表達腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的人多發(fā)性骨髓瘤小鼠模型的建立(1)

1、    表達腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的人多發(fā)性骨髓瘤小鼠模型的建立(1)    】 過去的研究證實腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）在體外具有促進多發(fā)性骨髓瘤（MM）細胞增殖并誘導MM血管新生的能力。本研究探討B(tài)DNF/TrkB途徑是否為治療MM的潛在靶點，并比較兩種途徑建立人MM NOD/SCID小鼠模型的優(yōu)缺點，為深入探索治療MM的新靶點奠定基礎。選擇糖尿病抵抗/重癥聯(lián)合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠，通過皮下注射或尾靜脈注射人骨髓瘤細胞株RPMI8226建立兩種異體移植動物模型。觀察荷瘤后小鼠的生長狀態(tài)，測量皮下瘤塊

2、的體積；荷瘤后3周，每周經(jīng)眼眶后靜脈叢采血，檢測血清中人源輕鏈含量、Ca2 濃度和血漿中人源BDNF濃度，并計數(shù)紅細胞；小鼠死后，采用組織學方法觀察瘤細胞的形態(tài)特征，流式細胞術檢測小鼠外周血和骨髓中人源性CD38細胞比例，采用計算機X線數(shù)字攝影觀察小鼠全身骨密度的改變和骨質(zhì)破壞情況。結果表明：皮下注射模型的成瘤率高（5/5），具有多種與漿細胞瘤相似的病理學特征，但其骨髓中未檢測到MM細胞，血清中鈣離子濃度不高，M蛋白濃度升高不明顯且未發(fā)現(xiàn)溶骨性損害的組織學和影像學證據(jù)。尾靜脈注射模型成瘤率相對較低（4/7），骨髓中可檢測到呈浸潤生長的人CD38細胞；而且在荷瘤3周后，血清中即可檢測到人源M蛋白

3、；隨著腫瘤的生長，M蛋白水平、鈣離子濃度逐漸升高，并有溶骨性損害的影像學證據(jù)。兩種模型血漿中人源BDNF的水平亦逐漸升高，9周時濃度分別為（73±11）pg/ml和（105±18）pg/ml。結論：本研究成功建立了兩種高表達BDNF的MM荷瘤NOD/SCID小鼠模型，兩種模型相互結合應用，為探索MM治療的新靶點BDNF/TrkB提供了合適的動物模型。 【關鍵詞】 多發(fā)性骨髓瘤    Establishment of Multiple Myeloma Mouse Models Expressing Brain Derived Neuro

4、trophic Factor    Abstract    Previous studies have demonstrated the effects of brainderived neurotrophic factor (BDNF) on promoting proliferation of multiple myeloma (MM) cells and inducing angiogenesis in MM in vitro. This study was aimed to further explore

5、whether BDNF/TrkB pathway is a potential therapeutic target in MM, and to elucidate the advantages and disadvantages of two ways developed for human myeloma xenograft in animal models. The models of xenograft tumors were established in the nonobese diabetic /severe combined immunodeficiency (NOD/SCI

6、D) mice by subcutaneous  or intravenous injection of human myeloma cell line RPMI8226. Mice were monitored daily for life state, and the volume of subcutaneous tumors were measured after inoculation. 3 weeks after inoculation, red blood cell counts, BDNF level in plasma, human light chain

7、and calcium level in serum of NOD/SCID were detected every two weeks. The histological and cytological examinations were performed to observe pathological features of tumors. Using flow cytometry to observe the expression of human CD38 cell in murine blood and bone marrow. The changes of bone densit

8、y and skeletal lesions were detected by computer radiography. The results showed that the subcutaneously injected animal model showed a high growth efficiency of RPMI8226 subcutaneous tumors (5/5) and several pathological features of plasmacytomas. There were neither obvious increase in light chain

