肝干細(xì)胞的研究進(jìn)展分享

1、真誠(chéng)為您提供優(yōu)質(zhì)參考資料，若有不當(dāng)之處，請(qǐng)指正。肝干細(xì)胞的研究進(jìn)展攀枝花學(xué)院醫(yī)學(xué)院 馬秉福 摘要：由于肝干細(xì)胞具有多源性、增殖能力強(qiáng)等特性，顯示各種難治性肝病的治療具有廣闊的前景,使得肝干細(xì)胞研究成為肝臟疾病研究的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)之一。近年來(lái)，關(guān)于肝干細(xì)胞的基礎(chǔ)研究已取得重大進(jìn)展，本文就肝干細(xì)胞來(lái)源、分化調(diào)控、細(xì)胞因子影響、分離與培養(yǎng)等方面的研究進(jìn)展作一綜述。關(guān)鍵詞：肝干細(xì)胞 來(lái)源 分化 細(xì)胞因子 分離 培養(yǎng)干細(xì)胞是指組織中最原始的具有多潛能性、自我更新的細(xì)胞， 但不同于組織中的一些前體細(xì)胞。雖然前體細(xì)胞也具有自我更新能力，但自我更新時(shí)間較為短暫。目前通常將干細(xì)胞分為三類 ：全能干細(xì)胞：如胚胎干細(xì)胞

2、可以分化形成所有的成體組織細(xì)胞， 甚至發(fā)育成完整個(gè)體。多能干細(xì)胞：具有多向分化潛能，可以分化形成除自身組織細(xì)胞外的其他組織細(xì)胞，如造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞 和肝干細(xì)胞等。專能干細(xì)胞：維持某一特定組織細(xì)胞的自我更新， 如腸上皮干細(xì)胞等。肝臟具有強(qiáng)大的再生能力，很早就有人提出肝干細(xì)胞存在假說(shuō)，近年來(lái)的研究亦證實(shí)了此假說(shuō)1。從定義上，肝干細(xì)胞應(yīng)當(dāng)具有無(wú)限增殖能力及多向分化潛能。在體內(nèi)有多種細(xì)胞符合肝干細(xì)胞的特征， 如肝臟胚胎發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)的胎肝干細(xì)胞及成肝細(xì)胞、成年肝內(nèi)存在 的兼性肝干細(xì)胞及其子代細(xì)胞卵圓細(xì)胞、特定情況下的成熟肝細(xì)胞 和造血干細(xì)胞等。此外，近來(lái)有人認(rèn)為來(lái)自胰腺的卵圓形細(xì)胞也具有 向肝

3、細(xì)胞分化的能力。 目前， 肝干細(xì)胞研究成為肝臟疾病研究的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)之一。 1 肝臟干細(xì)胞的種類 1.1 內(nèi)源性肝干細(xì)胞 肝臟內(nèi)的干細(xì)胞主要是肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞 (hepatocytes) 和膽管源性卵圓細(xì)胞(oval cel1)。近年來(lái)的大量研究推翻了早期認(rèn)為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞不能大量增殖的理論。這些研究表明2 ，成年小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞具有干細(xì)胞樣的增殖能力，在特定的體內(nèi)微環(huán)境下也可以進(jìn)行分化。這種分化能力與免疫系統(tǒng)的T h l通路相關(guān)3。 當(dāng)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞受到損傷，分裂增殖能力被完全阻抑的時(shí)候，膽管中處于休眠狀態(tài)的卵圓細(xì)胞能被活化，分裂成肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和膽管細(xì)胞，完成肝臟的結(jié)構(gòu)與功能的重建4。由于卵圓細(xì)胞與膽管細(xì)胞的形

4、態(tài)特點(diǎn)比較相似，它們是否屬同一種細(xì)胞一直具有爭(zhēng)議。直到對(duì)膽細(xì)胞進(jìn)行免疫染色并且進(jìn)行追蹤才證實(shí)卵圓細(xì)胞是一類具有干細(xì)胞特征的細(xì)胞。1.2 外源性干細(xì)胞 主要有骨髓干細(xì)胞、胚胎肝細(xì)胞和胰腺上皮細(xì)胞等，這些細(xì)胞都具有干細(xì)胞特性，在特定的體內(nèi)微環(huán)境條件下可以分化成肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。骨髓干細(xì)胞分為造血干細(xì)胞 (hematopoietic stem cells) 和骨髓間質(zhì)干細(xì)胞 (bone marrow mesenchymal stem cel1), 它們可以在特定環(huán)境下先分化成多功能祖細(xì)胞( multipotent adult progenitor cells) , 進(jìn)而分化成不同的細(xì)胞。在遺傳性高酪氨酸血

