發(fā)育生物學(xué)講義18種子工程

1、第十八章工程和果實(shí)的發(fā)育隨著細(xì)胞學(xué)研究的發(fā)展，人們已經(jīng)可以體外操作配子體進(jìn)行融合，即試管，創(chuàng)造人工胚和胚乳。另外，通過(guò)小孢子培養(yǎng)（如油菜）可以誘導(dǎo)產(chǎn)生雙單倍體，在遺傳研究上是材料；通過(guò)子葉培養(yǎng)（如胡蘿卜）可以誘導(dǎo)產(chǎn)生體細(xì)胞胚，從而創(chuàng)造人工。 252第十八章工程和果實(shí)的發(fā)育18.1 工程18.2 果實(shí)的發(fā)育18.3 果實(shí)成熟及其調(diào)控18.1工程以玉米貯藏蛋白的調(diào)控為例，其中主要的貯藏蛋白為醇溶谷蛋白（Zeins）,由 100 多種不同的基因編碼，主要編碼 19KD 和 22KD 蛋白。這些基因之間是如何相互作用來(lái)調(diào)控貯藏蛋白的，成為研究者的目標(biāo)所在。他們?cè)谟衩字邪l(fā)現(xiàn)了一種 opaque2 突變體

2、，其純合植株 o2/o2 中,貯藏蛋白含量減少 60-80%，尤其是 22KD 蛋白急劇減少。于是推測(cè) o2 基因極可能編碼一種轉(zhuǎn)錄因子，由它調(diào)控著一批與 Zeins相關(guān)基因的活性。后有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，O2 的確是一種鋅指（zinc finger）類(lèi)的轉(zhuǎn)錄因子，可與編碼 22KD Zeins 蛋白基因的啟動(dòng)子特異結(jié)合。若 o2 發(fā)生變異，其編碼的轉(zhuǎn)錄因子的構(gòu)型發(fā)生改變，就無(wú)法與 Zeins 啟動(dòng)子結(jié)合，貯藏蛋白受阻。出乎意料的是，利用轉(zhuǎn)基因?qū)⒄５?o2 基因?qū)胪蛔凅w，仍不能使蛋白的量恢復(fù)到正常水平。這種 o2 突變的等位基因干擾正常等位基因功能的現(xiàn)象被稱(chēng)為負(fù)顯性。同樣是在玉米中，在研究的休眠與萌

3、發(fā)時(shí)發(fā)現(xiàn)，中含有 ABA，是休眠的促進(jìn)物。休眠種子是否萌發(fā)取決于 ABA 的以及對(duì) ABA 的響應(yīng)。ABA 的響應(yīng)者是 Em 基因，該基因的啟動(dòng)子上有一段 ABA 響應(yīng)元件 ABRE（ABA response element）,是與 ABA 分子的結(jié)合區(qū)域，ABRE 與一種在植物中廣泛的順式調(diào)控成分 G-box 相似（G-box 在光調(diào)控基因中亦）。除了結(jié)合 ABA 分子，ABRE 還需與 EMBP（Em-binding protein）,及另一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 VP1（viviparous,胎萌之意）結(jié)合，才能啟動(dòng) Em 基因的表達(dá)。 253第十八章工程和果實(shí)的發(fā)育Vp1 基因的編碼產(chǎn)物除了調(diào)

4、節(jié) Em 的表達(dá)，還調(diào)節(jié)花青素的。它具有多效性（Pleiotropiceffects）:調(diào)節(jié)著貯藏蛋白基因活性，花青素，胎萌，并且應(yīng)當(dāng)是級(jí)聯(lián)（cascade）調(diào)控途徑偏上游的主控因子，著一些功能基因，調(diào)控基因和轉(zhuǎn)錄因子。又例如紹的擬南芥 ABA 突變體，它在基因型上有兩種可能：ABA基因缺陷 aba-1；或是 ABA 響應(yīng)因子突變 abi3-4。其中 ABI3 是在中特異表達(dá)的，與貯藏蛋白的有關(guān)，Giraudat等(1992)培育了 35S:ABI3 擬南芥轉(zhuǎn)基因植株，用 ABA 處理其營(yíng)養(yǎng)組織，則營(yíng)養(yǎng)組織中也可以轉(zhuǎn)錄種子貯藏蛋白。另外，轉(zhuǎn)化有維生素 A金燦燦?；虻乃綠olden rice

