nk4基因重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在raji細(xì)胞中的表達(dá)

1、臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)專(zhuān)業(yè)畢業(yè)論文 精品論文 NK4基因重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在Raji細(xì)胞中的表達(dá)關(guān)鍵詞：Raji細(xì)胞 NK4基因 基因重組 重組表達(dá)載體摘要：目的: 克隆NK4基因，構(gòu)建其重組真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞，觀察NK4基因在Raji細(xì)胞的表達(dá)，為研究NK4的生物學(xué)效應(yīng)和淋巴瘤的基因治療作相關(guān)基礎(chǔ)工作。 方法: 1.NK4基因的克隆與重組克隆載體的構(gòu)建及鑒定 由新鮮人肝組織提取總RNA，行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)獲NK4基因cDNA，與載體pMD19-T Simple連接，構(gòu)建重組克隆載體pMD19-T simple-NK4。將重組克隆載體以CaCl2法轉(zhuǎn)化E.Coli

2、DH5并行氨芐青霉素和-篩選，采用菌落直接PCR、Mu和Sal雙酶切及序列分析等方法，證實(shí)目的片段的存在和序列正確。 2.重組真核表達(dá)載體pVITRO2-mcs-NK4的構(gòu)建與鑒定 將轉(zhuǎn)化重組克隆載體pMD19-T Simple-NK4的E.Coli DH5增菌后，提取重組載體行Mlu和Sa雙酶切，電泳膠回收目的片段并測(cè)定濃度，與經(jīng)相同雙酶切的載體pVITRO2-mcs提取物連接成重組表達(dá)載體pVITRO2-mcs-NK4。將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到E.Coli DH5并行潮霉素B(100g/ml)篩選，經(jīng)菌落PCR、Mlu和Sal雙酶切等方法確定目標(biāo)片段的存在。 3.細(xì)胞培養(yǎng)條件及篩選用潮霉素B濃

3、度的確定 在維持底層膠瓊脂糖濃度為0.5的基礎(chǔ)上，對(duì)上層膠瓊脂糖濃度(0.10.5)和細(xì)胞濃度(100個(gè)/孔5000個(gè)/孔)進(jìn)行選擇，改良瓊脂糖半固體培養(yǎng)體系。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raji細(xì)胞，以終濃度為1×105個(gè)/ml分別接種于含10200g/ml潮霉素B的RPMI1640培養(yǎng)液(含10新生牛血清)，于37、5CO2靜置培養(yǎng)，以在1014天致全部Raji細(xì)胞死亡的最低潮霉素B濃度作為篩選用濃度。 4.細(xì)胞轉(zhuǎn)染與陽(yáng)性克隆的鑒定 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法行重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染。37、5CO2靜置培養(yǎng)24h后，用50g/ml潮霉素B進(jìn)行篩選。以僅加脂質(zhì)體Raji細(xì)胞為空白對(duì)照，載體pVITRO2-mc

4、s轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞為陰性對(duì)照。取篩選后存活組細(xì)胞提取總RNA，行RT-PCR，電泳，檢測(cè)NK4基因的存在以確定成功轉(zhuǎn)染。 5.NK4基因轉(zhuǎn)染后mRNA表達(dá)水平的檢測(cè) 取第1、7、15代NK4基因轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞培養(yǎng)物提取總RNA，RT后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)NK4 mRNA的表達(dá)水平并評(píng)價(jià)其表達(dá)穩(wěn)定性，以未轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞和載體pVITRO2-mcs轉(zhuǎn)染組為對(duì)照。 6.NK4基因轉(zhuǎn)染后蛋白表達(dá)的檢測(cè) 取處對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NK4基因轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞，采用Western blot、細(xì)胞免疫化學(xué)法定性檢測(cè)NK4蛋白的表達(dá)。此外，分別收集第1、7、15代NK4基因轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞培養(yǎng)物上清液

5、，采用ELISA法定量檢測(cè)NK4蛋白的表達(dá)，并評(píng)價(jià)NK4蛋白表達(dá)的穩(wěn)定性。以未轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞組、載體pVITRO2-mcs轉(zhuǎn)染組作為對(duì)照。 7.NK4基因轉(zhuǎn)染對(duì)Raji細(xì)胞的生物學(xué)性狀的影響 取NK4基因轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞分別做半固體克隆培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)和單層細(xì)胞培養(yǎng)，置37、50CO2靜置培養(yǎng)。第3天起每天觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況至14天，觀察集落形成情況，分別評(píng)價(jià)NK4基因轉(zhuǎn)染對(duì)Raji細(xì)胞的增殖、侵襲和遷徙的影響。 結(jié)果: 1.NK4基因的克隆、重組克隆載體pMD19-T Simple-NK4的構(gòu)建與鑒定 新鮮人肝組織提取總RNA后行RT-PCR，可見(jiàn)一約1.4 kb的特異性條帶，與目的片段大小

6、一致(1449 bp)，提示NK4 cDNA片段成功擴(kuò)增。將pMD19-TSimple-NK4轉(zhuǎn)染E.Coli DH5，篩選出陽(yáng)性菌落。將陽(yáng)性菌落PCR產(chǎn)物、重組克隆載體Sal、Mlu雙酶切產(chǎn)物和未酶切重組載體等同時(shí)電泳，可見(jiàn)與目的片段大小一致的特異性條帶(1449 bp)，測(cè)序結(jié)果與Genebank報(bào)道的序列相同，提示pMD19-T Simple-NK4成功構(gòu)建。 2.重組真核表達(dá)載體pVITRO2-mcs-NK4的構(gòu)建與鑒定 將重組表達(dá)載體pVITRO2-mcs-NK4轉(zhuǎn)染E.Coli DH5后采用潮霉素B篩選出陽(yáng)性菌落。將NK4基因的RT-PCR產(chǎn)物、陽(yáng)性菌落PCR產(chǎn)物、重組表達(dá)載體Sa

7、l和Miu雙酶切產(chǎn)物、未酶切重組載體等同時(shí)電泳，發(fā)現(xiàn)與目的片段大小一致的特異性條帶(1449 bp)，提示pVITRO2-mcs-NK4獲成功構(gòu)建。 3.最佳細(xì)胞培養(yǎng)條件與篩選用潮霉素B濃度的確定 篩選后確定上層膠瓊脂糖濃度為0.3、細(xì)胞濃度為1000個(gè)/孔，0.5底層瓊脂建立半固體培養(yǎng)體系。在常規(guī)靜置培養(yǎng)條件(含10新生牛血清的RPMI1640，37、5CO2)下，分別在10g/ml、25g/ml、50g/ml、100g/ml、150g/ml、200g/ml潮霉素B的作用下，10g/ml、25g/ml組細(xì)胞在1014天后均有存活細(xì)胞，而其他4組均死亡，故以50g/ml潮霉素B作為轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的

