免疫膠體金的制備及其在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用

1、免疫膠體金的制備及其在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用周友泉 綜述 (廈門第一七四醫(yī)院 361003)摘要免疫膠體金技術(shù)是四大免疫標(biāo)記技術(shù)之一，問世二十多年來發(fā)展十分迅速，在生物醫(yī)學(xué)各研究領(lǐng)域特別是在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中得到了日益廣泛的應(yīng)用。本文從膠體金技術(shù)的基本原理、制備方法、標(biāo)記技術(shù)和實(shí)際應(yīng)用等幾個(gè)方面對膠體金技術(shù)作了較系統(tǒng)介紹。1971年Faulk 和Taytor將膠體金引人免疫化學(xué)，此后免疫膠體金技術(shù)作為一種新的免疫學(xué)方法，在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。目前在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用主要是免疫層析法( immunochromatogra-phy)和快速免疫金滲濾法(D ot-immuogold filtrati

2、on assay DIGFA)，用于檢測 HBsAg 、HCG 和抗雙鏈抗體等，具有簡單、快速、準(zhǔn)確和無污染等優(yōu)點(diǎn)。免疫膠體金技術(shù)的基本原理 氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金標(biāo)記，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機(jī)理可能是膠體金顆粒表面負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)因靜電吸附而形成牢固結(jié)合。用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑、也就是不同顏色的膠體金顆粒。這種球形的粒子對蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的吸附功能，可以與葡萄球菌蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素

3、、牛血清白蛋白多肽綴合物等非共價(jià)結(jié)合，因而在基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn)中成為非常有用的工具。免疫金標(biāo)記技術(shù)(Immunogold labelling techique) 主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí)，肉眼可見紅色或粉紅色斑點(diǎn)，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測方法中，這一反應(yīng)也可以通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色。膠體金的制備方法 膠體金的制備一般采用還原法，常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。下面介紹最常用的制備方法及注意事項(xiàng)。、玻璃容器的清潔：玻璃表面少量的污染會(huì)干擾膠體金顆粒

4、的生成，一切玻璃容器應(yīng)絕對清潔，用前經(jīng)過酸洗、硅化。硅化過程一般是將玻璃容器浸泡于二氯二甲硅烷的氯仿溶液中分鐘，室溫干燥后蒸餾水沖洗，再干燥備用。專用的清潔器皿以第一次生成的膠體金穩(wěn)定其表面，棄去后以雙蒸餾水淋洗，可代替硅化處理。、試劑、水質(zhì)和環(huán)境：氯金酸極易吸潮，對金屬有強(qiáng)烈的腐蝕性，不能使用金屬藥匙，避免接觸天平稱盤。其水溶液在可穩(wěn)定數(shù)月不變。實(shí)驗(yàn)用水一般用雙蒸餾水。實(shí)驗(yàn)室中的塵粒要盡量減少，否則實(shí)驗(yàn)的結(jié)果將缺乏重復(fù)性。金顆粒容易吸附于電極上使之堵塞，故不能用pH電極測定金溶液的pH值。為了使溶液pH值不發(fā)生改變，應(yīng)選用緩沖容量足夠大的緩沖系統(tǒng)，一般采用檸檬酸磷酸鹽(pH35.8) 、Tr

5、is-HCL (pH5.88.3)和硼酸氫氧化鈉(pH8.510.3)等緩沖系統(tǒng)。但應(yīng)注意不應(yīng)使緩沖液濃度過高而使金溶膠自凝。、檸檬酸三鈉還原法制備金溶膠：取0.01氯金酸水溶液100ml 加熱至沸，攪動(dòng)下準(zhǔn)確加入檸檬酸三鈉水溶液 0.7ml，金黃色的氯金酸水溶液在分鐘內(nèi)變?yōu)樽霞t色，繼續(xù)煮沸分鐘，冷卻后以蒸餾水恢復(fù)到原體積，如此制備的金溶膠其可見光區(qū)最高吸收峰在 535nm，1cm/535=1.12。 金溶膠的光散射性與溶膠顆粒的大小密切相關(guān)，一旦顆粒大小發(fā)生變化，光散射也隨之發(fā)生變異，產(chǎn)生肉眼可見的顯著的顏色變化，這就是金溶膠用于免疫沉淀或稱免疫凝集試驗(yàn)的基礎(chǔ)。金溶膠顆粒的直徑和制備時(shí)加入的

