質(zhì)粒小提試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

1、BIOMIGA質(zhì)粒小提試劑盒I簡(jiǎn)明步驟（PD1211）（詳細(xì)內(nèi)容請(qǐng)參考英文說(shuō)明書(shū)）I. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備II. 注意事項(xiàng)RNase A: 使用前將提供的所有RNase A瞬時(shí)離心后加入Buffer A1, 使用后將Buffer A1/RNase A置于4oC保存。 質(zhì)?？截悢?shù):純化中低拷貝的質(zhì)粒時(shí)，使用2倍的菌液體積，2倍的Buffer A1,B1,N1, 相同體積的Wash Buffer和Elution Buffer.轉(zhuǎn)化菌:若為-70oC甘油凍存的菌，請(qǐng)先涂布平板培養(yǎng)后，再重新挑選新的單個(gè)菌落進(jìn)行培養(yǎng)。切勿直接取凍存的菌種進(jìn)行培養(yǎng)。DNA Wash Buffer*: 使用前請(qǐng)將8 mL (PD1

2、211-00)或48 mL (PD1211-01)或216 mL (PD1211-02) or 90 mL (PD1211-03) 96-100% 乙醇加入DNA Wash Buffer。Buffer B1: 在低于室溫時(shí)會(huì)沉淀，請(qǐng)于50oC左右水浴加熱至沉淀完全溶解，溶液澄清，使用后保證Buffer B1瓶蓋旋緊。在室溫下（22-25oC）進(jìn)行所有離心操作。 III. 操作步驟1. 接種新鮮的單個(gè)菌落到1-5 mL的LB培養(yǎng)基（含適量抗生素），37oC震蕩培養(yǎng)14-16小時(shí)。室溫下10,000 x g離心1分鐘，收集菌體，并盡可能的吸去上清。注：殘留的液體培養(yǎng)基容易導(dǎo)致菌液裂解不充分，第5步

3、離心后沉淀較松，不能有效吸取上清。注：本說(shuō)明書(shū)中的操作程序適用于標(biāo)準(zhǔn)LB （Luria Bertani）培養(yǎng)基培養(yǎng)12-16 小時(shí)后，OD600（細(xì)菌密度）在2.0-3.0之間的菌液。若采用的是富集培養(yǎng)基，例如TB 或2YT，請(qǐng)注意保證OD600不超過(guò)3.0。 2. 加入250 L Buffer A1（確保已加入RNase A），用移液槍或渦流震蕩充分懸浮細(xì)菌細(xì)胞。 注：細(xì)菌細(xì)胞如果沒(méi)有充分懸浮均勻，將導(dǎo)致菌體裂解不完全，從而降低產(chǎn)量。3. 加入 250 L Buffer B1, 輕輕地反轉(zhuǎn)5-10 次以混合均勻，然后靜置2-5分鐘至溶液粘稠而澄清。 注：切勿劇烈振蕩。靜置時(shí)間不超過(guò)5分鐘，時(shí)

4、間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致基因組DNA污染或質(zhì)粒受到損傷。若溶液未清亮澄清，則表明菌體裂解不充分，應(yīng)加大Buffer B1的用量或減少菌體量。4. 加入350 L Buffer N1, 立即反轉(zhuǎn)多次，至溶液充分混勻，此時(shí)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。5. 將離心管轉(zhuǎn)至高速離心機(jī)，在室溫下13,000 rpm離心10分鐘（若上清中有白色沉淀，可再次離心）。6. 小心吸取離心后的上清液至帶有收集管的DNA柱中（避免吸起沉淀），室溫下13000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。7. 可選: 向DNA柱中加入 500 L Buffer KB, 室溫下13000 rpm 離心1分鐘，倒掉收集管中

5、的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。注：此步對(duì)富含內(nèi)源核酸酶的宿主菌（endA）來(lái)說(shuō)是必須的，如HB101, JM101, TG1等；對(duì)endA-來(lái)說(shuō)可省略，如Top 10和DH5a等，請(qǐng)參照英文說(shuō)明書(shū)第3頁(yè)的表2.8. 向離心柱中加入500 L DNA Wash Buffer（確保已加入無(wú)水乙醇），室溫下，13000 rpm 離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。可選步驟：重復(fù)步驟“8”。9. 將離心柱放回高速離心機(jī)中，13000 rpm室溫下開(kāi)蓋離心2分鐘，以徹底去除殘留的乙醇。注：此步驟中開(kāi)蓋離心將會(huì)更有效的去除殘留的乙醇，乙醇是否去除干凈將會(huì)影響最后的洗脫效率。1

