一種基于檢驗(yàn)朊病毒病中PrPsc復(fù)制模式的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1、一種基于檢驗(yàn)朊病毒病中PrP sc復(fù)制模式的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1袁輝純南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院,湖南衡陽(421001E-mail:yuanhuichun2007摘要:本文所述及的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的主要原理是:通過對蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行同位素標(biāo)記,獲得一級結(jié)構(gòu)被精確標(biāo)記的示蹤蛋白質(zhì),從而可以對示蹤蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的修飾和加工的變化進(jìn)行精確的檢測和識別。選擇特定的氨基酸進(jìn)行同位素標(biāo)記,獲得該種氨基酸全部被標(biāo)記的蛋白質(zhì),可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的精確標(biāo)記;通過對待測蛋白質(zhì)及其特定氨基酸進(jìn)行精確的定量分析,可區(qū)分對感染動物補(bǔ)給的標(biāo)記性的示蹤蛋白質(zhì)和感染動物自身合成的蛋白質(zhì)。分析實(shí)驗(yàn)獲得的相關(guān)數(shù)據(jù),可以確定蛋白質(zhì)的來源,從而為檢測Pr

2、P sc復(fù)制模式提供了科學(xué)的依據(jù)。該實(shí)驗(yàn)在理論上能夠較準(zhǔn)確地檢驗(yàn)朊病毒病發(fā)生過程中PrP c-PrP sc復(fù)制模式存在與否,從而為朊病毒病的致病因子和致病機(jī)制的研究提供可靠的依據(jù)。關(guān)鍵詞:朊病毒病,PrP c ,PrP sc,復(fù)制模式,同位素標(biāo)記,定量分析1.引言可傳播性海綿狀腦病(TSE是一類侵襲人類及多種動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性腦病。關(guān)于其感染因子的研究,人們提出了諸多假說,目前最為盛行的是朊病毒學(xué)說。該學(xué)說認(rèn)為:感染因子是一種不含核酸,具有自我復(fù)制能力的感染性蛋白粒子-朊病毒(Prion,亦稱PrP sc,PrP sc是TSE致病的主要組成部分,甚至唯一感染因素1。在實(shí)驗(yàn)室中,人們發(fā)現(xiàn)宿

3、主細(xì)胞的一條染色體上含有一個(gè)基因,它編碼的蛋白質(zhì)與朊病毒類似,這種蛋白質(zhì)的產(chǎn)生是正常的,且多數(shù)存在于神經(jīng)元中,這種蛋白質(zhì)也稱PrP c, PrP c與PrP sc在多肽鏈的一級結(jié)構(gòu)上是相同的,由于兩種蛋白質(zhì)的折疊方式不同,導(dǎo)致生物學(xué)作用的明顯差異。在Prion感染過程中,正常的蛋白質(zhì)PrP c和異常的蛋白質(zhì)PrP sc分子間的相互作用被認(rèn)為是產(chǎn)生新的PrP sc的關(guān)鍵步驟,并由此提出了PrP sc復(fù)制模式。復(fù)制模式的基礎(chǔ)是由PrP c-PrP sc途徑生成新的PrP sc,其對TSE的致病過程的描述為:PrP c固定在磷脂酰肌醇多聚糖細(xì)胞膜上;感染因子PrP sc與PrP c 相結(jié)合,導(dǎo)致Pr

4、P c釋放,PrP c轉(zhuǎn)化為PrP sc;細(xì)胞又合成新的PrP c,開始下一個(gè)循環(huán);PrP sc被神經(jīng)細(xì)胞攝入和聚集導(dǎo)致海綿化1。朊病毒學(xué)說雖然是很有說服力的理論,但是目前還沒有精確的試驗(yàn)?zāi)軌蜃C明這種復(fù)制模式存在于感染動物體內(nèi)。也沒有證據(jù)說這種復(fù)制模式就是朊病毒病的主要致病機(jī)制。而且,在其他很多中樞神經(jīng)退行性腦病中,如Alzhemer癥, Parkinson病,雷諾小體病等,也有蛋白質(zhì)異常聚集這一現(xiàn)象,其病理過程和臨床表現(xiàn)上與朊病毒病非常相似。為什么不認(rèn)為這些疾病的蛋白質(zhì)也有復(fù)制能力呢?如果僅憑蛋白質(zhì)具有傳染性就斷定蛋白質(zhì)可以復(fù)制能力,這是缺乏科學(xué)依據(jù)的。由于朊病毒不僅能夠簡單地利用宿主的酶系