5、 也早已問(wèn)世，其因富含維 A 而顯得18.2果實(shí)的發(fā)育果實(shí)由子房發(fā)育而來(lái)，內(nèi)含后產(chǎn)生的，果皮由子房壁發(fā)育而來(lái)。因果皮性質(zhì)不同, 果實(shí)可分為兩類(lèi): 干果和肉質(zhì)果。果實(shí)的發(fā)育通常需或類(lèi)似的刺激。以番茄為例，果實(shí)發(fā)育經(jīng)歷幾個(gè)階段：:開(kāi)花期,涉及子房發(fā)育、和座果。:胚開(kāi)始發(fā)育,果皮和胎座細(xì)胞旺盛。:胚發(fā)育成熟，果皮細(xì)胞停止,細(xì)胞擴(kuò)大體積,生長(zhǎng)素積累。 254第十八章工程和果實(shí)的發(fā)育番茄的果實(shí)大小和重量等是重要的農(nóng)藝性狀，這些性狀由許多基因。受多基因的性狀稱(chēng)為數(shù)量性狀，這些基因被稱(chēng)為數(shù)量性狀位點(diǎn)（Qutative Trait Loci）。其中，數(shù)量性狀的一個(gè)判別標(biāo)準(zhǔn)是，其性狀的度量值在一個(gè)分離群體中不符

6、合經(jīng)典的遺傳分離比例，而是呈現(xiàn)為連續(xù)分布（類(lèi)似正態(tài)分布曲線(xiàn)）。番茄果重這一性狀受到至少 28 個(gè) QTL 的，Cornell 大學(xué)的一個(gè)研究小組追蹤其中的一個(gè)位點(diǎn) fw2.2,對(duì)其進(jìn)行了精細(xì)定位，并于 2000 年克隆該基因，這也是人們?cè)谥参镏锌寺〉降牡谝粋€(gè)數(shù)量性狀的基因。首先，他們將番茄的一個(gè)栽培種與一種果實(shí)特別小的野生種雜交，并以該栽培種為親本，構(gòu)建了一個(gè)近等基因系。在近等基因系中又挑選了一個(gè)果實(shí)小的株系，與該栽培種雜交建立了一個(gè)F2 分離群體，并基于這一分離群體采用 RFLP（限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性）標(biāo)記制作遺傳連鎖圖，將決定果實(shí)大小的一個(gè)主效基因位點(diǎn)定位在了第二上兩個(gè)間距 0.13c

7、M 的標(biāo)記之間。隨后，以這個(gè)位點(diǎn)附近的 RFLP 標(biāo)記探針去與來(lái)自親本的 YAC 文庫(kù)雜交，篩出 6 個(gè) YAC 克隆，并根據(jù)這 6個(gè) YAC 克隆的末端序列拼接成物理圖譜。進(jìn)一步精細(xì)定位，通過(guò)兩個(gè)重組單株在果實(shí)大小上的顯著差異，將基因位點(diǎn)定在了兩個(gè) YAC 克隆的重疊處。以其中一個(gè) YAC 克隆YAC355 為探針去掃描來(lái)自供體親本的 cDNA 文庫(kù)，挑出了大約 100 個(gè)陽(yáng)性克隆，代表 4 個(gè)的轉(zhuǎn)錄。再以這 4 個(gè) cDNA 克隆為探針去掃描同樣是來(lái)自供體親本的粘粒（cosmid）文庫(kù)，挑出了 4 個(gè)末端不重疊的陽(yáng)性粘粒，分別對(duì)應(yīng)這四個(gè) cDNA 克隆。到此，研究者基于這 4 個(gè)陽(yáng)性粘粒構(gòu)

8、建載體，分別去轉(zhuǎn)化兩個(gè)番茄的栽培種。轉(zhuǎn)化當(dāng)代自交一代后形成該基因位點(diǎn)上的分離，并且會(huì)產(chǎn)生該位點(diǎn)純合的單株，再通過(guò)考察不同粘粒轉(zhuǎn)化后代的果實(shí)大小，確定該基因是位于粘粒 cos50 上。 255第十八章工程和果實(shí)的發(fā)育分析粘粒 cos50 的序列，發(fā)現(xiàn)其中含有兩個(gè)開(kāi)放讀碼框(ORF)和一段富含 AT 的序列。一個(gè) ORF 即是用來(lái)篩選粘?？寺〉?cDNA44，另一個(gè) ORFX 包含 663 個(gè)核苷酸，但是卻在 cDNA 文庫(kù)中找不到對(duì)應(yīng)的克隆。后研究發(fā)現(xiàn)這個(gè) ORFX 在開(kāi)花之前的花器官中表達(dá)水平很低，常規(guī)的 Norther blot 無(wú)法檢測(cè)到它的表達(dá)，利用半定量反轉(zhuǎn)錄 PCR 技術(shù)檢測(cè)到 OR