6、檸檬酸三鈉量是密切相關(guān)的，保持其他條件恒定，僅改變加入的檸檬酸三鈉量，可制得不同顏色的金溶膠，也就是不同粒徑的金溶膠，見附表。附表   100 ml 氯金酸中檸檬酸三鈉的加入量對金溶膠粒徑的影響檸檬酸三鈉ml0.300.450.701.001.502.00金溶膠顏色藍(lán)灰、紫灰、紫紅、紅、橙紅、橙吸收峰(nm)220 240535525522 518徑粒(nm)14797.571.54124.515、檸檬酸三鈉鞣酸混合還原劑：用此混合還原劑可以得到比較滿意的金溶膠，操作方法如下：取 4ml檸檬酸三鈉 (Na3C6H5O7.2H2O)，加入05ml鞣酸，05

7、ml  25mmo/L  K2CO2（體積與鞣酸加入量相等），以雙蒸餾水補(bǔ)至溶液最終體積為20ml，加熱至60取1ml的 HAuCl4，加于79ml雙蒸餾水中，水浴加熱至60，然后迅速將上述檸檬酸鞣酸溶液加入，于此溫度下保持一定時(shí)間，待溶液顏色變成深紅色(約需0.51小時(shí))后，將溶液加熱至沸騰，保持沸騰分鐘即可。改變鞣酸的加入量，制得的膠體顆粒大小不同。、白磷還原法：在120ml雙蒸餾水中加入1.5ml氯金酸和1.4ml 0.1mol/L K2CO3，然后加入 1ml五分之一飽和度的白磷乙醚溶液，混勻后室溫放置15分鐘，在回流下煮沸直至紅褐色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色。此法制得的膠體金直徑

8、約 6nm，并有很好的均勻度，但白磷和乙醚均易燃易爆，一般實(shí)驗(yàn)室不宜采用。要得到大小更均勻的膠體金顆粒，可采用甘油或蔗糖密度梯度離心，經(jīng)分級(jí)后制得膠體金顆粒直徑的變異系數(shù)（）可小于。   免疫膠體金制備、蛋白質(zhì)的處理：由于鹽類成分能影響金溶膠對蛋白質(zhì)的吸附，并可使溶膠聚沉，故致敏前應(yīng)先對低離子強(qiáng)度的水透析。必須注意，蛋白質(zhì)溶液應(yīng)絕對澄清無細(xì)小微粒，否則應(yīng)先用微孔濾膜或超速離心除去。一般情況下應(yīng)避免磷酸根離子和硼酸根離子的存在，因?yàn)樗鼈兌伎晌接陬w粒表面而減弱膠體金對蛋白質(zhì)的吸附。、蛋白質(zhì)最適用量的選擇：將待標(biāo)記的蛋白質(zhì)儲(chǔ)存液作系列稀釋后，分別取0.1ml(含蛋白質(zhì)

9、540ug)加到 1ml膠體金溶液中，另設(shè)一管不加蛋白質(zhì)的對照管，分鐘后加入0.1ml 10NaCl溶液，混勻后靜置小時(shí)，不穩(wěn)定的金溶膠將發(fā)生聚沉，能使膠體金穩(wěn)定的最適蛋白量再加10即為最佳標(biāo)記蛋白量。、標(biāo)記：在接近并略為高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的條件下標(biāo)記是比較合適的，在此情況下蛋白質(zhì)分子在金顆粒表面的吸附量最大。下述標(biāo)記步驟最為常見：用0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl調(diào)節(jié)金溶膠至所需pH(標(biāo)記時(shí)調(diào)到pH6.0)。于100ml 金溶膠中加入最佳標(biāo)記量的蛋白質(zhì)溶液（體積為ml），攪拌分鐘。加入5mlPEG20000溶液。于10000100000g離心3060分鐘（根據(jù)粒徑大小選擇

10、不同離心條件），小心吸去上清液（切忌傾倒）。將沉淀懸浮于一定體積含0.20.5mg/ml PEG20000的緩沖液中，離心沉淀后，再用同一緩沖液恢復(fù)，濃度以 1cm/540nm=1.5左右為宜，以 0.5mg/ml疊氮鈉防腐，置4保存。包被后的金溶膠也可濃縮后于Sephadex G-200柱進(jìn)行凝膠層析分離純化，以含 0.1的緩沖溶液洗脫。通常用IgG包被的金溶膠洗脫液pH為8.2，以蛋白包被的金溶膠洗脫液為pH7.0。以上操作中應(yīng)注意，一切溶液中不應(yīng)含雜質(zhì)微粒，可用高速離心或微孔濾膜預(yù)處理。膠體金的穩(wěn)定性及免疫膠體金的貯存膠體金具有很高的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性，在穩(wěn)定因素不受破壞時(shí)自身凝聚極慢，可放置

