生理學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、蛙類離體心臟灌流一、【目的要求】1、學(xué)習(xí)離體蛙心灌流法。2、 觀察Na+,K+,Ca2+及腎上腺素（Adr）,乙酰膽堿（ACh）,乳酸對(duì)離體心臟活動(dòng)的影響。二、原理】將離體蛙心（失去神經(jīng)支配的蛙心）保持在適宜的環(huán)境中，在一定的時(shí)間內(nèi)仍然能夠保持節(jié)律性收縮，心臟正常的節(jié)律性活動(dòng)需要一個(gè)適宜的理化環(huán)境，離體心臟也是如此，離體心臟脫離了機(jī)體的神經(jīng)支配和全身體液因素的直接影響，可以通過(guò)改變灌流液的某些成分，觀察其對(duì)心臟活動(dòng)的作用。心肌細(xì)胞的自律性、興奮性、傳導(dǎo)性及收縮性，都與鈉、鉀及鈣等離子有關(guān)。外源性給予去甲腎上腺素或乙酰膽堿可產(chǎn)生類似心交感神經(jīng)或迷 走神經(jīng)興奮時(shí)對(duì)心臟的作用。三、實(shí)驗(yàn)儀器】青蛙、常

2、用手術(shù)器械、蛙板（或蠟盤卜蛙心夾、計(jì)算機(jī)采集系統(tǒng)、張力傳感器、支架、雙 凹夾、雙針形露絲刺激電極、滴管、培養(yǎng)皿（或小燒杯）、棉線、任氏液。套管夾、0 65 % NaCl、2 % CaCl2、1% KCI、1 : 10000 腎上腺素、1 : 10000 乙酰肌堿、3% 孚L酸。四、方法與步驟】1、斯氏蛙心插管法（1）一只青蛙，雙毀髓后背位置于蠟盤中，按前面的方法暴露心臟。仔細(xì)識(shí)別心臟周圍的大血管（見右圖）。在左主動(dòng)脈下方穿一線，于動(dòng)脈圓錐處結(jié)扎（動(dòng)物個(gè)體小時(shí)，結(jié)扎位 置可靠上些）。再?gòu)淖笥覂芍鲃?dòng)脈下方穿一線，并打一活結(jié)備用。左手提起主動(dòng)脈上的結(jié)扎線，右手用眼科剪在結(jié)扎線下方、沿向心方向?qū)?dòng)脈上

3、壁剪一斜口。選擇大小適宜的蛙心套管，然后將盛有少量（套管內(nèi)23 cm高度）任氏液（內(nèi)加入一滴肝素溶液）的斯氏蛙心套 管，山開口處插入動(dòng)脈圓錐（見右圖）。當(dāng)套管尖端到達(dá)動(dòng)脈圓錐基部時(shí)，應(yīng)將套管稍稍后退，使尖端向動(dòng)脈圓錐的背部后下方及心尖方向推進(jìn)，經(jīng)主動(dòng)脈瓣插入心室腔內(nèi)（于心室收縮時(shí)插入,但不可插得過(guò)深，以免心室壁堵住套管下口）。此時(shí)可見套管中血液沖人套管，并使液面隨心臟搏動(dòng)而亡下移動(dòng)，表明操作成功（否則需退回并重新插入）。用滴管吸去套管中的血液，更換新鮮任氏液。穩(wěn)定住套管后，輕輕提起備用線，將左、右主動(dòng)脈連同插 入的套管用雙結(jié)扎緊（不得漏液）,再將結(jié)線固定在套管的小玻璃鉤上，然后剪斷結(jié)扎線上方的

4、血管。輕輕提起套管和心臟，看清靜脈竇的位置，于靜脈竇下方剪斷有牽連的組織，僅保留靜脈竇與心臟的聯(lián)系 ，使心臟離體（切勿損傷靜脈竇）。用任氏液反復(fù)沖洗心室內(nèi)余 血，使套管內(nèi)灌流液不再有殘留血液。保持套管內(nèi)液面高度一致（1.52 cm）,即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。（2）將插好離體心臟的套管固定在支架上，用蛙心夾夾住少許心尖部肌肉（不可夾得過(guò)多，以免因夾破心室而漏液）。再將蛙心夾上的系線繞過(guò)一個(gè)滑輪與張力傳感器相連（如右圖）。注意：勿使灌流液滴到傳感器上 。調(diào)節(jié)顯示器上心臟收縮曲線的幅度適中。2、實(shí)驗(yàn)觀察記錄正常心搏曲線（2）改用0. 65 % NaCI溶液灌流，并作好加藥標(biāo)記，觀察心搏變化。待曲線氏插管裝 置