5、癥的大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，多功能祖細(xì)胞可以分化為肝細(xì)胞并能夠完全恢復(fù)肝功能，證明骨髓干細(xì)胞具有分化成肝細(xì)胞的能力。由于卵圓細(xì)胞表面能夠表達(dá)部分造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志，如 Thy-1、CD34、Sca-1等， 因此推測(cè)多功能祖細(xì)胞還可以分化成卵圓細(xì)胞，參與肝再生過(guò)程。此外還有研究表明，骨髓干細(xì)胞能夠跟肝細(xì)胞進(jìn)行融合5 。 胚胎肝臟中的成肝細(xì)胞 ( hepatoblast ) 增殖能力很強(qiáng)，并且具有雙向分化和參與肝臟損傷后重建的能力。Cantz等6利用綠色熒光蛋白標(biāo)記胚胎肝細(xì)胞并移植入小鼠肝臟后證實(shí)了這個(gè)結(jié)論。Fiegel等7研究發(fā)現(xiàn)，大鼠胚胎肝細(xì)胞也能表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志Thy-1因子，說(shuō)明胚胎肝細(xì)胞具有干細(xì)

6、胞特性。另外，研究發(fā)現(xiàn)，大鼠胰腺上皮組織細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞，表明胰腺上皮細(xì)胞可能是一種能在適當(dāng)條件下定向分化的多潛能干細(xì)胞8 。2 肝干細(xì)胞分化調(diào)控 肝干細(xì)胞向特定的細(xì)胞分化和增殖受多種因素影響， 分化調(diào)控總體上可分為細(xì)胞內(nèi)調(diào)控和細(xì)胞外調(diào)控兩方面。2.1細(xì)胞外調(diào)控機(jī)制 肝干細(xì)胞的活化及其分化發(fā)育與其所在的微環(huán)境有密切關(guān)系，在肝干細(xì)胞微環(huán)境中有許多調(diào)節(jié)干細(xì)胞分化的影響因素，這些因素參與干細(xì)胞及其分化的子細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)、基質(zhì)與基質(zhì)之間短距離或長(zhǎng)距離信號(hào)的形成和轉(zhuǎn)導(dǎo)的復(fù)雜作用9。在這些微環(huán)境中主要包括一些細(xì)胞因子和一些非肽類化學(xué)因子。細(xì)胞因子主要包括肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、表皮

7、生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、干擾素和白細(xì)胞介素等。非肽類化學(xué)因子主要是由損傷因素作用于肝臟后導(dǎo)致肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞發(fā)生損害后所釋放，主要包括乙醛、乳酸、花生四烯酸、活性氧中間產(chǎn)物和反應(yīng)性氮中間產(chǎn)物等。除細(xì)胞因子和一些化學(xué)因子對(duì)肝干細(xì)胞分化調(diào)控有明顯作用外，尚需有細(xì)胞和細(xì)胞間的接觸。如肝卵圓細(xì)胞不與肝細(xì)胞間接觸，卵圓細(xì)胞就不能獲得肝細(xì)胞表型，不能分化為肝細(xì)胞。但在卵圓細(xì)胞分化增殖時(shí)期，卵圓細(xì)胞和肝細(xì)胞的緊密連接和縫隙連接逐漸消失。隨著卵圓細(xì)胞向肝細(xì)胞方向分化發(fā)展，它與肝細(xì)胞在功能和結(jié)構(gòu)上的關(guān)系更加密切。目前認(rèn)為參與肝干細(xì)胞始動(dòng)階段調(diào)節(jié)的因子主要為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和骨形態(tài)發(fā)生蛋

8、白家族，在分化成熟階段主要為抑瘤素M、糖皮質(zhì)激素、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等，在終末分化階段主要是抑瘤素M、糖皮質(zhì)激素、 高密度培養(yǎng)和細(xì)胞外基質(zhì)10。 2.2 細(xì)胞內(nèi)調(diào)控機(jī)制 細(xì)胞內(nèi)自身調(diào)控因子的信號(hào)調(diào)控是肝干細(xì)胞分化最主要的調(diào) 控。在此調(diào)控過(guò)程中，人們所知尚有限。目前已發(fā)現(xiàn)有多種轉(zhuǎn)錄因子具有影響干細(xì)胞分化的特定功能 ，每個(gè)分化系都受特定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合物調(diào)控 ， 而每種結(jié)合物又都可在多種分化體系中表達(dá)。GATA盒、 CAAT增強(qiáng)結(jié)合蛋白、肝細(xì)胞核因子(HNF) l、4a、3a和6等轉(zhuǎn)錄因子可能在肝干細(xì)胞的分化發(fā)育中起重要作用，但對(duì)其具體調(diào)控細(xì)節(jié)所知尚少，有待進(jìn)一步研究闡明9。肝干細(xì)胞在終末分