11、數(shù)年不發(fā)生凝聚。影響穩(wěn)定的因素主要有電解質(zhì)、溶膠濃度、溫度、非電解質(zhì)等。金溶膠必須有少量電解質(zhì)作穩(wěn)定劑，但濃度不宜過高。高濃度親水性非電解質(zhì)能剝?nèi)ツz粒外面的水化膜使其凝聚。少量的高分子物質(zhì)促使溶膠凝聚，但一定量的高分子物質(zhì)反而可增加溶膠穩(wěn)定性，如蛋白質(zhì)、葡萄糖、PEG20000等的加入有良好的穩(wěn)定效果。當(dāng)金溶膠吸附蛋白質(zhì)后，溶膠的穩(wěn)定性隨溶液pH而變化，而這種變化又取決于吸附蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，如ConA，過氧化物酶等，當(dāng)pH較低時(shí)保持穩(wěn)定，提高pH則顯得不穩(wěn)定，接近等電點(diǎn)或略高時(shí)又變得穩(wěn)定了。標(biāo)記后的膠體金溶液可用0.20.5mg/ml PEG20000 作為穩(wěn)定劑。在410貯存數(shù)月有效，不宜冰

12、凍。貯存中可能會(huì)發(fā)生程度不同的凝聚，可離心除去。    免疫膠體金的應(yīng)用、膠體金在電鏡水平的應(yīng)用膠體金應(yīng)用電鏡水平的研究最早，發(fā)展最快，應(yīng)用最廣泛。其最大優(yōu)點(diǎn)是可以通過應(yīng)用不同大小的顆粒或結(jié)合酶標(biāo)進(jìn)行雙重或多重標(biāo)記。直徑為315nm 膠體金均可用作電鏡水平的標(biāo)記物。315nm 的膠體金多用于單一抗原顆粒的檢測，而直徑15nm 多用于檢測量較多的感染細(xì)胞。膠體金用于電鏡水平的研究，主要包括：細(xì)胞懸液或單層培養(yǎng)中細(xì)胞表面抗原的觀察。單層培養(yǎng)中細(xì)胞內(nèi)抗原的檢測。組織抗原的檢測。金標(biāo)記在電鏡水平的應(yīng)用，主要方法包括：包埋前染色、包埋后染色、免疫負(fù)染色、雙標(biāo)記技術(shù)和原位雜交

13、技術(shù)等。實(shí)驗(yàn)證明，該法樣本用量少、檢測速度快、對比明顯、操作簡單、敏感性和特異性高，既可用于抗原檢測，也可用于抗體檢測，因此，可同時(shí)適用于科研和診斷。、膠體金在光鏡水平的應(yīng)用膠體金同樣可用做光鏡水平的標(biāo)記物，取代傳統(tǒng)的熒光素、酶等。各種細(xì)胞涂片、切片均可應(yīng)用。主要用于：用單克窿抗體或抗血清檢測細(xì)胞懸液或培養(yǎng)的單層細(xì)胞的膜表面抗原。檢測培養(yǎng)的單層細(xì)胞胞內(nèi)抗原，組織中或亞薄切片中抗原的檢測。膠體金用于光鏡水平的研究，可以彌補(bǔ)其它標(biāo)記物不可避免的本底過高和內(nèi)部酶活性干擾等缺點(diǎn)。、膠體金在流式細(xì)胞儀中的應(yīng)用：應(yīng)用熒光素標(biāo)記的抗體，通過流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)分析細(xì)胞表面抗原，是免疫學(xué)研究中的重要技術(shù)之一。但由于

14、不同熒光素的光譜相互重疊，區(qū)分不同的標(biāo)記困難，因此必須尋找一種非熒光素標(biāo)記物，用于流式細(xì)胞計(jì)數(shù)。這樣可以同時(shí)進(jìn)行幾種標(biāo)記。該標(biāo)記物必須能夠改變散射角，膠體金可以明顯地改變紅激光散射角，因而可以作為流式細(xì)胞儀的標(biāo)記物之一。、凝集試驗(yàn)：單分散的免疫金溶膠呈清澈透明的溶液，其顏色隨溶膠顆粒大小而變化，當(dāng)與相應(yīng)抗原或抗體發(fā)生專一性反應(yīng)后出現(xiàn)凝聚，溶膠顆粒極度增大，光散射隨之發(fā)生變化，顆粒也會(huì)沉降，溶液的顏色變淡甚至變成無色，這一原理可定性或定量地應(yīng)用于免疫反應(yīng)。、免疫印跡技術(shù)(immunoblotting)：免疫印跡是一種較新的免疫化學(xué)技術(shù)。用聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白質(zhì)分離，得到的區(qū)帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素