8、篩選濃度。 4.轉(zhuǎn)染后陽(yáng)性細(xì)胞的篩選與鑒定 經(jīng)50g/ml潮霉素B處理6天后各組細(xì)胞均出現(xiàn)大量細(xì)胞死亡。至14天空白對(duì)照組均死亡，陰性對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組仍存活，4周后存活細(xì)胞明顯增加。取常規(guī)培養(yǎng)Raji細(xì)胞、陰性對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞提取總RNA，行RT-PCR。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組存在特異性條帶(1449 bp)，而常規(guī)培養(yǎng)Raji細(xì)胞、陰性對(duì)照均無(wú)，提示重組表達(dá)載體pVITRO2-mcs-NK4已成功轉(zhuǎn)染，且對(duì)照組均無(wú)NK4 mRNA表達(dá)。 5.轉(zhuǎn)染后NK4基因表達(dá)的檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)第1、7、15代培養(yǎng)物NK4 mRNA的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：第1、7、15代pVITRO2-mcs-N

9、K4轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)物NK4 mRNA分別為6.68±0.32、6.37±0.29和6.53±0.24，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)，而對(duì)照組呈極弱表達(dá)，提示NK4基因轉(zhuǎn)染后能在Raji細(xì)胞中能穩(wěn)定表達(dá)。 6.轉(zhuǎn)染后NK4蛋白表達(dá)的檢測(cè) Western blot結(jié)果表明，NK4基因轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞的培養(yǎng)液存在大小約50 kDa的蛋白條帶，而對(duì)照組均無(wú)；免疫細(xì)胞組化結(jié)果顯示，NK4基因轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞的細(xì)胞漿呈藍(lán)色且有明顯的藍(lán)色顆粒，而未轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞組和載體pVITRO2-mcs轉(zhuǎn)染組均未藍(lán)染。ELISA檢測(cè)第1、7、15代NK4基因轉(zhuǎn)染后

10、Raji細(xì)胞培養(yǎng)液上清中NK4蛋白量分別為4.14±0.19 ng/ml、4.32±0.27 ng/ml、4.37±0.38 ng/ml，提示各代培養(yǎng)物均有NK4蛋白的表達(dá)，且無(wú)顯著性差異(P>0.05)，說(shuō)明NK4基因轉(zhuǎn)染后能在Raji細(xì)胞中能穩(wěn)定表達(dá)NK4蛋白。 7.NK4基因轉(zhuǎn)染后對(duì)Raji細(xì)胞的生物學(xué)作用 細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)表明，37、5CO2半固體培養(yǎng)至14天發(fā)現(xiàn)：在常規(guī)克隆培養(yǎng)中，對(duì)照組形成的克隆邊緣不齊，有細(xì)胞向外生長(zhǎng)，而NK4基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞形成的克隆邊緣整齊，偶見(jiàn)向外生長(zhǎng)的細(xì)胞；經(jīng)穿刺培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)各組均有條索狀細(xì)胞團(tuán)形成，與對(duì)照組相比，實(shí)

11、驗(yàn)組細(xì)胞團(tuán)較小，邊緣較整齊，周?chē)⒃谛约?xì)胞少；而單層培養(yǎng)結(jié)果更為直觀，實(shí)驗(yàn)組形成邊緣整齊的圓形細(xì)胞團(tuán)，提示NK4基因轉(zhuǎn)染抑制了Raji細(xì)胞的增殖、遷徙和侵襲。 結(jié)論: NK4基因獲成功克隆并構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體pVITRO2-mcs-NK4。轉(zhuǎn)染NK4基因后的Raji細(xì)胞經(jīng)RT-PCR發(fā)現(xiàn)存在特異性DNA片段。NK4基因在Raji細(xì)胞中可穩(wěn)定表達(dá)NK4 mRNA和蛋白，且可抑制Raji細(xì)胞的增殖、遷徙和侵襲。上述結(jié)果將有助于深入研究NK4的生物學(xué)效應(yīng)及對(duì)淋巴瘤進(jìn)行基因治療的探索。正文內(nèi)容 目的: 克隆NK4基因，構(gòu)建其重組真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞，觀察NK4基因在Raji細(xì)胞的表達(dá)，為

12、研究NK4的生物學(xué)效應(yīng)和淋巴瘤的基因治療作相關(guān)基礎(chǔ)工作。 方法: 1.NK4基因的克隆與重組克隆載體的構(gòu)建及鑒定 由新鮮人肝組織提取總RNA，行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)獲NK4基因cDNA，與載體pMD19-T Simple連接，構(gòu)建重組克隆載體pMD19-T simple-NK4。將重組克隆載體以CaCl2法轉(zhuǎn)化E.Coli DH5并行氨芐青霉素和-篩選，采用菌落直接PCR、Mu和Sal雙酶切及序列分析等方法，證實(shí)目的片段的存在和序列正確。 2.重組真核表達(dá)載體pVITRO2-mcs-NK4的構(gòu)建與鑒定 將轉(zhuǎn)化重組克隆載體pMD19-T Simple-NK4的E.Coli DH5增

13、菌后，提取重組載體行Mlu和Sa雙酶切，電泳膠回收目的片段并測(cè)定濃度，與經(jīng)相同雙酶切的載體pVITRO2-mcs提取物連接成重組表達(dá)載體pVITRO2-mcs-NK4。將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到E.Coli DH5并行潮霉素B(100g/ml)篩選，經(jīng)菌落PCR、Mlu和Sal雙酶切等方法確定目標(biāo)片段的存在。 3.細(xì)胞培養(yǎng)條件及篩選用潮霉素B濃度的確定 在維持底層膠瓊脂糖濃度為0.5的基礎(chǔ)上，對(duì)上層膠瓊脂糖濃度(0.10.5)和細(xì)胞濃度(100個(gè)/孔5000個(gè)/孔)進(jìn)行選擇，改良瓊脂糖半固體培養(yǎng)體系。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raji細(xì)胞，以終濃度為1×105個(gè)/ml分別接種于含10200g/ml潮霉

14、素B的RPMI1640培養(yǎng)液(含10新生牛血清)，于37、5CO2靜置培養(yǎng)，以在1014天致全部Raji細(xì)胞死亡的最低潮霉素B濃度作為篩選用濃度。 4.細(xì)胞轉(zhuǎn)染與陽(yáng)性克隆的鑒定 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法行重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染。37、5CO2靜置培養(yǎng)24h后，用50g/ml潮霉素B進(jìn)行篩選。以僅加脂質(zhì)體Raji細(xì)胞為空白對(duì)照，載體pVITRO2-mcs轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞為陰性對(duì)照。取篩選后存活組細(xì)胞提取總RNA，行RT-PCR，電泳，檢測(cè)NK4基因的存在以確定成功轉(zhuǎn)染。 5.NK4基因轉(zhuǎn)染后mRNA表達(dá)水平的檢測(cè) 取第1、7、15代NK4基因轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞培養(yǎng)物提取總RNA，RT后采用實(shí)時(shí)熒光定量PC

15、R，檢測(cè)NK4 mRNA的表達(dá)水平并評(píng)價(jià)其表達(dá)穩(wěn)定性，以未轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞和載體pVITRO2-mcs轉(zhuǎn)染組為對(duì)照。 6.NK4基因轉(zhuǎn)染后蛋白表達(dá)的檢測(cè) 取處對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NK4基因轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞，采用Western blot、細(xì)胞免疫化學(xué)法定性檢測(cè)NK4蛋白的表達(dá)。此外，分別收集第1、7、15代NK4基因轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，采用ELISA法定量檢測(cè)NK4蛋白的表達(dá)，并評(píng)價(jià)NK4蛋白表達(dá)的穩(wěn)定性。以未轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞組、載體pVITRO2-mcs轉(zhuǎn)染組作為對(duì)照。 7.NK4基因轉(zhuǎn)染對(duì)Raji細(xì)胞的生物學(xué)性狀的影響 取NK4基因轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞分別做半固體克隆培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)和單層細(xì)