9、化之前，有哪些因素決定其分化終止以及決定細(xì)胞分裂次數(shù)? 近來(lái)研究顯示，在干細(xì)胞內(nèi)可能存在一些生物鐘，對(duì)細(xì)胞的分裂和分化進(jìn) 行調(diào)控。另一個(gè)因素可能是細(xì)胞內(nèi)的端粒和端粒酶。端粒是真核細(xì)胞染色體 末 端的氨基酸連續(xù)重復(fù)序列，端粒結(jié)構(gòu)對(duì)保持染色體的穩(wěn)定 十分重要，正常細(xì)胞每分裂一次，端?？s短50200bp，若干次分裂后，端粒幾乎不復(fù)存在，細(xì)胞也隨之衰老、死亡。正常細(xì)胞分裂復(fù)制時(shí)，端粒的復(fù)制由D NA聚合酶完成，由于DNA復(fù)制的不完全性，使得端粒丟失，端粒長(zhǎng)度隨細(xì)胞分裂進(jìn)行性縮短，因此，正常細(xì)胞的分裂次數(shù)是有限的。端粒長(zhǎng)度可視為細(xì)胞有絲分裂的“記數(shù)器”。隨著細(xì)胞端粒的進(jìn)行性丟失，端粒即失去其對(duì)染色體的保

10、護(hù)作用，細(xì)胞染色體變得不穩(wěn)定，隨后細(xì)胞退出細(xì)胞周期，停止增殖，進(jìn)一步老化、死亡。端粒酶是一種核糖核蛋白酶，它能通過(guò)反轉(zhuǎn)錄過(guò)程 合成端粒片段并使其連接于染色體的端粒末端，從而維持染色體端粒長(zhǎng)度，使細(xì)胞分裂后不縮短或縮短緩慢，使細(xì)胞衰老延緩，甚至達(dá)到“永生化”11。 3 以肝干細(xì)胞為靶點(diǎn)參與肝再生的細(xì)胞因子 3.1 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatic growth factor ，HGF ) 是目前已知的對(duì)成熟肝細(xì)胞刺激最為強(qiáng)烈的增殖刺激因子和促有絲分裂原，它可能通過(guò)刺激肝細(xì)胞活化絲裂原而促進(jìn)肝細(xì)胞DNA的合成12。除了直接作用于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞外，HGF還能通過(guò)旁分泌效應(yīng)作用于具有HG受體表

11、達(dá)的多種干細(xì)胞而促進(jìn)其向肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。 3.2 干細(xì)胞因子 干細(xì)胞因子( stem cell factor，SCF ) 啟動(dòng)骨髓細(xì)胞的增殖與成熟的作用早已為人們所熟知。最近研究顯示，SCF也可以參與肝再生。在小鼠肝再生模型中發(fā)現(xiàn)，SCF呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，而用SCF基因敲除小鼠建立的肝再生模型則顯示，SCF基因敲除小鼠肝再生的速度明顯比正常小鼠肝再生速度慢。表明SCF能夠參與肝再生，并且可能對(duì)肝細(xì)胞分裂起促進(jìn)作用。 3.3 粒細(xì)胞集落刺激因子粒細(xì)胞集落刺激因子( granulocyte colony-stimula-ting factor，G -CSF ) 是骨髓造血細(xì)胞增殖因子的一種，具有刺激粒

12、系母細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)成熟粒細(xì)胞功能的作用。近期研究結(jié)果表明，G - CS F可以通過(guò)動(dòng)員自體骨髓干細(xì)胞能夠促進(jìn)部分肝移植物的再生并且 減少肝臟損傷12。 3.4 肝刺激因子 肝刺激因子( hepatic stimulator substance，HSS)是一種細(xì)胞生長(zhǎng)啟動(dòng)子，它本身并不表現(xiàn)出促細(xì)胞的特性，但可以提高如HGF等的促進(jìn)肝細(xì)胞增長(zhǎng)用，并且降低肝細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子的抑制效應(yīng)13。除此之外，還有許多細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子化生長(zhǎng)因子、胰島素、干擾素(IFN)等對(duì)肝再生一定作用。 4 肝干細(xì)胞定位、分離、培養(yǎng)和鑒定有關(guān)肝干細(xì)胞在肝臟中的定位現(xiàn)有兩種觀點(diǎn)，主流觀點(diǎn)認(rèn)為肝干細(xì)胞定位于Heri