5、統(tǒng),還在一定程度上使正常的宿主基因產(chǎn)生更多的拷貝的病原蛋白質(zhì)2,因此,當(dāng)我們能夠證明朊病毒致病過程中復(fù)制模式不存在時(shí),我們可以得到這樣的假想:病原蛋白質(zhì)PrP sc可以通過某種特殊的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方式,干擾蛋白質(zhì)合成和修飾的信息傳遞,從而從基因水平調(diào)控病原蛋白質(zhì)的合成。也就是說,病原蛋白質(zhì)PrP sc作用的位點(diǎn)不是PrP c,而是其他的某個(gè)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子,暫將此假想稱為蛋白質(zhì)干擾假說。2. 實(shí)驗(yàn)方法2.1 實(shí)驗(yàn)的理論基礎(chǔ)該實(shí)驗(yàn)是在將同位素標(biāo)記和蛋白質(zhì)定量分析相結(jié)合的基礎(chǔ)上進(jìn)行的蛋白質(zhì)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)的核心思想是通過對蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)3進(jìn)行同位素標(biāo)記,可以對蛋白質(zhì)在體內(nèi)的修飾加工后的變化進(jìn)行精確的檢測。該

6、試驗(yàn)不僅能對蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析,而且能對目前的體內(nèi)蛋白質(zhì)示蹤實(shí)驗(yàn)方法中無法避免的假陽性結(jié)果予以分辨。通過選擇特定的氨基酸進(jìn)行同位素標(biāo)記,獲得該種氨基酸全部被標(biāo)記的蛋白質(zhì),可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的精確標(biāo)記。通過對特定氨基酸和蛋白質(zhì)進(jìn)行精確的定量分析,可區(qū)分對感染動物補(bǔ)給的標(biāo)記性蛋白質(zhì)和感染動物自身合成的蛋白質(zhì)。通過實(shí)驗(yàn)獲得的相關(guān)數(shù)據(jù),可以分析蛋白質(zhì)的來源,從而為檢測PrP sc復(fù)制模式提供了科學(xué)的依據(jù)。實(shí)驗(yàn)包括五個(gè)基本過程:對某一特定種類的氨基酸進(jìn)行同位素標(biāo)記、通過生物合成方法得到一級結(jié)構(gòu)被精確標(biāo)記的標(biāo)記性蛋白質(zhì)、對感染模型的動物補(bǔ)給標(biāo)記性蛋白質(zhì)、試驗(yàn)動物發(fā)病后定量分析體內(nèi)標(biāo)記性蛋白質(zhì)、對蛋

7、白質(zhì)及其氨基酸定量分析后用統(tǒng)計(jì)學(xué)理論判定蛋白質(zhì)在體內(nèi)變化過程。該實(shí)驗(yàn)在理論上能夠較準(zhǔn)確地檢驗(yàn)朊病毒病發(fā)生過程中PrP sc復(fù)制模式存在與否。實(shí)驗(yàn)方法是:將正常蛋白質(zhì)PrP c 中某一種氨基酸全部用同位素進(jìn)行標(biāo)記,這樣就可以實(shí)現(xiàn)對該蛋白質(zhì)進(jìn)行精確的示蹤。對Prion感染的動物補(bǔ)給能精確示蹤的PrP c,實(shí)驗(yàn)動物發(fā)病后,提取病變腦組織中的PrP sc,檢測新生成的PrP sc 是否含有由已標(biāo)記的PrP c轉(zhuǎn)化而來的PrP sc,并分析PrP c補(bǔ)給量的變化對復(fù)制途徑產(chǎn)生PrP sc 量的影響,最終確定PrP c-PrP sc途徑是否存在。由于該實(shí)驗(yàn)對蛋白質(zhì)及氨基酸的提純和定量分析技術(shù)及同位素靈敏度