16、胞培養(yǎng)，置37、50CO2靜置培養(yǎng)。第3天起每天觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況至14天，觀察集落形成情況，分別評(píng)價(jià)NK4基因轉(zhuǎn)染對(duì)Raji細(xì)胞的增殖、侵襲和遷徙的影響。 結(jié)果: 1.NK4基因的克隆、重組克隆載體pMD19-T Simple-NK4的構(gòu)建與鑒定 新鮮人肝組織提取總RNA后行RT-PCR，可見(jiàn)一約1.4 kb的特異性條帶，與目的片段大小一致(1449 bp)，提示NK4 cDNA片段成功擴(kuò)增。將pMD19-TSimple-NK4轉(zhuǎn)染E.Coli DH5，篩選出陽(yáng)性菌落。將陽(yáng)性菌落PCR產(chǎn)物、重組克隆載體Sal、Mlu雙酶切產(chǎn)物和未酶切重組載體等同時(shí)電泳，可見(jiàn)與目的片段大小一致的特異性條帶(1

17、449 bp)，測(cè)序結(jié)果與Genebank報(bào)道的序列相同，提示pMD19-T Simple-NK4成功構(gòu)建。 2.重組真核表達(dá)載體pVITRO2-mcs-NK4的構(gòu)建與鑒定 將重組表達(dá)載體pVITRO2-mcs-NK4轉(zhuǎn)染E.Coli DH5后采用潮霉素B篩選出陽(yáng)性菌落。將NK4基因的RT-PCR產(chǎn)物、陽(yáng)性菌落PCR產(chǎn)物、重組表達(dá)載體Sal和Miu雙酶切產(chǎn)物、未酶切重組載體等同時(shí)電泳，發(fā)現(xiàn)與目的片段大小一致的特異性條帶(1449 bp)，提示pVITRO2-mcs-NK4獲成功構(gòu)建。 3.最佳細(xì)胞培養(yǎng)條件與篩選用潮霉素B濃度的確定 篩選后確定上層膠瓊脂糖濃度為0.3、細(xì)胞濃度為1000個(gè)/孔，

18、0.5底層瓊脂建立半固體培養(yǎng)體系。在常規(guī)靜置培養(yǎng)條件(含10新生牛血清的RPMI1640，37、5CO2)下，分別在10g/ml、25g/ml、50g/ml、100g/ml、150g/ml、200g/ml潮霉素B的作用下，10g/ml、25g/ml組細(xì)胞在1014天后均有存活細(xì)胞，而其他4組均死亡，故以50g/ml潮霉素B作為轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的篩選濃度。 4.轉(zhuǎn)染后陽(yáng)性細(xì)胞的篩選與鑒定 經(jīng)50g/ml潮霉素B處理6天后各組細(xì)胞均出現(xiàn)大量細(xì)胞死亡。至14天空白對(duì)照組均死亡，陰性對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組仍存活，4周后存活細(xì)胞明顯增加。取常規(guī)培養(yǎng)Raji細(xì)胞、陰性對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞提取總RNA，行RT-PCR。擴(kuò)增產(chǎn)

19、物經(jīng)電泳發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組存在特異性條帶(1449 bp)，而常規(guī)培養(yǎng)Raji細(xì)胞、陰性對(duì)照均無(wú)，提示重組表達(dá)載體pVITRO2-mcs-NK4已成功轉(zhuǎn)染，且對(duì)照組均無(wú)NK4 mRNA表達(dá)。 5.轉(zhuǎn)染后NK4基因表達(dá)的檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)第1、7、15代培養(yǎng)物NK4 mRNA的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：第1、7、15代pVITRO2-mcs-NK4轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)物NK4 mRNA分別為6.68±0.32、6.37±0.29和6.53±0.24，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)，而對(duì)照組呈極弱表達(dá)，提示NK4基因轉(zhuǎn)染后能在Raji細(xì)胞中能穩(wěn)定表達(dá)。 6.轉(zhuǎn)

20、染后NK4蛋白表達(dá)的檢測(cè) Western blot結(jié)果表明，NK4基因轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞的培養(yǎng)液存在大小約50 kDa的蛋白條帶，而對(duì)照組均無(wú)；免疫細(xì)胞組化結(jié)果顯示，NK4基因轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞的細(xì)胞漿呈藍(lán)色且有明顯的藍(lán)色顆粒，而未轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞組和載體pVITRO2-mcs轉(zhuǎn)染組均未藍(lán)染。ELISA檢測(cè)第1、7、15代NK4基因轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞培養(yǎng)液上清中NK4蛋白量分別為4.14±0.19 ng/ml、4.32±0.27 ng/ml、4.37±0.38 ng/ml，提示各代培養(yǎng)物均有NK4蛋白的表達(dá)，且無(wú)顯著性差異(P>0.05)，說(shuō)

21、明NK4基因轉(zhuǎn)染后能在Raji細(xì)胞中能穩(wěn)定表達(dá)NK4蛋白。 7.NK4基因轉(zhuǎn)染后對(duì)Raji細(xì)胞的生物學(xué)作用 細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)表明，37、5CO2半固體培養(yǎng)至14天發(fā)現(xiàn)：在常規(guī)克隆培養(yǎng)中，對(duì)照組形成的克隆邊緣不齊，有細(xì)胞向外生長(zhǎng)，而NK4基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞形成的克隆邊緣整齊，偶見(jiàn)向外生長(zhǎng)的細(xì)胞；經(jīng)穿刺培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)各組均有條索狀細(xì)胞團(tuán)形成，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞團(tuán)較小，邊緣較整齊，周?chē)⒃谛约?xì)胞少；而單層培養(yǎng)結(jié)果更為直觀，實(shí)驗(yàn)組形成邊緣整齊的圓形細(xì)胞團(tuán)，提示NK4基因轉(zhuǎn)染抑制了Raji細(xì)胞的增殖、遷徙和侵襲。 結(jié)論: NK4基因獲成功克隆并構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體pVITRO2-mcs-NK4。轉(zhuǎn)染NK4基因后

22、的Raji細(xì)胞經(jīng)RT-PCR發(fā)現(xiàn)存在特異性DNA片段。NK4基因在Raji細(xì)胞中可穩(wěn)定表達(dá)NK4 mRNA和蛋白，且可抑制Raji細(xì)胞的增殖、遷徙和侵襲。上述結(jié)果將有助于深入研究NK4的生物學(xué)效應(yīng)及對(duì)淋巴瘤進(jìn)行基因治療的探索。目的: 克隆NK4基因，構(gòu)建其重組真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞，觀察NK4基因在Raji細(xì)胞的表達(dá)，為研究NK4的生物學(xué)效應(yīng)和淋巴瘤的基因治療作相關(guān)基礎(chǔ)工作。 方法: 1.NK4基因的克隆與重組克隆載體的構(gòu)建及鑒定 由新鮮人肝組織提取總RNA，行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)獲NK4基因cDNA，與載體pMD19-T Simple連接，構(gòu)建重組克隆載體pMD19-T