13、ng管，即肝內(nèi)膽管的最小分支處，位于肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞之間。另一種觀點(diǎn)認(rèn)為肝干細(xì)胞位于膽管周?chē)蚰懝?區(qū)，它們體積較小而且形態(tài)上難以分類，可產(chǎn)生肝祖細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞，膽管周?chē)淖婕?xì)胞也可能起源于肝外組織如骨髓9。干細(xì)胞分離和鑒定的理論基礎(chǔ)是其生物學(xué)特性，包括細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征及生物學(xué)表型，肝干細(xì)胞生物學(xué)研究也不例外。肝干細(xì)胞無(wú)特異標(biāo)記物，因此給分離和鑒定工作帶來(lái)極大困難。但目前可利用肝干細(xì)胞具有自我更新能力和多向分化潛能來(lái)分離培養(yǎng)和鑒定。Tani guchi等14采用CD45.2及TER119- AP C兩種單抗以FACS篩選BA LB/CA Jcl小鼠胎肝細(xì)胞，去除C D 4 5 T E

14、 RI 1 9 的血源細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)通過(guò)培養(yǎng) l×104 C D 4 5 TER119-的胎肝細(xì)胞可形成 ( 6 0±40)個(gè)肝克隆形成單位( hepatic colony forming units，H- CFU- Cs )，而未作F AC S者僅形成( 1 0±2.3)個(gè)H- CFU- Cs。Suzuk i等根據(jù)胚胎發(fā)育中整合素亞型隨發(fā)育階段不同在肝臟細(xì)胞的不同表達(dá)，采用單克隆抗體和熒光激活細(xì)胞篩選法 從胎齡l 3.5 d小鼠胎肝的C D 4 5 TER119-細(xì)胞中篩選出 c-kit CD49f細(xì)胞，在體外培養(yǎng)5 d后形成多于100個(gè)細(xì)胞集落H-CFU- C，

15、 其次為 CD49f CD29f細(xì)胞，約相當(dāng)于前者的13，將其植入小鼠脾臟，可分化成肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。將其植入動(dòng)物體內(nèi)不同部位后可定向分化為肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞、胰腺及腸上皮細(xì)胞等，提示今后有可能用于治療相關(guān)臟器及細(xì)胞疾病。Kubota等15利用一種稱為STO的飼養(yǎng)細(xì)胞( feeder cells)，該細(xì)胞含有p EF-H1X-MC1neo質(zhì)粒，可使E15 Fischer 344大鼠胎肝細(xì)胞發(fā)生永生化，形成細(xì)胞株，采用體外克隆形成分析及流式細(xì)胞儀鑒定成肝細(xì)胞，結(jié)果后者顯示MH C- I 及 RTI A1 陰性、OX18低表達(dá)及細(xì)胞間黏附分子 l ( ICAM- 1 ) 和整合素-1陽(yáng)性，而成年肝克隆則為

16、 RT1 A1 OX18 I C A M- l2。雖然上述各種類型細(xì)胞均被證實(shí)具有多潛能性，但其所處的發(fā)育階段以及體外微環(huán)境有很大不同。這些差異可能導(dǎo)致不同細(xì)胞在其形態(tài)、特異標(biāo)記物的表達(dá)及 分化能力上表現(xiàn)出多樣性。 5 肝干細(xì)胞移植的存在的問(wèn)題和應(yīng)用前景體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的最終目的，是構(gòu)建功能性的器官以替代宿主原有功能不全的器官，或?qū)⒁浦布?xì)胞移植到宿主體內(nèi)，通過(guò)移植細(xì)胞的不斷增殖逐漸發(fā) 揮功能。肝臟提供的良好生長(zhǎng)環(huán)境有利于移植干細(xì)胞的生長(zhǎng)，且其分泌的細(xì)胞因子更可促使肝干細(xì)胞發(fā)育為成熟的功能性肝細(xì)胞，這就是肝臟成為肝干細(xì)胞首選的移植部位的主要原因。但肝干細(xì)胞移植尚需解決的問(wèn)題有 ：移植時(shí)機(jī)的問(wèn)題，由卵