15、膜，然后用酶免疫法（或免疫熒光、）進(jìn)行定量。免疫膠體金也可用于該法的定量。轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜與某特異性的抗體保溫后，再與經(jīng)葡萄球菌蛋白致敏的膠體金溫育，徹底洗去多余的膠體金，根據(jù)膜上膠體金顆粒顏色深淺可測知樣品中的特異性抗原。利用金顆粒可催化銀離子還原成金屬銀這一原理，采用銀顯影劑增強(qiáng)金顆粒的可見性，更可大大提高測定靈敏度，檢測下限可低至 0.1ng，這種免疫金銀染色法應(yīng)用已日趨廣泛。由于膠體金免疫印跡技術(shù)簡便、快速，且有相當(dāng)?shù)母叩撵`敏度，在臨床免疫診斷上有很大的應(yīng)用潛力。、膠體金在肉眼水平的應(yīng)用膠體金取代傳統(tǒng)三大標(biāo)記物，用于肉眼水平的免疫檢測中。除了膠體金本身具有的特點(diǎn)外，還有以下優(yōu)點(diǎn)：試

16、劑和樣本用量極小，樣本量可低至12ul；不需計(jì)數(shù)器、熒光顯微鏡、酶標(biāo)檢測儀等貴重儀器，更適于現(xiàn)場應(yīng)用；沒有諸如放射性同位素、鄰苯二胺等有害物質(zhì)參與；實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以長期保存；時(shí)間大大縮短，提高了檢測速度。 金標(biāo)過程中，無共價(jià)鍵形成，是一定離子濃度下的物理吸附。因此幾乎所有的大分子物質(zhì)都可被金標(biāo)記，標(biāo)記后大分子物質(zhì)活性不發(fā)生改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，膠體金的敏感性可達(dá)到 ELISA的水平。而結(jié)合銀染色時(shí)，檢測的敏感性更大大提高。    膠體金在免疫層析快速診斷技術(shù)中的應(yīng)用免疫層析法(immunochromatography)是近幾年來國外興起的一種快速診斷技術(shù)，其原

17、理是將特異的抗體先固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當(dāng)該干燥的硝酸纖維素一端浸入樣品（尿液或血清）后，由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著該膜向前移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至固定有抗體的區(qū)域時(shí)，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合，若用免疫膠體金或免疫酶染色可使該區(qū)域顯示一定的顏色，從而實(shí)現(xiàn)特異性的免疫診斷。早孕診斷用的免疫層析試紙條（通常又叫尿妊紙條）的裝配結(jié)構(gòu)見圖一。裝配方法：在塑料底板上分別將吸尿用玻璃纖維、凍干金標(biāo)記抗HCG玻璃纖維、已固定有抗HCG抗體的NC膜及硬質(zhì)吸水濾紙按圖裝配，配件與塑料底板的結(jié)合可用雙面膠或其它粘性材料粘接。裝配好的紙板按縱向剪切，裁成寬度為4mm的條狀，即為尿妊用紙條。本法檢測速度

18、快，一般一兩分鐘可出結(jié)果；靈敏度高，可達(dá)50IU/L；好的試紙條結(jié)果也是準(zhǔn)確可靠的，這是其所以能在尿妊診斷中得到廣泛應(yīng)用的主要原因。尿妊試紙條的快速特性來源于膠體金免疫層析法的固有特性，但與原材料選擇特別是NC膜的孔徑大小密切相關(guān)，準(zhǔn)確性取決于抗HC G的特異性。金標(biāo)尿妊紙條雖然好用，但在使用中也必須注意以下幾個(gè)方面：一是溫度，試紙條雖然可在室溫保存，但大批暫時(shí)不用的試紙條還是應(yīng)該放在保存，以免抗體失效，從冰箱剛?cè)〕龅脑嚰垪l則應(yīng)待其恢復(fù)至室溫，然后才打開密封，可避免反應(yīng)線模糊不清。二是正確操作，一般的操作方法是在試紙條的吸尿玻璃端滴入滴（約微升）尿液，或?qū)⑽蚨酥苯硬迦霕?biāo)本中，深度約毫米秒，取出后平