23、 simple-NK4。將重組克隆載體以CaCl2法轉(zhuǎn)化E.Coli DH5并行氨芐青霉素和-篩選，采用菌落直接PCR、Mu和Sal雙酶切及序列分析等方法，證實(shí)目的片段的存在和序列正確。 2.重組真核表達(dá)載體pVITRO2-mcs-NK4的構(gòu)建與鑒定 將轉(zhuǎn)化重組克隆載體pMD19-T Simple-NK4的E.Coli DH5增菌后，提取重組載體行Mlu和Sa雙酶切，電泳膠回收目的片段并測(cè)定濃度，與經(jīng)相同雙酶切的載體pVITRO2-mcs提取物連接成重組表達(dá)載體pVITRO2-mcs-NK4。將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到E.Coli DH5并行潮霉素B(100g/ml)篩選，經(jīng)菌落PCR、Mlu和Sa

24、l雙酶切等方法確定目標(biāo)片段的存在。 3.細(xì)胞培養(yǎng)條件及篩選用潮霉素B濃度的確定 在維持底層膠瓊脂糖濃度為0.5的基礎(chǔ)上，對(duì)上層膠瓊脂糖濃度(0.10.5)和細(xì)胞濃度(100個(gè)/孔5000個(gè)/孔)進(jìn)行選擇，改良瓊脂糖半固體培養(yǎng)體系。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raji細(xì)胞，以終濃度為1×105個(gè)/ml分別接種于含10200g/ml潮霉素B的RPMI1640培養(yǎng)液(含10新生牛血清)，于37、5CO2靜置培養(yǎng)，以在1014天致全部Raji細(xì)胞死亡的最低潮霉素B濃度作為篩選用濃度。 4.細(xì)胞轉(zhuǎn)染與陽(yáng)性克隆的鑒定 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法行重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染。37、5CO2靜置培養(yǎng)24h后，用50g/ml潮霉素B

25、進(jìn)行篩選。以僅加脂質(zhì)體Raji細(xì)胞為空白對(duì)照，載體pVITRO2-mcs轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞為陰性對(duì)照。取篩選后存活組細(xì)胞提取總RNA，行RT-PCR，電泳，檢測(cè)NK4基因的存在以確定成功轉(zhuǎn)染。 5.NK4基因轉(zhuǎn)染后mRNA表達(dá)水平的檢測(cè) 取第1、7、15代NK4基因轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞培養(yǎng)物提取總RNA，RT后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)NK4 mRNA的表達(dá)水平并評(píng)價(jià)其表達(dá)穩(wěn)定性，以未轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞和載體pVITRO2-mcs轉(zhuǎn)染組為對(duì)照。 6.NK4基因轉(zhuǎn)染后蛋白表達(dá)的檢測(cè) 取處對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NK4基因轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞，采用Western blot、細(xì)胞免疫化學(xué)法定性檢測(cè)NK4蛋白的表達(dá)。

26、此外，分別收集第1、7、15代NK4基因轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，采用ELISA法定量檢測(cè)NK4蛋白的表達(dá)，并評(píng)價(jià)NK4蛋白表達(dá)的穩(wěn)定性。以未轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞組、載體pVITRO2-mcs轉(zhuǎn)染組作為對(duì)照。 7.NK4基因轉(zhuǎn)染對(duì)Raji細(xì)胞的生物學(xué)性狀的影響 取NK4基因轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞分別做半固體克隆培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)和單層細(xì)胞培養(yǎng)，置37、50CO2靜置培養(yǎng)。第3天起每天觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況至14天，觀察集落形成情況，分別評(píng)價(jià)NK4基因轉(zhuǎn)染對(duì)Raji細(xì)胞的增殖、侵襲和遷徙的影響。 結(jié)果: 1.NK4基因的克隆、重組克隆載體pMD19-T Simple-NK4的構(gòu)建與鑒定 新鮮人肝組織提取總R

27、NA后行RT-PCR，可見(jiàn)一約1.4 kb的特異性條帶，與目的片段大小一致(1449 bp)，提示NK4 cDNA片段成功擴(kuò)增。將pMD19-TSimple-NK4轉(zhuǎn)染E.Coli DH5，篩選出陽(yáng)性菌落。將陽(yáng)性菌落PCR產(chǎn)物、重組克隆載體Sal、Mlu雙酶切產(chǎn)物和未酶切重組載體等同時(shí)電泳，可見(jiàn)與目的片段大小一致的特異性條帶(1449 bp)，測(cè)序結(jié)果與Genebank報(bào)道的序列相同，提示pMD19-T Simple-NK4成功構(gòu)建。 2.重組真核表達(dá)載體pVITRO2-mcs-NK4的構(gòu)建與鑒定 將重組表達(dá)載體pVITRO2-mcs-NK4轉(zhuǎn)染E.Coli DH5后采用潮霉素B篩選出陽(yáng)性菌落

28、。將NK4基因的RT-PCR產(chǎn)物、陽(yáng)性菌落PCR產(chǎn)物、重組表達(dá)載體Sal和Miu雙酶切產(chǎn)物、未酶切重組載體等同時(shí)電泳，發(fā)現(xiàn)與目的片段大小一致的特異性條帶(1449 bp)，提示pVITRO2-mcs-NK4獲成功構(gòu)建。 3.最佳細(xì)胞培養(yǎng)條件與篩選用潮霉素B濃度的確定 篩選后確定上層膠瓊脂糖濃度為0.3、細(xì)胞濃度為1000個(gè)/孔，0.5底層瓊脂建立半固體培養(yǎng)體系。在常規(guī)靜置培養(yǎng)條件(含10新生牛血清的RPMI1640，37、5CO2)下，分別在10g/ml、25g/ml、50g/ml、100g/ml、150g/ml、200g/ml潮霉素B的作用下，10g/ml、25g/ml組細(xì)胞在1014天后均

29、有存活細(xì)胞，而其他4組均死亡，故以50g/ml潮霉素B作為轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的篩選濃度。 4.轉(zhuǎn)染后陽(yáng)性細(xì)胞的篩選與鑒定 經(jīng)50g/ml潮霉素B處理6天后各組細(xì)胞均出現(xiàn)大量細(xì)胞死亡。至14天空白對(duì)照組均死亡，陰性對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組仍存活，4周后存活細(xì)胞明顯增加。取常規(guī)培養(yǎng)Raji細(xì)胞、陰性對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞提取總RNA，行RT-PCR。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組存在特異性條帶(1449 bp)，而常規(guī)培養(yǎng)Raji細(xì)胞、陰性對(duì)照均無(wú)，提示重組表達(dá)載體pVITRO2-mcs-NK4已成功轉(zhuǎn)染，且對(duì)照組均無(wú)NK4 mRNA表達(dá)。 5.轉(zhuǎn)染后NK4基因表達(dá)的檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)第1、7、15代培養(yǎng)物NK4

