C反應蛋白與腎小管間質纖維化關系研究

1、C反應蛋白與腎小管間質纖維化關系研究         08-11-29 10:31:00     編輯：studa20                  作者：李燦 ，金英順 ，陳瑛，梁哲宇摘要 目的 探討C反應蛋白（CRP）與慢性環(huán)孢素A（CsA）腎毒性腎小管間質纖維化的關系. 方法 給雄性Sprague-

2、Dawley大鼠皮下注射CsA4周，建立慢性CsA腎毒性動物模型.采用膠乳增強免疫比濁法、免疫比濁法以及免疫組織化學染色方法檢測對照組及慢性CsA腎毒性組大鼠血清高敏CRP（hs-CRP）、CRP及腎內CRP的水平;采用三色染色方法觀察腎小管間質纖維化程度;以直線相關分析法對CRP與腎小管間質纖維化程度間的關系進行分析. 結果 慢性CsA腎毒性組與對照組血清CRP和hs-CRP的含量水平間無顯著性差異，與腎小管間質纖維化程度無相關關系;慢性CsA毒性組大鼠腎內CRP的表達顯著高于對照組，與腎小管間質纖維化程度呈正相關（r=0.862）. 結論 慢性CsA腎毒性腎小管間質纖維化與腎內CRP的表達

3、水平密切相關，與血清CRP的含量無關. 關鍵詞  腎小管間質纖維化;C反應蛋白;大鼠    ABSTRACT:OBJECTIVE To study the relationship between C-reactive protein（CRP）and tubulointerstitial fibrosis（TIF）in a model of chronic cyclosporine（CsA）nephrotoxicity.METHODS Chronic CsA nephrotoxicity was induced in Sprague-Dawley rat

4、s by administering CsA for4weeks.Serum CRP，high sensitivity-CRP（hs-CRP），and intrarenal CRP of rats in control group and CsA treatment group were evaluated with particle-enhanced immunoturbidometric method and immunohistochemistry.TIF was measured by Masson trichrome stain.The relationship between CR

5、P and TIF was analyzed by the Pearson single-correlation coefficient.RESULTS There were no significant differences in CRP and hs-CRP levels between two groups.Moreover，there was no relationship between serum CRP and TIF，intrarenal CRP expression was markedly increased in CsA-treated rat kidneys comp

6、ared with control，and that was correlated with the TIF score（r=0.862）.CONCLUSION Intrarenal CRP level but not serum CRP is closely associated with TIF in chronic CsA nephrotoxicity.    Key words:tubulointerstitial fibrosis;C-reactive protein;rats    C反應蛋白（C-reactive pro

7、tein，CRP）是在急性炎癥病人血清中發(fā)現的急性期蛋白，它可通過補體活化、組織損傷及內皮細胞活化等途徑放大炎性反應.急性創(chuàng)傷或感染發(fā)生時，血CRP濃度急劇升高，可達到正常水平的1000余倍，病情好轉時又迅速下降至正常水平.因此，CRP不但被認為是心血管及腎臟疾病的急性相反應指標，而且監(jiān)測它還可預測相關疾病的病情嚴重程度 1 .本實驗組曾利用動物模型研究發(fā)現，長期使用CsA可導致腎臟持續(xù)性炎癥介質表達的上調及炎性細胞的浸潤，此炎癥反應與腎小管間質纖維化密切相關 24 .本研究通過檢測大鼠血CRP水平，探討了其與慢性CsA腎毒性腎小管間質纖維化間的關系.    1

8、材料與方法    1.1 動物模型的構建  取雄性Sprague-Dawley大鼠16只，體重為200220g，喂飼低鹽飼料（0.5g/L鈉鹽，Teklad Premier，Madison，WI，美國），隨機分為對照組及慢性CsA腎毒性組，每組各為8只.給對照組大鼠每日皮下注射1mL/kg橄欖油（Sigma），給慢性CsA腎毒性組大鼠每日皮下注射15mg/kg CsA（Novartis Pharma，Basel，瑞士），時間為4周.    1.2 腎功能測定  將大鼠放入代謝籠中，采血，收集24h尿液，用7150型

