新型抗ErbB2、抗CD16三價(jià)雙特異性抗體的構(gòu)建及功能鑒定

1、新型抗ErbB2、抗CD16三價(jià)雙特異性抗體的構(gòu)建及功能鑒定It is right to put everything in its proper use.作者：陸寒，解志剛，王明麗，施明，胡美茹，于鳴，馬遠(yuǎn)方，沈倍奮，郭寧【摘要】目的構(gòu)建一種新型三價(jià)抗ErbB2、抗CD16BsAb。方法構(gòu)建重組載體pET22b(+)/BsAb；轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得重組蛋白的表達(dá)，通過包涵體復(fù)性純化蛋白。應(yīng)用懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)擴(kuò)增穩(wěn)定表達(dá)抗人CD16scFv-Fc融合蛋白的CHO細(xì)胞株(CG5細(xì)胞)和穩(wěn)定表達(dá)抗人ErbB2scFv-Fc融合蛋白的CHO細(xì)胞株(HG2細(xì)胞)，通過rProteinASe

2、pharoseFastFlow親和層析柱純化融合蛋白，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析BsAb的結(jié)合能力。結(jié)果該BsAb可在大腸桿菌BL21(DE3)中以包涵體形式高效表達(dá)，通過對(duì)重組蛋白的復(fù)性可獲得高純度的蛋白；復(fù)性后的BsAb具有與其親本抗體相似性的結(jié)合靶抗原的能力()。結(jié)論新型三價(jià)抗ErbB2、抗CD16BsAb能與高表達(dá)ErbB2的乳腺癌細(xì)胞系SKBR3細(xì)胞高親和力結(jié)合和表達(dá)CD16的人外周血單個(gè)核細(xì)胞低親和力結(jié)合?！娟P(guān)鍵詞】雙特異性抗體ErbB2CD16腫瘤免疫治療ABSTRACT:ObjectiveToconstructanoveltrivalentanti-ErbB2/CD16bispecif

3、icantibody.MethodsTherecombinantplasmidpET22b(+)/BsAbwasconstructed.TherecombinantproteinwasexpressedinE.coliBL21strain(DE3)andpurifiedbyrefolding.ByusingSpinnerSystem,CG5cells,CHOcellsstablyexpressinganti-CD16scFv-FcfusionproteinandHG2cells,CHOcellsstablyexpressinganti-ErbB2scFv-Fcfusionproteinwere

4、expanded.ThefusionproteinswerepurifiedoverrProteinASepharoseFastFlowColumn.ThebindingactivityoftheBsAbwasanalyzedbyflowcytometry.ResultsTheBsAbwasefficientlyexpressedinE.coliBL21strain(DE3)asinclusionbodies.Highpurityofrecombinantproteincouldbeobtainedbyrefolding.TheBsAbpossessedthecapabilityofbindi

5、ngtothetargetantigensasitsparentalantibodies.ConclusionThenovelBsAbwasabletobindhumanbreastcancercelllineSK-BR-3highlyexpressingErbB2andhumanperipheralbloodmononuclearcellsexpressingCD16.Deeds are fruits; words are but leaves. KEYWORDS:bispecificantibody;ErbB2;CD16;tumorimmunotherapy治療性抗體主要通過介導(dǎo)抗體依賴的

6、細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(antibody-dependentcellularcytotoxicity,ADCC)和補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(complementdependentcytotoxicity,CDC)等機(jī)制實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷1-2。目前已有多種抗體被批準(zhǔn)用于腫瘤的臨床治療。然而，抗體的天然效應(yīng)功能很弱，生理?xiàng)l件下血清中存在的高濃度IgG可與治療性抗體競(jìng)爭結(jié)合效應(yīng)細(xì)胞表面的Fc受體(Fcreceptor,FcR)，從而影響了抗體的功能。因此，提高抗體的效應(yīng)功能一直是抗體工程領(lǐng)域的重要發(fā)展方向1-3。雙特異性抗體(bispecificantibody,BsAb)是一類具有雙親嗜性的組合抗體，具