9、and calcium levels, nor spread of human MM cells to murine bone marrow and no radiological evidence of skeletal lesions. The intravenously injected animal model had relative low efficiency for growth of tumors (4/7) but MM cells could engraft and proliferate in murine bone marrow. The human light ch

10、ain could be detected in serum as early as 3 weeks after inoculation. Myelomabearing mice had high level of light chain and high calcium in serum and resorption of the murine bone. Furthermore, the concentrations of BDNF were increased with the tumor growth in both models with （73±11）pg/ml and（

11、105±18）pg/ml in plasma respectively at 9 weeks after inoculation. It is concluded that two appropriate MM xenograft NOD/SCID animal models were established, both of which show high BDNF levels in the plasma. Therefore, two valuable in vivo systems to explore novel therapeutic target (BDNF/TrkB)

12、 in MM have been set up successfully.    Key words    multiple myeloma; animal model; brain derived neurotrophic factor    J Exp Hematol 2007; 15(5):967-972    表達腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的人多發(fā)性骨髓瘤小鼠模型的建立    我們的研究已經(jīng)證實，

13、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）與其高親合力的受體TrkB結合后，具有誘導多發(fā)性骨髓瘤（MM）血管新生的能力并可以在體外誘導MM細胞增殖、遷移1-5。為了進一步探索BDNF/TrkB途徑是否為治療MM的潛在靶點、拮抗BDNF/TrkB能否阻礙疾病的發(fā)展，需建立一種合適的MM動物模型。雖然我們已經(jīng)建立了一種基質(zhì)膠MM細胞裸鼠模型，但在荷瘤前需給予裸鼠射線照射以便抑制B細胞和自然殺傷（NK）細胞的免疫活性, 并且缺少對該腫瘤組織學特征的描述。    糖尿病抵抗/重癥聯(lián)合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠是免疫缺陷小鼠品系中殘留免疫較少的品系之一，它缺乏功能性的T

14、/B細胞和循環(huán)補體，并且NK細胞和巨噬細胞功能也存在缺陷6，因此常被作為許多正常和惡性人源細胞的移植載體，包括MM細胞株和MM原代細胞7,8。國內(nèi)有關MM動物模型的報道較少，多為皮下種植模型9。國外學者雖然應用NOD/SCID小鼠建立的MM模型較為成熟，但并未涉及BDNF的表達。    在本研究中，我們將高表達BDNF的人MM細胞株RPMI8226通過兩種途徑種植于NOD/SCID小鼠以建立MM動物模型，比較兩種模型的優(yōu)缺點，并檢測其體內(nèi)BDNF的表達情況，為深入探索BDNF/TrkB途徑在MM中的作用奠定基礎。   

15、60;        作者：王雅丹，胡豫，張璐，黃靖，孫春艷【摘】過去的研究證實腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）在體外具有促進多發(fā)性骨         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡上收集整理餅投稿至本站的，論文版權屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學習之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權益，請聯(lián)系我們。    材料和方法    

16、;試劑    兔抗人BDNF抗體和兔抗人CD38抗體購于Santa Cruz 生物技術公司，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG和FITC標記的羊抗兔IgG為Pierce公司產(chǎn)品。FITC標記的小鼠抗人CD38或PerCP標記的小鼠抗人CD45單克隆抗體為Becton Dickinson公司產(chǎn)品。淋巴細胞分離液、RPMI 1640培養(yǎng)液購于Gibco公司。BDNF ELISA試劑盒購于R&D公司。    細胞培養(yǎng)    人類MM細胞系RPMI 8226細胞購于中國醫(yī)學科學

17、院基礎醫(yī)學研究所，置于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37、5CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取經(jīng)臺盼藍染色鑒定細胞存活率大于95 %并處于對數(shù)生長期的細胞進行實驗。    NOD /SCID小鼠的飼養(yǎng)    4-6周齡NOD /SCID雄性小鼠20只，購自上海斯萊克實驗動物研究所，飼養(yǎng)于SPF級實驗室中。飼料經(jīng)60Co照射，飲用水及墊料均經(jīng)高壓消毒無菌處理。對小鼠的所有操作均在無菌層流條件下進行。    模型的建立   