6、0. 將離心柱轉(zhuǎn)至一個(gè)新的1.5 mL離心管中，向DNA柱的正中間加入50100 L（體積50 L）的ddH2O（pH在7.0-8.5之間）或Elution Buffer，室溫放置2分鐘，13000 rpm 離心1分鐘，洗脫質(zhì)粒DNA。注：提取到的質(zhì)粒DNA可直接用于基因克隆、測(cè)序、酶切、文庫(kù)篩選、體外轉(zhuǎn)錄翻譯、轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。若用于轉(zhuǎn)染內(nèi)毒素敏感性細(xì)胞株，原代細(xì)胞及用于微注射，建議去除內(nèi)毒素（PD1212）。IV. DNA濃度及純度DNA濃度(g/mL) = OD260 x 50 x 稀釋倍數(shù)，OD260/ OD280約為1.7-1.9V. 常見(jiàn)問(wèn)題及解答1、沒(méi)有提出質(zhì)?；蛘哔|(zhì)粒收獲量

7、很低A、菌種老化： 建議：對(duì)于甘油保存的菌種，需要先進(jìn)行活化。涂布或者劃線(xiàn)菌種，重新挑選單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，并對(duì)菌種進(jìn)行初搖活化，按照1：500的比例進(jìn)行菌種培養(yǎng)。二次培養(yǎng)細(xì)胞最好不要超過(guò)16小時(shí)。B、低拷貝質(zhì)粒： 建議：如果是由于低拷貝質(zhì)粒引起的質(zhì)粒收獲量低，可以采用兩倍的菌體量，并相應(yīng)增加各種Buffer的用量，如果必要，更換具有相同功能的高拷貝質(zhì)粒載體。C、質(zhì)粒丟失 建議：某些質(zhì)粒在多次繼代培養(yǎng)的過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)丟失的現(xiàn)象，另外檢查篩選抗生素的濃度是否正確。D、裂解不充分 建議：如果采用超過(guò)推薦量的菌體進(jìn)行質(zhì)粒制備，會(huì)導(dǎo)致菌體裂解不充分?？蛇m當(dāng)減少菌體的用量或者相應(yīng)增大各種Buffer的用量

8、。請(qǐng)根據(jù)選取的試劑盒，處理相應(yīng)量的細(xì)菌量。E、Buffer中有沉淀未溶解 建議：Buffer B1和Buffer N1在溫度較低時(shí)會(huì)出現(xiàn)沉淀，使用前請(qǐng)檢查是否有沉淀生成，如有沉淀生成，請(qǐng)置于37oC溫育片刻，待溶液澄清后使用。F、DNA Wash Buffer中未按要求加入乙醇 建議：按照說(shuō)明書(shū)要求加入要求量的無(wú)水乙醇，使用后旋緊瓶蓋，防止乙醇揮發(fā)。G、離心柱中乙醇?xì)埩?建議：漂洗后，可適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間，已盡量去除殘留的乙醇。另外對(duì)于質(zhì)粒中提，大提和超大量提取，建議離心后，將柱子或大漏斗用吹風(fēng)機(jī)冷風(fēng)吹片刻，以徹底去除殘留的乙醇，便于洗脫和后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。E、洗脫液加入位置不正確， 建議：洗脫液應(yīng)

9、加在膜中央，已取得最好的洗脫效果。F、洗脫液pH值不正確 建議：將DNA從柱子上洗脫下來(lái)的最適pH值在7.08.5之間，如果洗脫液的pH超出此范圍將會(huì)顯著影響洗脫效果，請(qǐng)使用試劑盒配套的Elution Buffer（pH 8.5，10mMTris-HCl）進(jìn)行洗脫，如果用ddH2O進(jìn)行洗脫，請(qǐng)確保pH在7.08.5之間。G、洗脫體積及時(shí)間的選擇 建議：洗脫體積將會(huì)影響最終的收獲量，洗脫體積越大，收獲量越高，但是濃度將會(huì)降低。請(qǐng)使用試劑盒推薦的洗脫體積進(jìn)行洗脫，以保證最好的收獲量和濃度。如果需要高濃度的質(zhì)粒，請(qǐng)減少洗脫體積。另外，如果想收獲高濃度高收獲量的質(zhì)粒，可進(jìn)行二次洗脫。 建議：加入洗脫Buffer后，室溫放置25分鐘，更有利于洗脫。2、質(zhì)粒純度不高A、蛋白質(zhì)污染OD260/ OD2801.9 建議：檢查配送的RNase A是否完全加入到Buffer A1中，加入RNase A后，Buffer A1/RNase A應(yīng)該存放在4oC，如果存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，或者沒(méi)有正確存放，請(qǐng)重新加入RNase A