9、FX 在心皮中的表達(dá)量最高，且在果實(shí)小的植株中表達(dá)量高于果實(shí)大的植株。在用以定位該基因的近等基因系中，進(jìn)行組織學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其中果實(shí)大的株系與果實(shí)小的株系，在胎座的皮層細(xì)胞和果皮的表層細(xì)胞兩種組織中都沒(méi)有顯著的細(xì)胞大小差異，說(shuō)明該基因并非通過(guò)控制單個(gè)細(xì)胞大小來(lái)果實(shí)大小，而應(yīng)當(dāng)是通過(guò)細(xì)胞數(shù)目來(lái)調(diào)節(jié)果實(shí)大小。另外，通過(guò)在核苷酸與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比較，發(fā)現(xiàn) ORFX 編碼序列與人類(lèi)的原癌基因 RAS 有著極高的同源性，進(jìn)一步證實(shí)了 fw2.2 是通過(guò)細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)果實(shí)大小。比較由果實(shí)小的植株與由果實(shí)大的植株中分離出的 fw2.2 基因，發(fā)現(xiàn)它們?cè)?ORFX 區(qū)段只一個(gè)氨基酸的差異，且這個(gè)差異對(duì)翻譯的

10、正常起始沒(méi)有影響，故而推測(cè)由 fw2.2 引起的果實(shí)大小的差異是來(lái)源于該基因的上游調(diào)控序列的差異。由此，也為研究等位基因間變異提供了一條新思路。 256第十八章工程和果實(shí)的發(fā)育18.3果實(shí)成熟及其調(diào)控肉質(zhì)果實(shí)成熟有兩類(lèi)情況： 1）成熟時(shí)有呼吸峰出現(xiàn),伴隨乙烯的大量產(chǎn)生，如番茄、香蕉；2）成熟時(shí)無(wú)呼吸高峰,亦無(wú)乙烯的大量產(chǎn)生，如、草莓。反義基因技術(shù)(- Sense - Technique) 是近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的基因表達(dá)調(diào)控技術(shù)。它為培育耐貯性強(qiáng)的果實(shí)品種開(kāi)辟了廣闊前景。反義基因技術(shù)是將目的基因的反向序列構(gòu)建在一啟動(dòng)子后,再轉(zhuǎn)化給植物,形成轉(zhuǎn)基因個(gè)體,這種個(gè)體產(chǎn)生與該基因的mRNA 互補(bǔ)的RNA

11、 鏈,成為反義RNA ,其結(jié)果使植物中游離的（即可與核糖體結(jié)合的）相應(yīng)mRNA 水平大大降低。這種反義RNA 可專(zhuān)一抑制特定基因的表達(dá)。利用反義RNA 技術(shù)人為地生物體內(nèi)某基因的表達(dá)是植物基因工程中有巨大應(yīng)用前景的研究。果實(shí)成熟的一個(gè)明顯特征就是果實(shí)的軟化。通常認(rèn)為多聚半乳糖醛酸酶(PG) 是果實(shí)軟化的主要酶 ,PG位于植物細(xì)胞壁中的,其功能是使細(xì)胞壁中的多聚半乳糖醛酸降解為半乳糖醛酸,導(dǎo)致果實(shí)由硬變軟。PG不在葉片、根和未成熟的果實(shí)中表達(dá),只有當(dāng)其發(fā)育到綠熟期時(shí)才有PG。因此,降低PG活性應(yīng)該能夠達(dá)到延緩果實(shí)成熟的目的。番茄中PG基因的全序列已經(jīng)測(cè)定,通過(guò)基因克隆的研究,證明了編碼PG的基因