18、60;取6-8周齡NOD /SCID 鼠，接受300 cGy 射線照射(放射源60Co 劑量率172 cGy)，照射后24小時內(nèi)將3×107個RPMI 8226細胞懸于200 l PBS溶液中，并經(jīng)過尾靜脈注射途徑輸注于NOD /SCID小鼠體內(nèi)（7只），以同體積的PBS溶液作陰性對照（4只）；或不經(jīng)過照射，左后肢皮下注射2×107個RPMI8226細胞（5只），同部位注射PBS溶液作陰性對照（4只）。每日監(jiān)測小鼠的體重、皮毛、活動情況、有無麻痹癱瘓癥狀和感染跡象等。經(jīng)皮下注射的小鼠還需測量皮下瘤塊的體積（ab2/6，a為長徑，b為短徑）。待小鼠自然死亡，生存時間以種植瘤細

19、胞當天至死亡時的天數(shù)計算。    血液學指標的測定    荷瘤3周后，每周經(jīng)眼眶后靜脈叢采血350 l ，單周時不加抗凝劑，4 000 r/min離心5分鐘，取血清于 -20儲存?zhèn)溆茫捎帽葷岱z測血清中人源輕鏈的含量和鈣離子濃度；雙周時肝素抗凝，計數(shù)紅細胞后，1 500 r/min離心5分鐘，取血漿，-20儲存?zhèn)溆?，采用ELISA法檢測血漿中BDNF濃度，剩余血細胞用于流式細胞術分析。    流式細胞術分析    取上述剩余血細胞50

20、 l，加入熒光標記的抗人CD38抗體3.5 l，4避光孵育1小時；加入紅細胞裂解液1ml，混勻，避光常溫下裂解15分鐘；1 500 r/min離心5分鐘，棄上清；用PBS 1 ml洗滌，1 000 r/min離心5分鐘，棄上清；用300 l PBS重懸，24小時內(nèi)上機檢測。皮下瘤塊取一部分切碎、研磨、用70 m細胞濾網(wǎng)過濾，制成單細胞懸液，分別與FITC標記的小鼠抗人CD38或PerCP標記的小鼠抗人CD45抗體孵育后進行流式細胞術分析。    組織學和細胞學分析    小鼠處死后，取肝、腎、脾、肺、心、皮下瘤塊、

21、一側(cè)的股骨和脛骨用4中性福爾馬林固定，10 EDTA脫鈣（僅用于骨組織），石蠟包埋，5 m切片，進行HE染色。另一側(cè)的股骨和脛骨，用注射器吸取RPMI 1640培養(yǎng)液反復沖洗骨髓腔制成細胞懸液，500 r/min離心5分鐘，制成細胞甩片，進行瑞氏姬姆薩染色和抗人CD38抗體免疫組織化學分析；或采用淋巴細胞分離液分離單個核細胞，常規(guī)免疫熒光標記，流式細胞術檢測骨髓中人源性CD38細胞的比例。        計算機X線攝影    待小鼠死后，進行計算機X線數(shù)字攝影（PHILIPS

22、 optimus 65型），觀察全身骨密度的改變和骨質(zhì)破壞情況。    統(tǒng)計分析    實驗結果以平均值±標準誤表示。組間差異分析采用Students t 檢驗，定義p值小于 0.05為具有顯著性差異。    結    果    NOD/SCID小鼠種植瘤細胞后的生存情況    皮下注射組，種植瘤細胞27天內(nèi)（14-27天），所有小鼠均可在注射局部