7、有結(jié)合兩種不同特異性抗原的功能。BsAb可同時(shí)與腫瘤細(xì)胞表面的腫瘤相關(guān)抗原和效應(yīng)細(xì)胞表面的觸發(fā)分子結(jié)合，從而直接介導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷(醫(yī)藥學(xué)/臨床醫(yī)學(xué)論文 )。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，BsAb可介導(dǎo)更強(qiáng)的抗腫瘤活性。然而，對(duì)10余種不同的BsAb的臨床實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，BsAb雖然表現(xiàn)出一定的療效，但明顯的毒副反應(yīng)影響了BsAb的治療劑量4-5。 抗體治療一般通過靜脈給藥，治療性抗體在循環(huán)中首先與效應(yīng)細(xì)胞遭遇而結(jié)合于效應(yīng)細(xì)胞。在抗體尚未到達(dá)靶部位之前，即可能引發(fā)效應(yīng)細(xì)胞廣泛活化，導(dǎo)致細(xì)胞因子釋放綜合征6-8。另一方面，抗體很大程度上可能是由效應(yīng)細(xì)胞攜至腫瘤局部，而并非在腫瘤靶部位招募效應(yīng)細(xì)

8、胞。這些問題給抗體研發(fā)工作者帶來了新的思考。 為了使抗體能快速到達(dá)腫瘤局部，提高局部效應(yīng)細(xì)胞的密度，進(jìn)而產(chǎn)生對(duì)腫瘤細(xì)胞的有效殺傷，減少毒副作用，抗體研究者曾提出，一個(gè)理想的BsAb應(yīng)當(dāng)具有能高親和力結(jié)合腫瘤細(xì)胞及單價(jià)觸發(fā)效應(yīng)細(xì)胞的特性。我們?cè)谇捌诠ぷ髦袠?gòu)建了一個(gè)新型的三價(jià)BsAb。這個(gè)BsAb能夠與腫瘤靶抗原以雙價(jià)的單鏈抗體(singlechainFv,scFv)形式結(jié)合，而與表達(dá)CD16的效應(yīng)細(xì)胞則以單價(jià)的Fab形式結(jié)合。由于該BsAb缺乏抗體Fc區(qū)，純化效率較低，從而影響了體內(nèi)外活性研究的開展。為了克服BsAb的純化難題，我們對(duì)該抗體的表達(dá)及純化方案做了進(jìn)一步的探索，獲得了BsAb在原核細(xì)

9、胞中的高效表達(dá)，并純化得到可供體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)用的足量蛋白。通過實(shí)驗(yàn)證明，BsAb保留了良好的結(jié)合活性。1材料與方法1.1菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞IgG1重鏈第一恒定區(qū)(constantregionofheavychain,CH1)和鏈恒定區(qū)(constantregionoflightchain,CL)基因由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所童貽剛博士提供(GenBankAF027159,X95747)；鼠抗人ErbB2scFvcDNA由美國猶他大學(xué)藥學(xué)院YuLei博士提供；大腸桿菌菌株BL21(DE3)、原核表達(dá)載體pET22b(+)、穩(wěn)定表達(dá)抗人CD16scFv-Fc融合蛋白的CHO細(xì)胞株(CG5細(xì)胞)、穩(wěn)定

10、表達(dá)抗人ErbB2scFv-Fc融合蛋白的CHO細(xì)胞株(HG2細(xì)胞)、人乳腺癌細(xì)胞系SKBR3細(xì)胞(ATCCNo.HTB-30)為本室保存。1.2試劑和培養(yǎng)基Great winds blow upon high hills. 限制性內(nèi)切酶為Biolab公司產(chǎn)品；AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqDNA聚合酶、WizardPurifection質(zhì)粒提取試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；DNA片段回收試劑盒為北京鼎國生物技術(shù)公司產(chǎn)品；羊抗人IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG及人IgG購自北京中山生物技術(shù)公司；G418、TRIZOL總RNA抽提試劑、T4DNA連接酶購自GIBCOBRL公司；IPTG為S