5、出現(xiàn)明顯變化時(shí)，立即吸去套管中的灌流液，同時(shí)做好沖洗標(biāo)記，并用新鮮任氏液清洗2 3次，待心搏恢復(fù)正常。注意：換液時(shí)切勿碰套管，以免影響描記曲線的基線,同時(shí)保 持灌流液面一致（以下同）。觀察可得，NaCI溶液會(huì)阻遏心臟搏動(dòng)。(3) 迅速用新鮮任氏液清洗 23次，待心搏恢復(fù)正常。向套管內(nèi)加入 13滴2 % CaCI:溶液，觀察并記錄心搏曲線的變化 。當(dāng)出現(xiàn)明顯變化時(shí)，立即更換任氏液，待心搏 恢復(fù)正常(如果恢復(fù)遲緩,可多次沖洗)。同法向套管中加1 2滴1 % KCl溶液，記錄心搏曲線的變化。當(dāng)心搏曲線變化時(shí)， 同法更換灌流液，待心搏恢復(fù)正常。(5) 同法記錄套管中加入I2滴的腎上腺素溶液(1 : 1

6、0 000)后心搏曲線的變化。(6) 同法記錄套管中加入 1 2滴乙酰膽堿溶液(1 : 10 000)后心搏曲線的變化。(7) 同法記錄套管中加入I2滴的3%乳酸后心搏曲線的變化。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與原因分析 】 曲線的幅度收縮的程度曲線的密度心率曲線的基線舒張的程度1、正常收縮曲線圖2、滴加0.65%NaCI溶液圖分析：滴加0.65%NaCI溶液后，心跳減弱，這是由于用0.65%NaCI溶液灌注蛙心時(shí)，由于灌注液中缺乏 Ca2+ (),以致心肌細(xì)胞動(dòng)作電位2期內(nèi)流Ca2+減少，細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度減少，心肌的收縮活動(dòng)也隨之減弱3、滴加2%CaCI溶液分析：細(xì)胞外Ca2+在細(xì)胞膜上對(duì)Na +內(nèi)流有競(jìng)爭(zhēng)

7、性抑制作用，稱為膜屏障作用。Ca2 + 0增高時(shí)，Na +內(nèi)流受抑制，細(xì)胞0期除極速度與幅度減小，使興奮性及傳導(dǎo)性均降低 。 Ca2+ 0增高使Ca2+內(nèi)流增多，因此慢反應(yīng)細(xì)胞 0期去極化加快加強(qiáng)，傳導(dǎo)性增高，而快 反應(yīng)細(xì)胞平臺(tái)期縮短，有效不應(yīng)期縮短，復(fù)極加速。Ca2 +內(nèi)流增多，使心肌收縮能力增 強(qiáng)。Ca2 + o降低時(shí)，所引起的變化與高鈣時(shí)相反 。因此加入CaCl2后，心率減少、振幅減 少，基線上移。4、滴加1%KCI溶液分析：滴加1 % KCI后的心搏曲線發(fā)現(xiàn)，曲線的頻率逐漸減小，愈來(lái)愈疏，幅度逐漸 下降，最后停止在基線處，即心臟停博于舒張狀態(tài) 。因?yàn)楫?dāng)細(xì)胞 K+濃度增高時(shí)，K+與 Ca

8、2+有競(jìng)爭(zhēng)性拮抗作用，K+抑制細(xì)胞膜對(duì) Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)，使進(jìn)入細(xì)胞內(nèi) Ca2+減少，心肌 的興奮一收縮偶聯(lián)過(guò)程減弱，心肌收縮力降低。所以心搏曲線振幅減小。5、滴加1 : 10000腎上腺素溶液分析：滴加腎上腺素后，蛙心收縮增強(qiáng)，心臟舒張完全，描記的心搏曲線幅度明顯增大。其作用機(jī)理是，腎上腺素可與心肌細(xì)胞膜上的B受體結(jié)合，提高心肌細(xì)胞和肌漿網(wǎng)膜Ca2+通透性，導(dǎo)致肌漿中 Ca2+濃度增高，使心肌收縮增強(qiáng)。另外，腎上腺素還有降低肌鈣蛋白與Ca2+親和力，促使肌鈣蛋白對(duì) Ca2+的釋放速率增加，提高肌漿網(wǎng)膜攝取 Ca2+ 的速度，刺激Na+與Ca2+交換，使復(fù)極期向細(xì)胞外排出 Ca2+的作用加速，這