23、檢測到皮下腫瘤，隨后出現(xiàn)明顯的體重下降，沒有明顯的感染或癱瘓征象；荷瘤37天開始有小鼠死亡，61天后所有小鼠均死亡；瘤塊的平均體積約為410.5 mm3(239.3-632.7 mm3)。尾靜脈注射組荷瘤后22天，5只小鼠出現(xiàn)體重下降、豎毛、弓背癥狀體征；31天開始有小鼠死亡，60天時死亡5只。相應對照組小鼠存活時間均大于80天。    組織學和細胞學特征    皮下瘤塊的組織學分析顯示，腫瘤呈侵襲性生長，侵及周圍骨骼肌組織。瘤細胞具有典型的惡性漿細胞的形態(tài)特征：核形態(tài)不規(guī)則，核仁明顯，胞漿豐富，可見有絲分裂像；未

24、見壞死區(qū)和纖維結締組織浸潤。進一步的流式細胞術分析顯示，瘤細胞的表型與RPMI8226細胞相似（CD38 CD45 ）并且表達BDNF抗原（過去的研究證實RPMI8226細胞高表達BDNF3）隨后，我們應用流式細胞術檢測外周血中和骨髓中單個核細胞人源性CD38抗原的表達，結果顯示靜脈注射組4只小鼠的骨髓中檢測到人CD38 細胞，表達率為12.2-20.4（圖2B），而兩組的外周血中和皮下注射組的骨髓中均未檢測到，此結果說明在靜脈注射的小鼠骨髓中存在人源性MM細胞的生長。骨髓細胞甩片證實了這一結論，可以見到瘤細胞聚集成團，胞核偏向一側(cè)，核旁有淡然區(qū)，胞漿豐富，人CD38表達陽性。如圖2C、D。&

25、#160;   股骨骨髓形態(tài)學分析顯示，瘤細胞浸潤整個骨髓腔，骨皮質(zhì)變薄，大部分的骨小梁被破壞和吸收（圖2F）。    在小鼠的肝、脾、腎、肺和心未發(fā)現(xiàn)明顯的損害。    荷瘤小鼠X線攝影    小鼠死后進行計算機X線數(shù)字攝影，可以觀察到：皮下注射組小鼠左后肢可見瘤塊組織影，全身骨骼的密度與對照組相比無明顯差異，并且未見骨質(zhì)破壞的影像學表現(xiàn)（圖3B）；靜脈注射組4只檢測到MM細胞骨髓內(nèi)生長的小鼠中2只可疑全身骨密度降低，1只的右側(cè)股骨和左側(cè)脛骨可

26、觀察到局限性的溶骨損害：骨皮質(zhì)變薄，髓腔密度降低（圖3C）。    血液學指標的結果    荷瘤3周后隔周檢測小鼠外周血中紅細胞數(shù)量和血清中輕鏈和鈣離子濃度。對照組小鼠外周血中紅細胞計數(shù)（RBC）波動于(7.6-11.8)×1012/L之間。皮下注射組荷瘤4周，RBC為（9.4±1.1）×1012/L，隨著腫瘤的生長緩慢下降，8-9周時下降明顯，從(7.6 ±1.7)×1012/L 降至 (4.5±1.5)×1012/L。靜脈注射組RBC的降低較

27、皮下注射組更為顯著，從4周時的（7.9±1.2）×1012/L 降至9周時的（2.8±0.6）×1012/L（圖4）。    Figure 4. RBC counts of peripheral blood in NOD/SCID mice.    Control group， n=8（4-9 weeks）. Subcutaneously injected group，n=5（4 weeks）, n=4（6 weeks）, n=3（8 weeks）, n=2（9 weeks）

28、. Tail vein-injected group, n=7（4 weeks）, n=6（6 weeks）, n=5（8 weeks）, n=3（9 weeks）. *p< 0.01, compared with control group.            作者：王雅丹，胡豫，張璐，黃靖，孫春艷【摘】過去的研究證實腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）在體外具有促進多發(fā)性骨        

