62,文章發(fā)表在NatGenet雜志。類似的研究在家族性胰腺癌中確定 8 個候選變異位點和在家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變發(fā)現(xiàn)易感基因TSPAN12?；蛐酒瑴y序技術(shù)可以將經(jīng)過連鎖分析鎖定了目標范圍或經(jīng)過全基因組篩選的特定基 因或區(qū)域進行更深一層的研究， 是解決連鎖分析無法發(fā)現(xiàn)致病基因的有效手段。 基因芯片技 術(shù)對于已知基因突變的篩查具有明顯優(yōu)勢，可以快速、全面地檢測出目標基因突變。同時， 由于目標區(qū)

14、域受到了限制， 測序范圍大幅度減少， 測序時間和費用相應(yīng)降低。但基因芯片檢測所需要的 DNA 的量要大，由于已提取的 DNA 存在降解的風險，用于基因芯片研究的血 標本最好是冰凍的全血，這樣可以使用于檢測 DNA 的量有充分保證。2.2 全外顯子組測序 (WES) 外顯子組是單個個體的基因組 DNA 上所有蛋白質(zhì)編碼序 列的總合。人類外顯子組序列約占人類全部基因組序列的1%，但大約包含 85% 的致病突變。 WES 是利用序列捕獲技術(shù)將全外顯子區(qū)域 DNA 捕捉并富集后進行高通量測序的基因 分析方法。 采用的技術(shù)平臺主要是羅氏公司的SeqCap EZ 全外顯子捕獲系統(tǒng)， Illumina 公司

15、的 Solexa 技術(shù)和 Agilent 公司的 SureSelect 外顯子靶向序列富集系統(tǒng)。 其捕獲的目標區(qū)在 34 62 M 之間，不僅包括編碼區(qū)同時也加入了部分非編碼區(qū)。 NGS 的測序過程主要包括 DNA 測序文庫的制備、錨定橋接、 PCR 擴增、單堿基延伸測序和數(shù)據(jù)分析。研究者根據(jù)測 序儀捕獲到在測序過程中摻入有不同熒光標記堿基片段， 經(jīng)計算機將熒光信號轉(zhuǎn)化成不同顏 色的測序峰圖和堿基序列。基因測序結(jié)果與 NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫、千人基因組數(shù)據(jù)庫等國際 權(quán)威數(shù)據(jù)庫比對，最終確定是否為突變基因。自 NGS 技術(shù)問世以來，利用 WES 在臨床疾病致病基因的鑒定研究中取得前所未有的 成果

16、。這些成果不僅集中在單基因遺傳疾病， 還在多基因影響的復雜疾病中獲得大量相關(guān)基 因的發(fā)現(xiàn)。 在單基因遺傳性疾病中， 如視網(wǎng)膜色素變性、 終端骨發(fā)育不良等發(fā)現(xiàn)新基因或已 知基因新突變。在一些罕見的疾病中，如Kabuki 綜合征、家族性混合型低脂血癥和脊髓小腦共濟失調(diào)癥等疾病中發(fā)現(xiàn)新的致病基因。 同時， 在小細胞肺癌、 慢性淋巴細胞性白血病等 腫瘤研究和諸如肥胖癥、腦皮質(zhì)發(fā)育不良等復雜疾病的研究中也取得豐碩成果。WES 技術(shù)在篩查范圍和檢出率等方面較其他測序技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢。例如，對于采 用 Sanger 測序和基因芯片測序不能篩查出基因的樣本，可以采用WES 來進一步基因篩查鑒定。應(yīng)用 WES

17、 技術(shù)能夠獲得較傳統(tǒng) Sanger 等方法對編碼區(qū)測序更深的覆蓋度和更準確 的數(shù)據(jù)。由于信息量的大幅度增加， WES 可以獲得更多個體的編碼區(qū)信息，因此成為檢測 致病基因和易感基因位點的有效手段。與連鎖分析定位方法比較， WES 對家系的要求并不 十分嚴格，在單基因遺傳病同一家系中有 2 3 個患者和 1 個正常人即可進行致病基因的 鑒定研究， 而不需要連續(xù)三代的遺傳家系。 由于不需要嚴格的三代以上的遺傳家系， WES 使 以前不能進行研究的家系成為可能。 不僅對于單基因遺傳病是一個很好的研究手段， 對于許 多常見病，如腫瘤、糖尿病等疾病也可進行大規(guī)模比較研究。2.3 全基因組重測序 (WGS

18、) WGS 是對已知基因組序列的物種進行不同個體的全 基因組的測序， 經(jīng)過數(shù)據(jù)分析后對序列進行拼接、 組裝并獲得基因組圖譜， 或是對不同組織 進行測序并分析體細胞突變的一種研究方法。 盡管 WES 可以快速全面地找出個體基因組上 的所有突變， 從而找到個體間的差異， 但對于外顯子以外的區(qū)域則不能有效地進行基因檢測。 對于此種情況，目前還要借助 WGS 進行全基因組檢測。但由于人類基因組過于龐大，一次 單端全基因組測序很難達到所需要的測序深度。因此， 需要重復測序或雙端測序， 由此帶來測序成本的大幅度提高和由于不能達到足夠的測序深度所導致的結(jié)果準確性的降低。 而對于 臨床疾病診斷和普通科研工作， 其高昂的檢測費用也是難以承受的。 盡管如此， 對于部分臨 床研究和WES不能解決的科研課題還需要借助WGS進行更加全面的基因檢測。3、展望NGS 的出現(xiàn)為新興的基因組技術(shù)增添了無限的活力和想象空間。特別是基因芯片 的問世和已在臨床上應(yīng)用于大樣本的疾病篩查和基因診斷中所展現(xiàn)出的活力，以及其商業(yè)化發(fā)展的模式都令人鼓舞。在眼科是單基因病最常見的學科，利用芯片技術(shù)進行Laber 病的篩查已使很多病因不清楚的視神經(jīng)萎縮得到明確診斷。 而原發(fā)性開角型青光眼是眼科最具隱 蔽性和危險性的致盲性眼病， 其致病基因或突變的鑒定研究對疾病篩查將有著非常重要的臨 床