9、樣，將使心 肌舒張速度增快，整個(gè)舒張過(guò)程明顯增強(qiáng)。6、滴加1 : 10000乙酰膽堿溶液。其機(jī)理分析：上圖可示，蛙心收縮減弱，心率減慢，最后出現(xiàn)蛙心停止舒張階段為：乙酰膽堿與心肌細(xì)胞膜M受體結(jié)合，一方面提高心肌細(xì)胞膜K+通道的通透性，促使K+外流，將引起：1）竇房強(qiáng)細(xì)胞復(fù)極時(shí) K+外流增多，最大復(fù)極電位絕對(duì)值增大；Ik衰減 過(guò)程減弱，自動(dòng)除極速度減慢。這兩方面因素導(dǎo)致竇房自律性降低 ，心率減慢。2）復(fù)極過(guò) 程中K+外流增加，動(dòng)作電位2、3期縮短，Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)減少，使心肌收縮減弱；另一 方面乙酰膽堿可直接抑制 Ca2+通道，減少Ca2+內(nèi)流，進(jìn)而使心肌收縮減弱。7、滴加3%孚L酸溶液2期內(nèi)

10、流 Ca2+減少，細(xì)胞質(zhì)分析：H+與Ca2+的競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制，導(dǎo)致心肌細(xì)胞動(dòng)作電位Ca2+濃度減少，心肌的收縮活動(dòng)也隨之減弱六、注意事項(xiàng)】1. 制備蛙心標(biāo)本時(shí)，勿傷及靜脈竇。2. 上述各實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，一旦出現(xiàn)作用應(yīng)立即用正常任氏液換洗,以免心肌受損，而且必須待心搏恢復(fù)正常后方能進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。3. 盡量選用健壯、體大的雄性蟾蜍，手術(shù)過(guò)程中注意保護(hù)心臟，避免損傷。4. 實(shí)驗(yàn)中及時(shí)用任氏液沖洗心臟，待曲線恢復(fù)平穩(wěn)后再進(jìn)行下一步操作。5. 每次更換任氏液都必須保持灌流液液面高度恒定，以免因灌流量變化而影響結(jié)果。6. 嚴(yán)格控制每次藥品加入量，先加一滴，效果不明顯再加一滴。7. 吸滴瓶中的任氏液和吸蛙心套管內(nèi)溶液

11、的吸管應(yīng)區(qū)分專用，不可混淆使用，以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。七、討論】1.離體蛙心制備好后，有時(shí)候館內(nèi)的液面上下移動(dòng)很不明顯，是何原因？如何處理？答：離體蛙心制備好后，蛙心插管內(nèi)的液體應(yīng)隨蛙心室的收縮和舒張活動(dòng)而上下移動(dòng)。其實(shí)質(zhì)是：在心室收縮時(shí)，心室容積減少，室內(nèi)壓升咼，將心室內(nèi)的液體壓入插管 內(nèi)，管內(nèi)液面上升；在心室舒張的時(shí)候，心室容積增大，心室內(nèi)壓減少，將插管內(nèi)液體吸 入心室，管內(nèi)液面下降。但是有時(shí)候蛙心插管內(nèi)液面波動(dòng)不明顯，其主要原因是： 插管內(nèi)尖端出現(xiàn)血凝塊插管尖端不在心室腔內(nèi),而是在心房或者脈間結(jié)締組織等地方 插管進(jìn)入心室腔內(nèi)過(guò)深,以致尖端抵住了心室壁蛙心由于長(zhǎng)期心肌失血,導(dǎo)致活力下降2. 實(shí)