8、有很高的要求,該該方案目前面臨的最大的問題是技術(shù)條件的限制。因此,技術(shù)的改進(jìn)是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的前提。實(shí)驗(yàn)為在實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)進(jìn)行蛋白質(zhì)示蹤實(shí)驗(yàn)提供了較精確的方法,將有利于對其他因體內(nèi)蛋白質(zhì)異常聚集導(dǎo)致的疾病的研究。2.1.1 將PrP c-PrP sc途徑生成的PrP sc進(jìn)行標(biāo)記,是對PrP sc進(jìn)行定性和定量分析的前提。要證明感染動物體內(nèi)存在PrP c-PrP sc途徑,我們要從病變組織內(nèi)提取并識別由該途徑生成的PrP sc,因而要對這一途徑生成的PrP sc進(jìn)行標(biāo)記。在PrP c-PrP sc轉(zhuǎn)化過程中蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化,我們對PrP c的一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行標(biāo)記即可達(dá)到目的。對Prion感染的動

9、物補(bǔ)給精確標(biāo)記的PrP c后,提取得到的PrP sc可能來源于兩條途徑:一是復(fù)制途徑:如果PrP c -PrP sc途徑存在,那么PrP sc可由標(biāo)記的PrP c轉(zhuǎn)化而來。其一級結(jié)構(gòu)標(biāo)記情況與標(biāo)記的PrP c 完全一致,但我們應(yīng)該知道,該途徑生成的PrP sc量還與PrP c補(bǔ)給量的大小及生物活性有關(guān),而且應(yīng)該占PrP sc總量的很少一部分,因?yàn)槠渌牟糠挚捎杉?xì)胞生成的PrP c轉(zhuǎn)化而來;二是自身合成途徑:這種途徑的PrP sc是在基因水平調(diào)控生成的,而不是復(fù)制模式產(chǎn)生的。大量的PrP sc 入侵也可能會干擾細(xì)胞中蛋白質(zhì)的加工和修飾的信息傳遞,由于信息的異常傳遞,使PrP c不能準(zhǔn)確折疊而直接

10、形成異常的蛋白質(zhì)PrP sc。這一想法目前雖然沒有證據(jù),但如果實(shí)驗(yàn)結(jié)果是證明PrP c-PrP sc途徑不存在,那么這種猜想就有很大的可能了。2.1.2 假陽性結(jié)果的識別是決定試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素由于該試驗(yàn)是在感染動物體內(nèi)進(jìn)行的試驗(yàn),蛋白質(zhì)的合成代謝和分解代謝造成假陽性結(jié)果不可避免。我們在制定標(biāo)記PrPc的方案時(shí)要充分考慮怎樣識別假陽性結(jié)果。假陽性結(jié)果產(chǎn)生原因:對實(shí)驗(yàn)動物補(bǔ)給被標(biāo)記的PrP c(通常標(biāo)記在氨基酸上,PrP c被體內(nèi)的蛋白酶水解為氨基酸,被標(biāo)記的氨基酸游離到體內(nèi),被細(xì)胞攝取后重新生成PrP c,再轉(zhuǎn)化為PrP sc,從而生成被標(biāo)記的PrP sc,這一路徑的PrP sc形成假陽