30、 mRNA的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：第1、7、15代pVITRO2-mcs-NK4轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)物NK4 mRNA分別為6.68±0.32、6.37±0.29和6.53±0.24，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)，而對(duì)照組呈極弱表達(dá)，提示NK4基因轉(zhuǎn)染后能在Raji細(xì)胞中能穩(wěn)定表達(dá)。 6.轉(zhuǎn)染后NK4蛋白表達(dá)的檢測(cè) Western blot結(jié)果表明，NK4基因轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞的培養(yǎng)液存在大小約50 kDa的蛋白條帶，而對(duì)照組均無(wú)；免疫細(xì)胞組化結(jié)果顯示，NK4基因轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞的細(xì)胞漿呈藍(lán)色且有明顯的藍(lán)色顆粒，而未轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞組和載體pVITRO2

31、-mcs轉(zhuǎn)染組均未藍(lán)染。ELISA檢測(cè)第1、7、15代NK4基因轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞培養(yǎng)液上清中NK4蛋白量分別為4.14±0.19 ng/ml、4.32±0.27 ng/ml、4.37±0.38 ng/ml，提示各代培養(yǎng)物均有NK4蛋白的表達(dá)，且無(wú)顯著性差異(P>0.05)，說(shuō)明NK4基因轉(zhuǎn)染后能在Raji細(xì)胞中能穩(wěn)定表達(dá)NK4蛋白。 7.NK4基因轉(zhuǎn)染后對(duì)Raji細(xì)胞的生物學(xué)作用 細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)表明，37、5CO2半固體培養(yǎng)至14天發(fā)現(xiàn)：在常規(guī)克隆培養(yǎng)中，對(duì)照組形成的克隆邊緣不齊，有細(xì)胞向外生長(zhǎng)，而NK4基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞形成的克隆邊緣整齊，偶見(jiàn)向

32、外生長(zhǎng)的細(xì)胞；經(jīng)穿刺培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)各組均有條索狀細(xì)胞團(tuán)形成，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞團(tuán)較小，邊緣較整齊，周?chē)⒃谛约?xì)胞少；而單層培養(yǎng)結(jié)果更為直觀，實(shí)驗(yàn)組形成邊緣整齊的圓形細(xì)胞團(tuán)，提示NK4基因轉(zhuǎn)染抑制了Raji細(xì)胞的增殖、遷徙和侵襲。 結(jié)論: NK4基因獲成功克隆并構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體pVITRO2-mcs-NK4。轉(zhuǎn)染NK4基因后的Raji細(xì)胞經(jīng)RT-PCR發(fā)現(xiàn)存在特異性DNA片段。NK4基因在Raji細(xì)胞中可穩(wěn)定表達(dá)NK4 mRNA和蛋白，且可抑制Raji細(xì)胞的增殖、遷徙和侵襲。上述結(jié)果將有助于深入研究NK4的生物學(xué)效應(yīng)及對(duì)淋巴瘤進(jìn)行基因治療的探索。目的: 克隆NK4基因，構(gòu)建其重組真核表達(dá)載

33、體，轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞，觀察NK4基因在Raji細(xì)胞的表達(dá)，為研究NK4的生物學(xué)效應(yīng)和淋巴瘤的基因治療作相關(guān)基礎(chǔ)工作。 方法: 1.NK4基因的克隆與重組克隆載體的構(gòu)建及鑒定 由新鮮人肝組織提取總RNA，行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)獲NK4基因cDNA，與載體pMD19-T Simple連接，構(gòu)建重組克隆載體pMD19-T simple-NK4。將重組克隆載體以CaCl2法轉(zhuǎn)化E.Coli DH5并行氨芐青霉素和-篩選，采用菌落直接PCR、Mu和Sal雙酶切及序列分析等方法，證實(shí)目的片段的存在和序列正確。 2.重組真核表達(dá)載體pVITRO2-mcs-NK4的構(gòu)建與鑒定 將轉(zhuǎn)化重組克隆載體

34、pMD19-T Simple-NK4的E.Coli DH5增菌后，提取重組載體行Mlu和Sa雙酶切，電泳膠回收目的片段并測(cè)定濃度，與經(jīng)相同雙酶切的載體pVITRO2-mcs提取物連接成重組表達(dá)載體pVITRO2-mcs-NK4。將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到E.Coli DH5并行潮霉素B(100g/ml)篩選，經(jīng)菌落PCR、Mlu和Sal雙酶切等方法確定目標(biāo)片段的存在。 3.細(xì)胞培養(yǎng)條件及篩選用潮霉素B濃度的確定 在維持底層膠瓊脂糖濃度為0.5的基礎(chǔ)上，對(duì)上層膠瓊脂糖濃度(0.10.5)和細(xì)胞濃度(100個(gè)/孔5000個(gè)/孔)進(jìn)行選擇，改良瓊脂糖半固體培養(yǎng)體系。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raji細(xì)胞，以終濃度為1

35、×105個(gè)/ml分別接種于含10200g/ml潮霉素B的RPMI1640培養(yǎng)液(含10新生牛血清)，于37、5CO2靜置培養(yǎng)，以在1014天致全部Raji細(xì)胞死亡的最低潮霉素B濃度作為篩選用濃度。 4.細(xì)胞轉(zhuǎn)染與陽(yáng)性克隆的鑒定 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法行重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染。37、5CO2靜置培養(yǎng)24h后，用50g/ml潮霉素B進(jìn)行篩選。以僅加脂質(zhì)體Raji細(xì)胞為空白對(duì)照，載體pVITRO2-mcs轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞為陰性對(duì)照。取篩選后存活組細(xì)胞提取總RNA，行RT-PCR，電泳，檢測(cè)NK4基因的存在以確定成功轉(zhuǎn)染。 5.NK4基因轉(zhuǎn)染后mRNA表達(dá)水平的檢測(cè) 取第1、7、15代NK4基因轉(zhuǎn)染

36、后Raji細(xì)胞培養(yǎng)物提取總RNA，RT后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)NK4 mRNA的表達(dá)水平并評(píng)價(jià)其表達(dá)穩(wěn)定性，以未轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞和載體pVITRO2-mcs轉(zhuǎn)染組為對(duì)照。 6.NK4基因轉(zhuǎn)染后蛋白表達(dá)的檢測(cè) 取處對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NK4基因轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞，采用Western blot、細(xì)胞免疫化學(xué)法定性檢測(cè)NK4蛋白的表達(dá)。此外，分別收集第1、7、15代NK4基因轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，采用ELISA法定量檢測(cè)NK4蛋白的表達(dá)，并評(píng)價(jià)NK4蛋白表達(dá)的穩(wěn)定性。以未轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞組、載體pVITRO2-mcs轉(zhuǎn)染組作為對(duì)照。 7.NK4基因轉(zhuǎn)染對(duì)Raji細(xì)胞的生物學(xué)性狀的影響 取NK