11、igma公司產(chǎn)品；人淋巴細(xì)胞分離液為TBD公司產(chǎn)品；rProteinASepharoseFastFlow親和層析柱購于AmershamBioscience公司；SpinnerSystem為IBSIntegraBiosciences公司產(chǎn)品；無血清培養(yǎng)基HyQSFM4CHO購自HyClone公司；DMEM培養(yǎng)基為Sigma公司產(chǎn)品；RPMI1640(無酚紅)培養(yǎng)基為Hyclone公司產(chǎn)品。The farmers are the founders of civilization and prosperity. 1.3三價(jià)BsAb表達(dá)載體的構(gòu)建從分泌抗CD16單克隆抗體的B88-9細(xì)胞中提取總RNA

12、，以5-RACE策略克隆可變區(qū)基因9。根據(jù)抗CD16VL、VH、抗ErbB2scFv、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、細(xì)菌信號(hào)肽(pelB)、CH1和CL序列及pET22b(+)載體中的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物(表1)。用引物P1和P2PCR擴(kuò)增抗CD16VL片段；RBS和pelB通過引物P7、P8、P9融合于抗CD16VH的5端；以含人IgG1重鏈第一恒定區(qū)(CH1)和鏈恒定區(qū)(CL)基因的質(zhì)粒為模板，以引物P3和P4擴(kuò)增CL片段，引物P11和P12擴(kuò)增CH1片段。以質(zhì)粒pcDNA3/ErbB2scFv為模板，以引物P5和P6、P13和P14分別擴(kuò)增scFv片段，獲兩條擴(kuò)增片段，其兩側(cè)分別攜EcoR/H

13、ind及Not/Xho酶切位點(diǎn)。VL和CL、VH和CH1融合片段采用重疊延伸PCR法進(jìn)行連接。用DNA片段回收試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物，Nco、EcoR雙酶切VL-CL片段，EcoR、Hind雙酶切scFv片段，Hind、Not雙酶切RBS-PelB-VH-CH1片段，Not、Xho雙酶切scFv片段，各片段依次插入pET22b(+)載體中的相應(yīng)多克隆位點(diǎn)，重組載體命名為pET22b(+)/BsAb。重組載體經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定。表1擴(kuò)增和構(gòu)建BsAb所用引物（略）1.4三價(jià)BsAb表達(dá)載體在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá)將重組載體pET22b(+)/BsAb轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，挑

14、取單菌落接種于含100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37震蕩培養(yǎng)至A600約為0.4，加入異丙基-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-D-thiogalactopyranoside,IPTG)至終濃度分別為0.2mmol/L和0.5mmol/L，室溫下130r/min震蕩培養(yǎng)3h。每個(gè)樣品取1mL，10000g離心15min收獲細(xì)菌菌體，重懸菌體于200LPBS中，反復(fù)凍融3次后，超聲破菌(脈沖60%，45s/次10)，4下10000r/min離心15min，收集上清，通過SDS-PAGE及考馬斯亮藍(lán)染色分析。Hide ones talents in a napkin. 1.5三價(jià)BsA

15、b的純化分別用TE+0.5%(體積分?jǐn)?shù))Triton-10020mL、TE20mL、TE+8mol/L尿素10mL重懸沉淀，超聲破菌4次，沉淀完全溶解于8mol/L尿素中，經(jīng)TGE50mmol/LTris-HCl，0.5mol/LEDTA,50mmol/LNaCl，5%(體積分?jǐn)?shù))甘油，0.05mol/L氧化型谷胱甘肽，0.5mol/L還原型谷胱甘肽透析復(fù)性，通過SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色對(duì)透析后的蛋白鑒定及定量。1.6抗人ErbB2scFv-Fc及抗人CD16scFv-Fc融合蛋白的表達(dá)穩(wěn)定表達(dá)抗人ErbB2scFv-Fc融合蛋白的HG2細(xì)胞及穩(wěn)定表達(dá)抗人CD16scFv-Fc融合蛋白的