9、全自動生物化學分析儀測定血清肌酐（Scr）含量，用Jaffe比色法測定24h尿肌酐含量，用下列公式計算內生肌酐清除率（creatinice clearance，Ccr）: Ccr（%）=24h尿量×尿肌酐 血清肌酐 ×100    1.3 血清CRP含量的測定  采用膠乳增強免疫比濁法檢測血清hs-CRP，CRP含量 5 .由韓國天主教大學江南瑪麗醫(yī)院梁哲宇教授提供原始數據.    1.4 腎臟病理檢查  用碘酸-賴氨酸-多聚甲醛液（periodate-lysine-paraformaldehy

10、de，PLP）固定大鼠腎組織，石蠟包埋后切片，厚度為4m，脫蠟，行三色染色.腎小管間質纖維化程度判定:每張切片至少觀察20個非重疊區(qū)域，用數字顯微鏡分析儀（Olympus，日本）以每個視野為100%利用Polygon    程序計算出纖維化百分率，并計算其平均值.  1.5 免疫組織化學染色  將石蠟包埋的切片置于二甲苯脫蠟，梯度酒精中脫水，在室溫下經3g/L過氧化氫及100g/L甲醛處理30min，用PBS洗滌3次，置于微波爐中加熱5min（抗原修復），用PBS洗滌3次，室溫下滴加非免疫性血清封閉液處理20min，用PBS洗滌3次，在4條件下

11、滴加一抗（ED-1，Sigma，美國），在室溫孵育1216h，用PBS液洗滌3次，滴加二抗，繼續(xù)孵育23h，以DAB為底物顯色至顏色呈棕黃色為止;自來水流水洗滌，復染蘇木素，常規(guī)樹脂封片，用數字顯微鏡分析儀計數ED-1，CRP陽性細胞數.    1.6 統(tǒng)計學處理  計量資料用均數±標準偏差表示（x±SD），兩樣本均數間比較采用t檢驗.CRP含量與腎小管間質纖維化程度的關系的分析用直線相關分析，采用SPSS12.0軟件進行.    2 結果    慢性CsA腎毒性組大鼠腎功能

12、明顯降低，表現為Scr為（109.3±11.7）mol/L，與對照組大鼠的（57.1±1.9）mol/L相比明顯上升，Ccr為（1.5±0.2）mLmin -1 kg -1 ，與對照組大鼠的（5.1±0.6）mLmin -1 kg -1 相比明顯下降，兩組Scr，Ccr值間均有顯著性差異（P<0.01）.慢性CsA腎毒性組大鼠腎組織腎小管間質纖維化百分率為36%±3%，而對照組大鼠則無腎小管間質纖維化（圖1）;慢性CsA腎毒性組大鼠腎小管間質內可觀察到大量的ED-1陽性細胞浸潤（54個±9個），與對照組（11個±1個）

13、比較有顯著性差異（P<0.01，圖2）;對照組及慢性CsA腎毒性組大鼠血清CRP含量分別為（21.6±1.14），（21.6±1.13）mg/L，Hs-CRP含量分別為（2.4±0.09），（2.5±0.19）mg/L，兩組間無顯著性差異（P>0.05）;免疫組織化學染色結果表明，慢性CsA腎毒性組大鼠腎內CRP表達及免疫活性明顯增強，CRP陽性細胞數為（62±6）個，集中于受損區(qū)域的腎小管上皮細胞，對照組為（24±2）個，兩組間有顯著性差異（P<0.01，圖3）.直線相關分析結果表明，血清CRP，hs-CRP含量與

14、腎小管間質纖維化程度無相關關系（r=0.054，P=0.844;r=0.027，P=0.919），而腎內CRP陽性細胞數與腎小管間質纖維化程度有較強的正相關關系（r=0.862，P<0.001）.  圖1 三色染色所示對照組及慢性CsA腎毒性組大鼠腎小管間質纖維化 ×100  圖2 免疫組織化學染色所示對照組及慢性CsA腎毒  性組大鼠腎小管間質炎性細胞浸潤 ×400  圖3 免疫組織化學染色所示對照組及慢性CsA腎毒性組大鼠腎內CRP的表達 ×100     3 討論