37、4基因轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞分別做半固體克隆培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)和單層細(xì)胞培養(yǎng)，置37、50CO2靜置培養(yǎng)。第3天起每天觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況至14天，觀察集落形成情況，分別評(píng)價(jià)NK4基因轉(zhuǎn)染對(duì)Raji細(xì)胞的增殖、侵襲和遷徙的影響。 結(jié)果: 1.NK4基因的克隆、重組克隆載體pMD19-T Simple-NK4的構(gòu)建與鑒定 新鮮人肝組織提取總RNA后行RT-PCR，可見(jiàn)一約1.4 kb的特異性條帶，與目的片段大小一致(1449 bp)，提示NK4 cDNA片段成功擴(kuò)增。將pMD19-TSimple-NK4轉(zhuǎn)染E.Coli DH5，篩選出陽(yáng)性菌落。將陽(yáng)性菌落PCR產(chǎn)物、重組克隆載體Sal、Mlu雙酶切產(chǎn)物和未酶

38、切重組載體等同時(shí)電泳，可見(jiàn)與目的片段大小一致的特異性條帶(1449 bp)，測(cè)序結(jié)果與Genebank報(bào)道的序列相同，提示pMD19-T Simple-NK4成功構(gòu)建。 2.重組真核表達(dá)載體pVITRO2-mcs-NK4的構(gòu)建與鑒定 將重組表達(dá)載體pVITRO2-mcs-NK4轉(zhuǎn)染E.Coli DH5后采用潮霉素B篩選出陽(yáng)性菌落。將NK4基因的RT-PCR產(chǎn)物、陽(yáng)性菌落PCR產(chǎn)物、重組表達(dá)載體Sal和Miu雙酶切產(chǎn)物、未酶切重組載體等同時(shí)電泳，發(fā)現(xiàn)與目的片段大小一致的特異性條帶(1449 bp)，提示pVITRO2-mcs-NK4獲成功構(gòu)建。 3.最佳細(xì)胞培養(yǎng)條件與篩選用潮霉素B濃度的確定 篩

39、選后確定上層膠瓊脂糖濃度為0.3、細(xì)胞濃度為1000個(gè)/孔，0.5底層瓊脂建立半固體培養(yǎng)體系。在常規(guī)靜置培養(yǎng)條件(含10新生牛血清的RPMI1640，37、5CO2)下，分別在10g/ml、25g/ml、50g/ml、100g/ml、150g/ml、200g/ml潮霉素B的作用下，10g/ml、25g/ml組細(xì)胞在1014天后均有存活細(xì)胞，而其他4組均死亡，故以50g/ml潮霉素B作為轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的篩選濃度。 4.轉(zhuǎn)染后陽(yáng)性細(xì)胞的篩選與鑒定 經(jīng)50g/ml潮霉素B處理6天后各組細(xì)胞均出現(xiàn)大量細(xì)胞死亡。至14天空白對(duì)照組均死亡，陰性對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組仍存活，4周后存活細(xì)胞明顯增加。取常規(guī)培養(yǎng)Raji細(xì)胞

40、、陰性對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞提取總RNA，行RT-PCR。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組存在特異性條帶(1449 bp)，而常規(guī)培養(yǎng)Raji細(xì)胞、陰性對(duì)照均無(wú)，提示重組表達(dá)載體pVITRO2-mcs-NK4已成功轉(zhuǎn)染，且對(duì)照組均無(wú)NK4 mRNA表達(dá)。 5.轉(zhuǎn)染后NK4基因表達(dá)的檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)第1、7、15代培養(yǎng)物NK4 mRNA的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：第1、7、15代pVITRO2-mcs-NK4轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)物NK4 mRNA分別為6.68±0.32、6.37±0.29和6.53±0.24，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)，而對(duì)照組呈極弱表達(dá)

41、，提示NK4基因轉(zhuǎn)染后能在Raji細(xì)胞中能穩(wěn)定表達(dá)。 6.轉(zhuǎn)染后NK4蛋白表達(dá)的檢測(cè) Western blot結(jié)果表明，NK4基因轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞的培養(yǎng)液存在大小約50 kDa的蛋白條帶，而對(duì)照組均無(wú)；免疫細(xì)胞組化結(jié)果顯示，NK4基因轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞的細(xì)胞漿呈藍(lán)色且有明顯的藍(lán)色顆粒，而未轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞組和載體pVITRO2-mcs轉(zhuǎn)染組均未藍(lán)染。ELISA檢測(cè)第1、7、15代NK4基因轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞培養(yǎng)液上清中NK4蛋白量分別為4.14±0.19 ng/ml、4.32±0.27 ng/ml、4.37±0.38 ng/ml，提示各代培養(yǎng)物均有NK4蛋白的表

42、達(dá)，且無(wú)顯著性差異(P>0.05)，說(shuō)明NK4基因轉(zhuǎn)染后能在Raji細(xì)胞中能穩(wěn)定表達(dá)NK4蛋白。 7.NK4基因轉(zhuǎn)染后對(duì)Raji細(xì)胞的生物學(xué)作用 細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)表明，37、5CO2半固體培養(yǎng)至14天發(fā)現(xiàn)：在常規(guī)克隆培養(yǎng)中，對(duì)照組形成的克隆邊緣不齊，有細(xì)胞向外生長(zhǎng)，而NK4基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞形成的克隆邊緣整齊，偶見(jiàn)向外生長(zhǎng)的細(xì)胞；經(jīng)穿刺培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)各組均有條索狀細(xì)胞團(tuán)形成，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞團(tuán)較小，邊緣較整齊，周?chē)⒃谛约?xì)胞少；而單層培養(yǎng)結(jié)果更為直觀，實(shí)驗(yàn)組形成邊緣整齊的圓形細(xì)胞團(tuán)，提示NK4基因轉(zhuǎn)染抑制了Raji細(xì)胞的增殖、遷徙和侵襲。 結(jié)論: NK4基因獲成功克隆并構(gòu)建了重組

43、真核表達(dá)載體pVITRO2-mcs-NK4。轉(zhuǎn)染NK4基因后的Raji細(xì)胞經(jīng)RT-PCR發(fā)現(xiàn)存在特異性DNA片段。NK4基因在Raji細(xì)胞中可穩(wěn)定表達(dá)NK4 mRNA和蛋白，且可抑制Raji細(xì)胞的增殖、遷徙和侵襲。上述結(jié)果將有助于深入研究NK4的生物學(xué)效應(yīng)及對(duì)淋巴瘤進(jìn)行基因治療的探索。目的: 克隆NK4基因，構(gòu)建其重組真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞，觀察NK4基因在Raji細(xì)胞的表達(dá)，為研究NK4的生物學(xué)效應(yīng)和淋巴瘤的基因治療作相關(guān)基礎(chǔ)工作。 方法: 1.NK4基因的克隆與重組克隆載體的構(gòu)建及鑒定 由新鮮人肝組織提取總RNA，行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)獲NK4基因cDNA，與載體pM

44、D19-T Simple連接，構(gòu)建重組克隆載體pMD19-T simple-NK4。將重組克隆載體以CaCl2法轉(zhuǎn)化E.Coli DH5并行氨芐青霉素和-篩選，采用菌落直接PCR、Mu和Sal雙酶切及序列分析等方法，證實(shí)目的片段的存在和序列正確。 2.重組真核表達(dá)載體pVITRO2-mcs-NK4的構(gòu)建與鑒定 將轉(zhuǎn)化重組克隆載體pMD19-T Simple-NK4的E.Coli DH5增菌后，提取重組載體行Mlu和Sa雙酶切，電泳膠回收目的片段并測(cè)定濃度，與經(jīng)相同雙酶切的載體pVITRO2-mcs提取物連接成重組表達(dá)載體pVITRO2-mcs-NK4。將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到E.Coli DH5并