16、CG5細(xì)胞培養(yǎng)于含200mg/LG418的無血清HYQSFM4CHO(Hyclone)培養(yǎng)基中。待培養(yǎng)物體積達(dá)40mL時(shí)，采用懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)(SpinnerSystem)擴(kuò)增細(xì)胞。培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)125mL及250mL懸浮培養(yǎng)體系依次擴(kuò)增，至培養(yǎng)體積達(dá)200mL時(shí)，停止添加培養(yǎng)液。在30下繼續(xù)培養(yǎng)5-7d。離心取培養(yǎng)細(xì)胞上清，保存于4。The wise hand doth not all that the fool. 1.7抗人ErbB2scFv-Fc及抗人CD16scFv-Fc融合蛋白的純化應(yīng)用rProteinASepharoseFastFlow親和層析柱純化融合蛋白。將細(xì)胞懸液在4下3000r/m

17、in離心10min,取上清。重復(fù)離心后，收取上清。用中和緩沖液(1mol/LTris，pH8.0)將上清調(diào)至pH8.0；用10倍柱體積的起始緩沖液(0.15mol/LNaCl,0.1mol/LTris,pH7.5)平衡rProteinASepharoseFastFlow親和層析柱，平衡速度1mL/min；將調(diào)整pH值后的上清以1mL/min的速度上樣，并接取上樣流出液。用起始緩沖液洗柱以去除非特異結(jié)合抗體；用洗脫液(0.1mol/L甘氨酸)洗脫結(jié)合的融合蛋白。洗脫蛋白通過SDS-PAGE及考馬斯亮藍(lán)染色分析。1.8夾心ELISA法檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)水平Every man has his hob

18、by-horse. 羊抗人IgG(2mg/L)包被96孔板，置于濕盒內(nèi)4過夜。甩去包被液，用50g/L牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)200L/孔4封閉1h。甩去封閉液，加入系列稀釋的純化蛋白，37溫育1h。洗滌緩沖液(phosphatebufferedsalinetween20,PBST)洗板5次后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG(15000稀釋)，37溫育1h。PBST洗板5次后，鄰苯二胺(o-phenylenediamine,OPD)顯色，2mol/LH2SO4終止反應(yīng)，測(cè)定A492。1.9異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanat

19、e,FITC)標(biāo)記抗體將純化透析后的三種抗體(三價(jià)BsAb、抗人ErbB2scFv-Fc融合蛋白、抗人CD16scFv-Fc融合蛋白)經(jīng)紫外分光光度儀測(cè)定蛋白含量，用0.5mol/LNa2CO3調(diào)抗體pH值至9.0；稱取FITC，用二甲基甲酰胺溶解至濃度為10g/L，按照FITC與抗體的克分子比為51將FITC加入抗體。室溫下用磁力攪拌器避光攪拌反應(yīng)1.5-2h。4下磷酸緩沖鹽溶液(phosphatebufferedsaline,PBS)透析過夜，以除去未結(jié)合的FITC分子。次日取出透析后抗體，紫外分光光度儀檢測(cè)A280和A495，計(jì)算標(biāo)記效率。論文教育信息網(wǎng) 1.10BsAb結(jié)合活性的檢測(cè)用