29、 本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡上收集整理餅投稿至本站的，論文版權屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學習之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權益，請聯(lián)系我們。    對照組小鼠血清中鈣離子濃度為2.19-2.37 mmol/L，皮下注射組血清中鈣離子濃度為2.26-2.32 mmol/L，與對照組比較差異無顯著性（p0.05）。在靜脈注射組4只檢測到MM細胞骨髓內(nèi)生長的小鼠血清中，鈣離子濃度高于對照組（p0.05），且隨時間遷移而增加，9周時為2.86±0.11 mmol/L（圖5）。  

30、60; Figure 5. Serum Ca2 concentration of NOD/SCID mice.    Control group， n=8（3-9 weeks）. Subcutaneously injected group，n=5（3 weeks）, n=5（5 weeks）, n=4（7 weeks）, n=2（9 weeks）.Tail vein-injected group, n=7（3 weeks）, n=6（5 weeks）, n=5（7 weeks）, n=3（9 weeks）. *p< 0.05, 

31、   compared with control group.    RPMI8226細胞分泌輕鏈，故我們用比濁法檢測血清中輕鏈的濃度。該檢測方法的檢測下限為40 g/ml。由圖6可見，靜脈注射組荷瘤3周時，血清中輕鏈水平為45±5 g/ml，其濃度隨著腫瘤的生長迅速增加，荷瘤9周濃度為78±4 g/ml。皮下注射組荷瘤7周、9周輕鏈濃度分別為44±6 g/ml、 50±5 g/ml；而荷瘤7周前，血清中未檢測到輕鏈，可能因為此時輕鏈的濃度低于檢測的下限。對照組血清中始終無輕鏈。

32、60;   Figure 6. Serum concentration of M protein in NOD/SCID mice. Subcutaneously injected group，n=5（3 weeks）, n=5（5 weeks）, n=4（7 weeks）, n=2（9 weeks）. Tail vein-injected group,    n=7（3 weeks）, n=6（5 weeks）, n=5（7 weeks）,n=3（9 weeks）.    *p<

33、; 0.05,compared with control group.    RPMI8226分泌BDNF，故我們用ELISA法檢測血漿中BDNF的濃度。檢測方法的檢測下限為20 pg/ml。由圖7可見，靜脈注射組荷瘤4周時，血漿中可以檢測到BDNF 濃度為54±6 pg/ml，其濃度隨著腫瘤的生長迅速增加，荷瘤9周濃度為105±18 pg/ml。皮下注射組荷瘤4周時BDNF濃度為45±12 pg/ml，9周時濃度為73±11 g/ml，明顯低于靜脈注射組（p0.05）。對照組血清中始終無輕鏈。討 

34、60;  論    MM是一種惡性漿細胞克隆性疾病，漿細胞在骨髓內(nèi)異常增殖并分泌單克隆免疫球蛋白（M蛋白），同時伴有破骨細胞的激活而導致相應的溶骨性損害。臨床上表現(xiàn)為M蛋白升高、骨髓中瘤細胞浸潤、高鈣血癥、溶骨性損害和貧血10。    本研究首先在NOD/SCID小鼠體內(nèi)建立了一種人骨髓瘤細胞株RPMI8226皮下種植的動物模型。此模型荷瘤前不需給予射線照射，骨髓瘤細胞皮下種植的成瘤率高，且腫瘤表現(xiàn)出漿細胞瘤的多種病理學特征：浸潤周圍的肌肉組織，具有惡性漿細胞的典型形態(tài)特征，并且與源細胞表型相似

35、均高表達CD38、CD45和BDNF。但MM疾病早期并非為一種實體瘤，僅在疾病的晚期部分患者可發(fā)展為髓外漿細胞瘤10；并且基礎研究和前臨床研究均表明MM細胞與宿主骨髓微環(huán)境的相互作用在MM的發(fā)病機制中發(fā)揮著主導作用11。但此皮下種植模型的骨髓中未檢測到MM細胞、血清中鈣離子濃度不高、M蛋白濃度升高不明顯且未發(fā)現(xiàn)溶骨性損害的組織學和影像學證據(jù)，因此該模型不能真實地反映MM發(fā)病的病理生理過程。    隨后，我們通過尾靜脈注射的途徑種植MM細胞。少數(shù)NOD/SCID小鼠有滲漏現(xiàn)象，即具有低水平的功能性NK細胞。因此在尾靜脈注射的模型中，荷瘤前給予低劑量的射線照