45、行潮霉素B(100g/ml)篩選，經(jīng)菌落PCR、Mlu和Sal雙酶切等方法確定目標(biāo)片段的存在。 3.細(xì)胞培養(yǎng)條件及篩選用潮霉素B濃度的確定 在維持底層膠瓊脂糖濃度為0.5的基礎(chǔ)上，對(duì)上層膠瓊脂糖濃度(0.10.5)和細(xì)胞濃度(100個(gè)/孔5000個(gè)/孔)進(jìn)行選擇，改良瓊脂糖半固體培養(yǎng)體系。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raji細(xì)胞，以終濃度為1×105個(gè)/ml分別接種于含10200g/ml潮霉素B的RPMI1640培養(yǎng)液(含10新生牛血清)，于37、5CO2靜置培養(yǎng)，以在1014天致全部Raji細(xì)胞死亡的最低潮霉素B濃度作為篩選用濃度。 4.細(xì)胞轉(zhuǎn)染與陽(yáng)性克隆的鑒定 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法行重組表達(dá)載體的

46、轉(zhuǎn)染。37、5CO2靜置培養(yǎng)24h后，用50g/ml潮霉素B進(jìn)行篩選。以僅加脂質(zhì)體Raji細(xì)胞為空白對(duì)照，載體pVITRO2-mcs轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞為陰性對(duì)照。取篩選后存活組細(xì)胞提取總RNA，行RT-PCR，電泳，檢測(cè)NK4基因的存在以確定成功轉(zhuǎn)染。 5.NK4基因轉(zhuǎn)染后mRNA表達(dá)水平的檢測(cè) 取第1、7、15代NK4基因轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞培養(yǎng)物提取總RNA，RT后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)NK4 mRNA的表達(dá)水平并評(píng)價(jià)其表達(dá)穩(wěn)定性，以未轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞和載體pVITRO2-mcs轉(zhuǎn)染組為對(duì)照。 6.NK4基因轉(zhuǎn)染后蛋白表達(dá)的檢測(cè) 取處對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NK4基因轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞，采用Wes

47、tern blot、細(xì)胞免疫化學(xué)法定性檢測(cè)NK4蛋白的表達(dá)。此外，分別收集第1、7、15代NK4基因轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，采用ELISA法定量檢測(cè)NK4蛋白的表達(dá)，并評(píng)價(jià)NK4蛋白表達(dá)的穩(wěn)定性。以未轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞組、載體pVITRO2-mcs轉(zhuǎn)染組作為對(duì)照。 7.NK4基因轉(zhuǎn)染對(duì)Raji細(xì)胞的生物學(xué)性狀的影響 取NK4基因轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞分別做半固體克隆培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)和單層細(xì)胞培養(yǎng)，置37、50CO2靜置培養(yǎng)。第3天起每天觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況至14天，觀察集落形成情況，分別評(píng)價(jià)NK4基因轉(zhuǎn)染對(duì)Raji細(xì)胞的增殖、侵襲和遷徙的影響。 結(jié)果: 1.NK4基因的克隆、重組克隆載體pMD19

48、-T Simple-NK4的構(gòu)建與鑒定 新鮮人肝組織提取總RNA后行RT-PCR，可見(jiàn)一約1.4 kb的特異性條帶，與目的片段大小一致(1449 bp)，提示NK4 cDNA片段成功擴(kuò)增。將pMD19-TSimple-NK4轉(zhuǎn)染E.Coli DH5，篩選出陽(yáng)性菌落。將陽(yáng)性菌落PCR產(chǎn)物、重組克隆載體Sal、Mlu雙酶切產(chǎn)物和未酶切重組載體等同時(shí)電泳，可見(jiàn)與目的片段大小一致的特異性條帶(1449 bp)，測(cè)序結(jié)果與Genebank報(bào)道的序列相同，提示pMD19-T Simple-NK4成功構(gòu)建。 2.重組真核表達(dá)載體pVITRO2-mcs-NK4的構(gòu)建與鑒定 將重組表達(dá)載體pVITRO2-mcs

49、-NK4轉(zhuǎn)染E.Coli DH5后采用潮霉素B篩選出陽(yáng)性菌落。將NK4基因的RT-PCR產(chǎn)物、陽(yáng)性菌落PCR產(chǎn)物、重組表達(dá)載體Sal和Miu雙酶切產(chǎn)物、未酶切重組載體等同時(shí)電泳，發(fā)現(xiàn)與目的片段大小一致的特異性條帶(1449 bp)，提示pVITRO2-mcs-NK4獲成功構(gòu)建。 3.最佳細(xì)胞培養(yǎng)條件與篩選用潮霉素B濃度的確定 篩選后確定上層膠瓊脂糖濃度為0.3、細(xì)胞濃度為1000個(gè)/孔，0.5底層瓊脂建立半固體培養(yǎng)體系。在常規(guī)靜置培養(yǎng)條件(含10新生牛血清的RPMI1640，37、5CO2)下，分別在10g/ml、25g/ml、50g/ml、100g/ml、150g/ml、200g/ml潮霉素

50、B的作用下，10g/ml、25g/ml組細(xì)胞在1014天后均有存活細(xì)胞，而其他4組均死亡，故以50g/ml潮霉素B作為轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的篩選濃度。 4.轉(zhuǎn)染后陽(yáng)性細(xì)胞的篩選與鑒定 經(jīng)50g/ml潮霉素B處理6天后各組細(xì)胞均出現(xiàn)大量細(xì)胞死亡。至14天空白對(duì)照組均死亡，陰性對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組仍存活，4周后存活細(xì)胞明顯增加。取常規(guī)培養(yǎng)Raji細(xì)胞、陰性對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞提取總RNA，行RT-PCR。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組存在特異性條帶(1449 bp)，而常規(guī)培養(yǎng)Raji細(xì)胞、陰性對(duì)照均無(wú)，提示重組表達(dá)載體pVITRO2-mcs-NK4已成功轉(zhuǎn)染，且對(duì)照組均無(wú)NK4 mRNA表達(dá)。 5.轉(zhuǎn)染后NK4基因表達(dá)的

51、檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)第1、7、15代培養(yǎng)物NK4 mRNA的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：第1、7、15代pVITRO2-mcs-NK4轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)物NK4 mRNA分別為6.68±0.32、6.37±0.29和6.53±0.24，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)，而對(duì)照組呈極弱表達(dá)，提示NK4基因轉(zhuǎn)染后能在Raji細(xì)胞中能穩(wěn)定表達(dá)。 6.轉(zhuǎn)染后NK4蛋白表達(dá)的檢測(cè) Western blot結(jié)果表明，NK4基因轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞的培養(yǎng)液存在大小約50 kDa的蛋白條帶，而對(duì)照組均無(wú)；免疫細(xì)胞組化結(jié)果顯示，NK4基因轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞的細(xì)胞漿呈藍(lán)色且