20、2.5g/L胰蛋白酶消化SKBR3細(xì)胞，6000r/min離心1min收集細(xì)胞，洗滌緩沖液(PBS,20g/LBSA,1g/LNaN3,PBA)離心洗滌1次。將細(xì)胞平均分至3管，每管5105個(gè)細(xì)胞，分別與FITC標(biāo)記的BsAb、抗人ErbB2scFv-Fc及作為陰性對(duì)照的PBS混合，抗體的終濃度均為7.5mg/L。冰浴震蕩孵育30min，冷PBA離心洗滌2-3次，用10g/L多聚甲醛/PBS重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀(BectonDickinson公司)分析抗體與SKBR3細(xì)胞表面ErbB2分子的結(jié)合。取健康人外周血，按照淋巴細(xì)胞分離液操作說明分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodm

21、ononuclearcells,PBMC)，用冷PBA離心洗滌1次，每個(gè)樣品取9105個(gè)細(xì)胞分別與FITC標(biāo)記的BsAb、抗人CD16scFv-Fc及作為陰性對(duì)照的PBS冰浴振蕩孵育30min(抗體終濃度均為7.5mg/L)，冷PBA離心洗滌2-3次。用10g/L多聚甲醛/PBS重懸細(xì)胞后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析抗體與CD16分子的結(jié)合。Take a pain for a pleasure all wise men can. 2結(jié)果2.1三價(jià)BsAb的構(gòu)建Take a pain for a pleasure all wise men can. 三價(jià)BsAb是以人IgG重鏈第一恒定區(qū)(CH1)和鏈恒

22、定區(qū)(CL)作為異二聚化結(jié)構(gòu)域，在CH1的N端連接抗CD16抗體的重鏈可變區(qū)(VHCD16)，在CH1的C端連接抗ErbB2scFv(scFvErbB2)，形成VHCD16-CH1-scFvErbB2嵌合鏈；在CL的N端連接CD16抗體的輕鏈可變區(qū)(VLCD16)，在CL的C端連接scFvErbB2，形成VLCD16-CL-scFvErbB2嵌合鏈。兩條多肽鏈通過CH1和CL異二聚化則可裝配成三價(jià)BsAb。應(yīng)用設(shè)計(jì)的引物PCR擴(kuò)增各片段，結(jié)果見圖1-圖4。PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后依次插入pET22b(+)載體中的相應(yīng)多克隆位點(diǎn)，得到重組載體pET22b(+)/BsAb。構(gòu)建過程如圖5。重組載體經(jīng)酶切

23、及測(cè)序鑒定正確。2.2三價(jià)BsAb表達(dá)和純化The wise hand doth not all that the fool. 將重組載體pET22b(+)/BsAb轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果顯示，在分子量約55ku處有新增蛋白條帶，但3次超聲破菌透析后上清目的蛋白的表達(dá)量均很低，而沉淀中目的蛋白量較大，故選擇對(duì)包涵體進(jìn)行變性和復(fù)性處理。經(jīng)8mol/L尿素變性后，沉淀完全溶于8mol/L尿素內(nèi)，通過逐漸降低透析液內(nèi)尿素的濃度，使包涵體緩慢復(fù)性，獲得濃度為1g/L的目的蛋白，結(jié)果如圖6。在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，緩慢降低透析液內(nèi)尿素含量所獲得的蛋白活性較好。2

24、.3抗人ErbB2和抗人CD-16scFv-Fc融合蛋白的表達(dá)與純化我們?cè)谇捌谘芯恐袠?gòu)建了含抗ErbB2scFv-Fc及抗CD16scFv-Fc的真核表達(dá)載體。為比較三價(jià)BsAb與其不同特異性的親本抗體的結(jié)合活性，我們?cè)跇?gòu)建三價(jià)BsAb同時(shí)，還表達(dá)純化了抗人ErbB2scFv-Fc融合蛋白和抗人CD16scFv-Fc融合蛋白?？谷薊rbB2scFv-Fc及抗人CD16scFv-Fc是鼠源抗ErbB2及抗CD16單鏈抗體與人IgG1Fc段的融合蛋白，兩者均為單一多肽鏈，通過Fc段可組裝形成同源二聚體10。用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，經(jīng)G418篩選分別獲得穩(wěn)定表達(dá)抗人ErbB2scFv-Fc融合蛋白