12、驗(yàn)過(guò)程中，為什么必須保持蛙心插管內(nèi)液面高度的恒定？液面過(guò)高或過(guò)低會(huì)產(chǎn)生怎樣的影響？答：在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，蛙心插管內(nèi)液面高度發(fā)生變化，心臟收縮曲線會(huì)相應(yīng)發(fā)生變化。心肌縮短幅度和速度受到前負(fù)荷和后負(fù)荷的影響。插管液面高度所產(chǎn)生的壓力，在心室舒 張期末期相當(dāng)于心肌的前負(fù)荷，心室開始收縮的時(shí)候，此液體所產(chǎn)生的壓力又成為心肌收 縮時(shí)的后負(fù)荷。故高度的改變，進(jìn)而引起的前后負(fù)荷的改變將改變心肌收縮的幅度和頻 率。當(dāng)液面過(guò)高時(shí)。心縮曲線幅度將降低。因?yàn)檫^(guò)高的液面，將使心室前負(fù)荷超過(guò)了最適 前負(fù)荷，將導(dǎo)致粗細(xì)肌絲過(guò)于疏遠(yuǎn) ，而導(dǎo)致收縮的潛力減少，心肌收縮不再增加或下降 。 而類似的，過(guò)高的后負(fù)荷，也使心肌收縮的幅度

13、和速度大大下降 。而當(dāng)液面過(guò)低時(shí)，心室 收縮的幅度也會(huì)減少。因?yàn)榍柏?fù)荷過(guò)小，將導(dǎo)致粗細(xì)肌絲過(guò)于接近，而導(dǎo)致收縮的潛力減 少，實(shí)際上，此時(shí)由于前負(fù)荷的減少導(dǎo)致心室收縮的效力的減少比前負(fù)荷增加而導(dǎo)致的還 有明顯。類似的，后負(fù)荷相應(yīng)的減少也會(huì)導(dǎo)致心室收縮的減弱。所以，在實(shí)驗(yàn)中保持最適的液面高度。是取得較好實(shí)驗(yàn)結(jié)果的前提 。3 .各種離子成分改變蛙心收縮的原理是什么？答：由于心肌細(xì)胞生物電活動(dòng)和收縮過(guò)程與離子密切相關(guān)，因此，細(xì)胞外液中離子濃度升高或降低均會(huì)影響到心肌的電生理特性和收縮性。(1) 鉀離子的影響K+與靜息電位的形成有關(guān)。細(xì)胞外液K+濃度K + o變化對(duì)心肌生理特性的影響較為復(fù)雜。高鉀：K

14、+ 0輕度或中度增高時(shí)，膜內(nèi)、夕卜K+濃度差減小，靜息電 位絕對(duì)值減小，與閾電位差距縮短，因此，興奮性增高。K + 0顯著升高時(shí)，由于靜息電 位絕對(duì)值減小過(guò)多(膜內(nèi)達(dá)-55mV左右)，Na +通道失活，因而興奮性降低甚至消失。另外，還使0期去極化速度和幅度減小，傳導(dǎo)性降低,導(dǎo)致興奮傳導(dǎo)減慢，甚至傳導(dǎo)阻滯。 此外，K + 0增高還可提高膜對(duì) K+的通透性，加速K+外流，動(dòng)作電位平臺(tái)期縮短，因 此，不應(yīng)期縮短。此外由于平臺(tái)期縮短，減少了 Ca2 +的內(nèi)流，加上細(xì)胞外K+與Ca2 +在 膜上有競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，導(dǎo)致心肌收縮功能減弱；(2) 鈣離子的影響 細(xì)胞外Ca2 +在細(xì)胞膜上對(duì) Na +內(nèi)流有競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，稱為膜屏障 作用。Ca2 + o增高時(shí)，Na +內(nèi)流受抑制，細(xì)胞0期除極速度與幅度減小，使興奮性及傳導(dǎo) 性均降低。Ca2+ o增高使Ca2 +內(nèi)流增多，因此慢反應(yīng)細(xì)胞 0期去極化加快加強(qiáng)，傳導(dǎo)性 增高，而快反應(yīng)細(xì)胞平臺(tái)期縮短，有效不應(yīng)期縮短，復(fù)極加速。Ca2 +內(nèi)流增多，使心肌收 縮能力增強(qiáng)。Ca2+ 0降低時(shí)，所引起的變化與高鈣時(shí)相反 。(3) 鈉離子的影響細(xì)胞外液中鈉濃度差梯度的變化一般對(duì)心肌活動(dòng)影響不明顯。只