52、有明顯的藍(lán)色顆粒，而未轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞組和載體pVITRO2-mcs轉(zhuǎn)染組均未藍(lán)染。ELISA檢測(cè)第1、7、15代NK4基因轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞培養(yǎng)液上清中NK4蛋白量分別為4.14±0.19 ng/ml、4.32±0.27 ng/ml、4.37±0.38 ng/ml，提示各代培養(yǎng)物均有NK4蛋白的表達(dá)，且無(wú)顯著性差異(P>0.05)，說(shuō)明NK4基因轉(zhuǎn)染后能在Raji細(xì)胞中能穩(wěn)定表達(dá)NK4蛋白。 7.NK4基因轉(zhuǎn)染后對(duì)Raji細(xì)胞的生物學(xué)作用 細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)表明，37、5CO2半固體培養(yǎng)至14天發(fā)現(xiàn)：在常規(guī)克隆培養(yǎng)中，對(duì)照組形成的克隆邊緣不齊，有

53、細(xì)胞向外生長(zhǎng)，而NK4基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞形成的克隆邊緣整齊，偶見(jiàn)向外生長(zhǎng)的細(xì)胞；經(jīng)穿刺培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)各組均有條索狀細(xì)胞團(tuán)形成，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞團(tuán)較小，邊緣較整齊，周?chē)⒃谛约?xì)胞少；而單層培養(yǎng)結(jié)果更為直觀，實(shí)驗(yàn)組形成邊緣整齊的圓形細(xì)胞團(tuán)，提示NK4基因轉(zhuǎn)染抑制了Raji細(xì)胞的增殖、遷徙和侵襲。 結(jié)論: NK4基因獲成功克隆并構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體pVITRO2-mcs-NK4。轉(zhuǎn)染NK4基因后的Raji細(xì)胞經(jīng)RT-PCR發(fā)現(xiàn)存在特異性DNA片段。NK4基因在Raji細(xì)胞中可穩(wěn)定表達(dá)NK4 mRNA和蛋白，且可抑制Raji細(xì)胞的增殖、遷徙和侵襲。上述結(jié)果將有助于深入研究NK4的生物學(xué)效應(yīng)及對(duì)淋巴瘤進(jìn)行

54、基因治療的探索。目的: 克隆NK4基因，構(gòu)建其重組真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞，觀察NK4基因在Raji細(xì)胞的表達(dá)，為研究NK4的生物學(xué)效應(yīng)和淋巴瘤的基因治療作相關(guān)基礎(chǔ)工作。 方法: 1.NK4基因的克隆與重組克隆載體的構(gòu)建及鑒定 由新鮮人肝組織提取總RNA，行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)獲NK4基因cDNA，與載體pMD19-T Simple連接，構(gòu)建重組克隆載體pMD19-T simple-NK4。將重組克隆載體以CaCl2法轉(zhuǎn)化E.Coli DH5并行氨芐青霉素和-篩選，采用菌落直接PCR、Mu和Sal雙酶切及序列分析等方法，證實(shí)目的片段的存在和序列正確。 2.重組真核表達(dá)載體p

55、VITRO2-mcs-NK4的構(gòu)建與鑒定 將轉(zhuǎn)化重組克隆載體pMD19-T Simple-NK4的E.Coli DH5增菌后，提取重組載體行Mlu和Sa雙酶切，電泳膠回收目的片段并測(cè)定濃度，與經(jīng)相同雙酶切的載體pVITRO2-mcs提取物連接成重組表達(dá)載體pVITRO2-mcs-NK4。將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到E.Coli DH5并行潮霉素B(100g/ml)篩選，經(jīng)菌落PCR、Mlu和Sal雙酶切等方法確定目標(biāo)片段的存在。 3.細(xì)胞培養(yǎng)條件及篩選用潮霉素B濃度的確定 在維持底層膠瓊脂糖濃度為0.5的基礎(chǔ)上，對(duì)上層膠瓊脂糖濃度(0.10.5)和細(xì)胞濃度(100個(gè)/孔5000個(gè)/孔)進(jìn)行選擇，改良瓊

56、脂糖半固體培養(yǎng)體系。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raji細(xì)胞，以終濃度為1×105個(gè)/ml分別接種于含10200g/ml潮霉素B的RPMI1640培養(yǎng)液(含10新生牛血清)，于37、5CO2靜置培養(yǎng)，以在1014天致全部Raji細(xì)胞死亡的最低潮霉素B濃度作為篩選用濃度。 4.細(xì)胞轉(zhuǎn)染與陽(yáng)性克隆的鑒定 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法行重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染。37、5CO2靜置培養(yǎng)24h后，用50g/ml潮霉素B進(jìn)行篩選。以僅加脂質(zhì)體Raji細(xì)胞為空白對(duì)照，載體pVITRO2-mcs轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞為陰性對(duì)照。取篩選后存活組細(xì)胞提取總RNA，行RT-PCR，電泳，檢測(cè)NK4基因的存在以確定成功轉(zhuǎn)染。 5.NK4基因轉(zhuǎn)

57、染后mRNA表達(dá)水平的檢測(cè) 取第1、7、15代NK4基因轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞培養(yǎng)物提取總RNA，RT后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)NK4 mRNA的表達(dá)水平并評(píng)價(jià)其表達(dá)穩(wěn)定性，以未轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞和載體pVITRO2-mcs轉(zhuǎn)染組為對(duì)照。 6.NK4基因轉(zhuǎn)染后蛋白表達(dá)的檢測(cè) 取處對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NK4基因轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞，采用Western blot、細(xì)胞免疫化學(xué)法定性檢測(cè)NK4蛋白的表達(dá)。此外，分別收集第1、7、15代NK4基因轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，采用ELISA法定量檢測(cè)NK4蛋白的表達(dá)，并評(píng)價(jià)NK4蛋白表達(dá)的穩(wěn)定性。以未轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞組、載體pVITRO2-mcs轉(zhuǎn)染組作為對(duì)照。

58、 7.NK4基因轉(zhuǎn)染對(duì)Raji細(xì)胞的生物學(xué)性狀的影響 取NK4基因轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞分別做半固體克隆培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)和單層細(xì)胞培養(yǎng)，置37、50CO2靜置培養(yǎng)。第3天起每天觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況至14天，觀察集落形成情況，分別評(píng)價(jià)NK4基因轉(zhuǎn)染對(duì)Raji細(xì)胞的增殖、侵襲和遷徙的影響。 結(jié)果: 1.NK4基因的克隆、重組克隆載體pMD19-T Simple-NK4的構(gòu)建與鑒定 新鮮人肝組織提取總RNA后行RT-PCR，可見(jiàn)一約1.4 kb的特異性條帶，與目的片段大小一致(1449 bp)，提示NK4 cDNA片段成功擴(kuò)增。將pMD19-TSimple-NK4轉(zhuǎn)染E.Coli DH5，篩選出陽(yáng)性菌落。將陽(yáng)性菌落PCR產(chǎn)物、重組克隆載體Sal、Mlu雙酶切產(chǎn)物和未酶切重組載體等同時(shí)電泳，可見(jiàn)與目的片段大小一致的特異性條帶(1449 bp)，測(cè)序結(jié)果與Genebank報(bào)道的序列相同，提示pMD19-T Simple-NK4成功構(gòu)建。 2.重組真核表達(dá)載體pVITRO2-mcs-NK4的構(gòu)建與鑒定 將