25、的HG2細(xì)胞及穩(wěn)定表達(dá)抗人CD16scFv-Fc融合蛋白的CG5細(xì)胞，并通過逐漸降低培養(yǎng)基中血清濃度實(shí)現(xiàn)了工程細(xì)胞的懸浮馴化。應(yīng)用Spinnersystem擴(kuò)增細(xì)胞，通過夾心ELISA法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)了250mL懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中工程細(xì)胞在培養(yǎng)2、4、6、7d時(shí)培養(yǎng)上清中融合蛋白的含量(圖7、圖8)。圖7顯示，在一定時(shí)間內(nèi)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，培養(yǎng)上清中融合蛋白的含量也逐步增高，抗ErbB2sc-Fv的表達(dá)水平可達(dá)250g/L。圖8顯示，抗CD16sc-Fv的表達(dá)水平可達(dá)150g/L。但進(jìn)一步延長培養(yǎng)時(shí)間，工程細(xì)胞的表達(dá)水平不再升高，細(xì)胞活力進(jìn)一步降低。因此，我們收集培養(yǎng)第7天的上清進(jìn)行純化。Riches

26、do not always bring happiness. 應(yīng)用rProteinASepharoseFastFlow親和層析柱純化獲得融合蛋白。取5L樣品通過SDS-PAGE分析，可見兩種scFv-Fc融合蛋白的分子量約為50ku，純化蛋白濃度約為2g/L(圖9)。2.4抗體結(jié)合活性的鑒定我們用FITC對(duì)三價(jià)BsAb、抗ErbB2scFv-Fc以及抗CD16scFv-Fc融合蛋白進(jìn)行了標(biāo)記。通過以下公式計(jì)算標(biāo)記效率(F/P值)。三價(jià)BsAb、抗ErbB2scFv-Fc及抗CD16scFv-Fc融合蛋白的F/P值分別為4.81、3.54及3.2，均在理想的F/P值(3-5)之間。應(yīng)用流式細(xì)胞分

27、析，我們比較了三價(jià)BsAb及抗ErbB2scFv-Fc融合蛋白與SKBR3細(xì)胞表面ErbB2分子結(jié)合的能力。我們先前的研究已證實(shí)抗人ErbB2scFv-Fc融合蛋白為同源二聚體，異二聚化的三價(jià)BsAb具有2個(gè)ErbB2結(jié)合位點(diǎn)。我們的結(jié)果顯示，兩者結(jié)合活性無明顯差異(圖10)。CD16是NK細(xì)胞的表面標(biāo)志。由于所設(shè)計(jì)的三價(jià)BsAb以單價(jià)的Fab形式與CD16結(jié)合，其結(jié)合抗原的能力決定其是否能觸發(fā)效應(yīng)功能。為了檢測(cè)三價(jià)BsAb能否與PBMC上的CD16結(jié)合，我們將FITC標(biāo)記的三價(jià)BsAb與PBMC孵育，同時(shí)將FITC標(biāo)記的抗人CD16scFv-Fc融合蛋白亦與PBMC反應(yīng)，檢測(cè)兩者與CD16結(jié)

28、合能力的差異。結(jié)果顯示，三價(jià)BsAb能與CD16結(jié)合，但與其親本抗CD16scFv-Fc相比，結(jié)合能力稍弱(圖11)。One cannot be in two place at once. 3討論A clear conscience is a sure card. 研究證實(shí)，靶向腫瘤相關(guān)抗原的特異性抗體與觸發(fā)效應(yīng)細(xì)胞(NK細(xì)胞、LAK細(xì)胞、CTL細(xì)胞等)的抗體組成的BsAb能有效地將效應(yīng)細(xì)胞攜至腫瘤細(xì)胞周圍,激活效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用，且這種靶向殺傷作用不受主要組織相容性復(fù)合體(majorhistocompabilitycomplex,MHC)的限制。Nature is the glass r