12、只有一個(gè)。利用反義RNA 技術(shù)構(gòu)建PG的反義cDNA 轉(zhuǎn)化番茄，其中PG活性和果膠的降 257第十八章工程和果實(shí)的發(fā)育解程度顯著下降,轉(zhuǎn)基因純合子后代果實(shí)中PG活性?xún)H為正常的1 % ,但是反義PG基因并未推遲軟化或減少軟化的程度,許多事實(shí)證明,PG并不是果實(shí)軟化的決定因素。對(duì)于乙烯在果實(shí)成熟過(guò)程中的作用，研究者很早就開(kāi)始了探索。例如，番茄中一個(gè)編碼乙烯受體的基因 Nr(never ripe)如果發(fā)生了突變，則果實(shí)成熟推遲，不變紅也不變軟。遺傳上，Nr 基因與ETR1(ethylene receptor)相似的基因共分離。另外，氨基酸丙烷羧化酶（ACC）這一乙烯途徑限速因子的發(fā)現(xiàn)，對(duì)于進(jìn)行人工番

13、茄果實(shí)成熟有著重要意義。將 ACC 基因的反義序列帶上組成達(dá)的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)入番茄，可以明顯的抑制番茄正常成熟，這種轉(zhuǎn)化的番茄到了成熟也變紅變軟，只有人為噴施乙烯才會(huì)使之變紅。依據(jù)這，我校的番茄課題組研制出了我國(guó)第一個(gè)商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因品種華番 1 號(hào)百日鮮（Bioscien）。近年，又在一種自然突變的番茄中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與果實(shí)成熟有關(guān)的基因 RIN，其突變體 rin（ripening-inhibitor）自發(fā)成熟，由此認(rèn)為 RIN 基因的編碼產(chǎn)物是一種果實(shí)成熟的必需因子。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化 35S:RIN 株系的分離后察發(fā)現(xiàn)：RIN/rin 雜合植株推遲變紅，而 rin/rin 純合植株則完全不變紅；轉(zhuǎn)化 35S

14、:-RIN 株系的分離后代中：仍含有反義片斷的植株推遲變紅，而丟失了反義片斷的植株則正常變紅。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，RIN 的編碼產(chǎn)物是一種 MADS-BOX 類(lèi)的轉(zhuǎn)錄因子，在果實(shí)成熟中執(zhí)行重要功能（A MADS-Box Gene Necessary for Fruit Ripening at the TomatoRipening-Inhibitor (Rin) Locus，Science, 2002）。 258第十八章工程和果實(shí)的發(fā)育Summary of Seed engineering and Fruit developmentl是植物生長(zhǎng)發(fā)育的起點(diǎn)，人工操作及改造是創(chuàng)造優(yōu)良品種的一個(gè)有效的途

15、徑。另外，人們的許多主食也是植物，如玉米，水稻等，改良品質(zhì)也就成了研究者追求的目標(biāo)。已經(jīng)有研究者通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)地內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組分含量的實(shí)例，同時(shí)也對(duì)于的成熟及內(nèi)含物的積累的機(jī)理有了更深刻的認(rèn)識(shí)。l 伴隨發(fā)育的是果實(shí)的發(fā)育。在這個(gè)研究領(lǐng)域的認(rèn)識(shí)由生理學(xué)，組織學(xué)，發(fā)展到現(xiàn)在的分子生物學(xué)，其間有許多的發(fā)現(xiàn)與。例如，番茄果實(shí)大小的一個(gè)數(shù)量性狀位點(diǎn)fw2.2已經(jīng)被克隆，從基因表達(dá)調(diào)控的水平解釋了果實(shí)發(fā)育的機(jī)理；對(duì)于該基因序列的分析還揭示了等位基因間功能效應(yīng)的差別不僅來(lái)源于編碼產(chǎn)物的差異，其上游調(diào)控序列的變異往往也是造成等位基因效應(yīng)差異的。l 果實(shí)發(fā)育到成熟階段，會(huì)發(fā)生大量的生理生化變化，使得果實(shí)變紅，變軟，產(chǎn)

16、生香味等。人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到不少基因 在指導(dǎo)著這些變化，如多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因，編碼乙烯受體的基因Nr(never ripe)，乙烯途徑限速因子氨基酸丙烷羧化酶（ACC）基因，果實(shí)成熟的一個(gè)必需因子RIN基因，等等。伴隨生物技術(shù)的發(fā)展，研究者已經(jīng)利用反義RNA技術(shù)來(lái)調(diào)節(jié)這些與果實(shí)成熟相關(guān)基因的表達(dá)，創(chuàng)造了一些能提高效益的品種。主要參考文獻(xiàn)：1.Kodrzycki,R., Boston,R.S., and Larkins,B.A. 1989. The opaque-2 mutation of maize differentially reduces zein gene transcripti

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