36、射，以減少對建立腫瘤模型的影響。4只小鼠骨髓中可檢測到人CD38細胞，說明靜脈注射的MM細胞通過血液循環(huán)可成功歸巢于小鼠骨髓，并呈浸潤生長。而且在荷瘤3周后，血清中即可檢測到人源M蛋白；隨著腫瘤的生長，M蛋白水平、鈣離子濃度逐漸升高，并伴進行性貧血。較之皮下注射模型，靜脈注射模型能更好地模擬MM的發(fā)生發(fā)展過程；但其操作過程較復雜，技術求較高，且成瘤率較低，評估腫瘤生長狀態(tài)的指標檢測求條件高。    值得注意的是，兩種模型血漿中均存在有人源BDNF的高表達，且與腫瘤負荷密切相關，考慮為小鼠體內(nèi)增殖的RPMI8226細胞分泌BDNF進入血液循環(huán)。此結果與我們

37、過去在MM患者體內(nèi)的發(fā)現(xiàn)相符2。且人源性BDNF與小鼠BDNF具有較高的同源性12，說明在此兩種模型的基礎上可以對BDNF/TrkB信號途徑進行深入探索。    另外，臨床上MM骨病變主表現(xiàn)為骨質(zhì)疏松和溶骨性損害，常見于顱骨、盆骨、脊柱、股骨、肱骨等處，X線檢查為其常規(guī)檢查手段13。但適用于人類的X線攝像參數(shù)不太適合于小鼠，加之小鼠骨骼的體積比人類小得多，微小的骨損害或輕度的骨質(zhì)疏松不易被發(fā)現(xiàn)，故應用X線檢測小鼠MM骨病變的敏感性較低。本研究中，4只骨髓中檢測到人CD38細胞浸潤的小鼠，在影像學檢查方面其中2只可疑全身骨密度降低，在1只的右側(cè)股骨和左側(cè)脛

38、骨可觀察到微小的溶骨性損害。因此，我們認為評價MM模型是否成功的關鍵在于骨髓中有否人MM細胞的浸潤、血中有否人M蛋白的表達和有否高鈣血癥，骨損害的影像學和貧血僅作為參考指標；而腫瘤負荷的大小則取決于骨髓中MM細胞的比例和血中M蛋白表達的高低。    綜上所述，本研究成功地建立了高表達BDNF的MM小鼠模型：尾靜脈注射模型能較真實地模擬MM發(fā)病的病理生理過程，并有可評估腫瘤負荷的指標，為探索MM治療的新靶點BDNF/TrkB途徑提供了合適的動物模型；皮下種植模型可在注射局部形成漿細胞實體瘤，該模型具有成瘤率高、操作過程較簡單、技術求較低，觀察腫瘤生長較為直

39、觀等優(yōu)點，因此可作為動物實驗研究的輔助模型?！緟⒖嘉墨I】1王雅丹，胡豫，孫春艷等. AKT/eNOS信號途徑在腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導內(nèi)皮細胞血管新生中的作用. 中華血液學雜志，2006，27: 5295332胡豫，孫春艷，王雅丹等. 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）在多發(fā)性骨髓瘤患者血漿中表達增高及意義. 中國實驗血液學雜志，2005;13: 104 -1093孫春艷，胡豫，吳濤等. 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對多發(fā)性骨髓瘤血管新生作用的研究. 中華血液學雜志，2005;26: 602-6064孫春艷，胡豫，吳濤等. 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體在多發(fā)性骨髓瘤細胞中的表達及意義. 中華內(nèi)科雜志， 2005;44: 906-9095Sun CY, Hu Y, Wang HF, et al. Brainderived neurotrophic factor induce angiogenesis through modulatio