29、eflecting truth. ErbB2是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，屬于I型生長因子受體家族成員。ErbB2在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、肺癌等多種上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤中過表達(dá)，而在正常組織中表達(dá)水平很低。因此，ErbB2是腫瘤免疫治療的理想靶分子12。CD16為IgGFc受體(FcR)，主要表達(dá)于NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、活化的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表面。IgG的Fc片段及抗CD16抗體與CD16結(jié)合均可觸發(fā)ADCC作用。因此，CD16是導(dǎo)向免疫治療的良好候選分子13。在已開展的BsAb臨床實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，BsAb可導(dǎo)致循環(huán)系統(tǒng)白細(xì)胞表面FcR廣泛交聯(lián)，導(dǎo)致大量細(xì)胞因子釋放而誘發(fā)全身毒性

30、反應(yīng)，如：發(fā)熱、惡心、嘔吐、白細(xì)胞減少、血小板減少、單核細(xì)胞減少、淋巴細(xì)胞減少等癥狀，限制了BsAb的臨床應(yīng)用。為優(yōu)化BsAb的結(jié)構(gòu)以降低其毒副作用，我們?cè)谇捌诠ぷ髦袠?gòu)建了一個(gè)新型BsAb。該BsAb的主要特點(diǎn)在于其與表達(dá)CD16的效應(yīng)細(xì)胞以單價(jià)結(jié)合，以降低在循環(huán)中與效應(yīng)細(xì)胞結(jié)合的水平，使之能直接、快速到達(dá)腫瘤部位，在局部招募效應(yīng)細(xì)胞、產(chǎn)生對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷，從而避免BsAb在引發(fā)循環(huán)中效應(yīng)細(xì)胞表面FcR廣泛交聯(lián)而導(dǎo)致毒副作用。由于前期構(gòu)建的BsAb缺乏抗體Fc區(qū)，導(dǎo)致該抗體純化困難，產(chǎn)量較低，影響了體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的開展。為方便BsAb的純化及提高產(chǎn)量，本實(shí)驗(yàn)曾試圖通過構(gòu)建His標(biāo)簽蛋白及鎳離

31、子親和層析純化可溶性重組蛋白，但由于可溶部分含量低，我們隨后放棄了該方案，決定通過包涵體復(fù)性獲得BsAb。在純化過程中，我們采用8mol/L尿素變性，然后通過逐漸降低透析液中尿素的含量對(duì)其進(jìn)行緩慢復(fù)性。結(jié)果證明，復(fù)性后此三價(jià)BsAb保留了很好的與ErbB2和CD16分子結(jié)合的活性。這個(gè)三價(jià)BsAb的成功表達(dá)、純化為后續(xù)體內(nèi)外抗腫瘤功能的研究打下了良好的基礎(chǔ)。A faithful friend is hard to find. 【參考文獻(xiàn)】1BergerM,ShankarV,VafaiA.TherapeuticapplicationsofmonoclonalantibodiesJ.AmJMedS

32、ci,2002,324(1):14-30.2CarterP.Improvingtheefficacyofantibody-basedcancertherapiesJ.NatRevCancer,2001,1(2):118-129.3ChamesP,BatyD.AntibodyengineeringanditsapplicationsintumortargetingandintracellularimmunizationJ.FEMSMicrobiolLett,2000,189(1):1-8.4ValoneFH,KaufmanPA,GuyrePM,etal.PhaseIa/IbtrialofbispecificantibodyMDX-210inpatientswithadvancedbreastorovariancancerthatoverexpressestheproto-oncogeneHER-2/neuJ.JClinOncol,1995,13:2281-2292.5WeinerLM,ClarkJI,RingDB,etal.Clinicaldevelopmentof2B1,abispecificmurinemonoclo