17、圓細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞獲得的肝干細(xì)胞，在其發(fā)育成熟的哪一個(gè)階段移植可以達(dá)到最佳效果尚無(wú)明確定論，在細(xì)胞分化早期移植，細(xì)胞未具備肝 干細(xì)胞重要標(biāo)志或功能；在細(xì)胞分化晚期移植，其增殖能力已大為降低，移植入肝內(nèi)則難以改善肝臟功能。移植數(shù)量的問(wèn)題，肝干細(xì)胞移植數(shù)量太少，在肝內(nèi)難以發(fā)揮作用；移植數(shù)量太大，又面臨血管阻塞等危險(xiǎn)，而適合人體肝內(nèi)移植的細(xì)胞數(shù)量尚未見(jiàn)報(bào)道，需要大量臨床前研究來(lái)摸索最適合人類肝內(nèi)移植的細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞移植后肝內(nèi)定位跟蹤的問(wèn)題，目前，最常用的體內(nèi)移植細(xì)胞示蹤劑多為熒光物質(zhì)，國(guó)外也有報(bào)道將攜帶Y染色體的肝干細(xì)胞移植到雌性動(dòng)物肝內(nèi)，通過(guò)Y染色體示蹤，上述方法存在的問(wèn)題是了解移植細(xì)

18、胞體內(nèi)定居、增殖情況時(shí)，均需取得肝臟活組織做病理切片檢查，但這就不能動(dòng)態(tài)觀察移植細(xì)胞在宿主體內(nèi)的連續(xù)性 變化，同時(shí)不適合未來(lái)臨床的應(yīng)用，活體示蹤劑可 以動(dòng)態(tài)連續(xù)的觀察移植細(xì)胞在肝內(nèi)的定居、增殖情況，成為近年來(lái)細(xì)胞移植研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題，但活體示蹤劑標(biāo)記效率不高的問(wèn)題尚未解決，所以，一種良好示蹤劑的尋找成為細(xì)胞移植必須攻克的難題。干細(xì)胞研究者認(rèn)為，隨著研究的深入和干細(xì)胞移植的不斷進(jìn)步，肝干細(xì)胞必將使許多傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)方法難治療的“絕癥”發(fā)生革命性的變化，肝干細(xì)胞移植治療肝硬化門(mén)靜脈高壓癥及肝衰竭就是其中之一。雖然應(yīng)用肝干細(xì)胞治療肝硬化門(mén)靜脈高壓癥等難治性肝病的研究尚處于初始階段，但干細(xì)胞自身的增殖、分

19、化特性和修復(fù)能力必將受到越來(lái)越多的關(guān)注，其未來(lái)的應(yīng)用前景十分廣闊。一種體外人工肝輔助裝置已經(jīng)由美國(guó)VT生物技術(shù)公司研制成功并將進(jìn)入我國(guó)臨床研究。此外，肝干細(xì)胞還可以作為基因治療的載體或靶細(xì)胞治療肝硬化、肝癌、遺傳性代謝性肝病等難治性肝病。參考文獻(xiàn)1 Thorgeirsson S S，Grisham JWOverview o f recent experimental studies on liver stemcellsSemin Liver，Dis，2003，23：303-312 2 OVERTURF K，ALDHALIMY M，OU C NSerial transplantation rev

20、 eals t he stem-cell-like regenerative potential of adult mouse hepatocytes J A m J Pathol，1997，151(5):1273-1280 3 BELINDA K， BARARA A,VANCE B M, et al. Attenuated liver progenitou (oval) cell and fibrogenic responses to the choline deficient, ethionine supplemented diet in the BALB/C inbred strain

21、of mice J.Journal of Hepatology，2007,46(1):134-141.4 NELSON F Live r regeneration and repair : Hepatocytes，progenit or cells and stem cell J . Hepatology，2004， 39(6)：1477-1486 5 HOVE W，va n HOEK B，BAJEMA I，et a1Extensive ehimerism in liver transplants vascular endothelium，bile duct epithelium， and h

22、epa tocytes J Liver Transpl ，2003,9:552-556. 6 CANTZ T， ZUCKERMAN D，BURDA M Quantitative gene exp ression analysis reveals transition of fetal liver progenitor cells to mature hepatocytes after transplantation in uP ARAG22 mice J A m J Pathol，2003，162(1):37-45 7 FIEGEL H，PARK J，LIOZNOY MCharacteriza

23、tion of cell types during rat liver development J Hepatology，2003,37(1)148-154.8 趙若輝，范健，滕皋軍大鼠肝細(xì)胞經(jīng)脾臟多次移植的實(shí)驗(yàn)研究 J 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2002,30(5)289-292 9 Strain AJ，Crosby HA，Nijjar A，et a1Human liver - derived stem cellsSemin Liver Dis2003,23：373-383. 10 Zaret KSHepatocyte differentiation：from the endoderm and beyondCurt Opin Genet Dev, 2001,11:568-574.11 Oh BKLee CH，Park C， et a1Telomerase regulation and prog ressive telomere shortening of rat hepatic stem- like epithelial cells during in vitro agingExp Cell Res， 2004,298:445-454. 12 KAIBORI M，YANA