11、性結(jié)果。而且隨著標(biāo)記的 PrP c補(bǔ)給量的增加,假陽性結(jié)果也會增加。因此,僅憑對同位素標(biāo)記的分析不能識別假陽性結(jié)果,以致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。如果我們在同位素標(biāo)記的基礎(chǔ)上,采用定量標(biāo)記的方法,問題就能得到很好的解決。定量標(biāo)記:讓PrP c分子中某一種類氨基酸全部被同位素標(biāo)記,即達(dá)到了對氨基酸定量標(biāo)記,使結(jié)果分析直觀而簡便。實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)通過從頭合成途徑,很難讓PrP sc分子中某一類氨基酸全部被標(biāo)記,我們只要分析半標(biāo)記的PrP sc分子的含量,即可了解假陽性結(jié)果。2.1.3 試驗(yàn)結(jié)果的分析與校準(zhǔn)提取病變腦組織的PrP sc分子,進(jìn)行分類并測定其含量。 PrP sc分子的分類(見表1:根據(jù)是否含有被同位

12、素標(biāo)記的氨基酸,可分為標(biāo)記的PrP sc分子和未被標(biāo)記的PrP sc分子;根據(jù)標(biāo)記是否完全,可分為完全標(biāo)記和半標(biāo)記;根據(jù)來源,分復(fù)制途徑和自身合成途徑;按真假陽性結(jié)果分類,分為陽性,假陽性,陰性表1 發(fā)病后提取的PrP sc分類是否標(biāo)記標(biāo)記程度合成途徑結(jié)果標(biāo)記完全標(biāo)記PrP c-PrP sc轉(zhuǎn)化途徑陽性自身合成途徑* 假陽性部分標(biāo)記自身合成途徑假陽性未標(biāo)記未標(biāo)記自身合成途徑陰性* 當(dāng)PrP c補(bǔ)給量達(dá)到極量時(shí),從頭合成途徑的為完全標(biāo)記的PrP sc分子分析假陽性的方法:僅利用同位素標(biāo)記示蹤方法不能分辨單個(gè)PrP sc分子中的特定氨基酸是否被完全標(biāo)記,因此不能直接檢測到假陽性結(jié)果。我們可通過對被

13、標(biāo)記的特定氨基酸定量分析,了解假陽性。步驟:測定被標(biāo)記的PrP sc的量,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)情況下特定種類氨基酸被標(biāo)記的量.得到標(biāo)準(zhǔn)量(標(biāo)準(zhǔn)情況是指假設(shè)被標(biāo)記的PrP sc均為完全標(biāo)記。通過物理方法將PrP sc 水解為單個(gè)氨基酸,對被標(biāo)記的特定種類氨基酸進(jìn)行定量分析,測定量的數(shù)值為實(shí)際量。比較標(biāo)準(zhǔn)量與實(shí)際量的差值,即可了解半標(biāo)記的PrP sc和全標(biāo)記的PrP sc。全標(biāo)記的PrP sc基本上可以認(rèn)為是由補(bǔ)給的已標(biāo)記的PrP c轉(zhuǎn)化而來的。2.1.4 試驗(yàn)結(jié)果的精準(zhǔn)性分析首先,我們選擇補(bǔ)給正常的標(biāo)記性蛋白質(zhì)PrP c,因此對實(shí)驗(yàn)動物的影響較小。我們需要檢測的異常蛋白質(zhì)完全是感染動物在發(fā)病過程中生成的,這

14、可以有效地避免誤差。其次,補(bǔ)給的標(biāo)記性蛋白質(zhì)PrP c和感染動物合成的PrP c可以準(zhǔn)確地分辨,因?yàn)闃?biāo)記性蛋白質(zhì)PrP c的一級結(jié)構(gòu)是被精確標(biāo)記的。而感染動物合成的PrP c沒有同位素標(biāo)記,或者是標(biāo)記不完全(蛋白質(zhì)分解代謝和合成代謝導(dǎo)致的標(biāo)記性氨基酸重復(fù)利用。最后,我們可以從數(shù)學(xué)理論上證明結(jié)果數(shù)據(jù)的精準(zhǔn)性。測量標(biāo)記的異常蛋白質(zhì)的量,就可以計(jì)算出被標(biāo)記的特定氨基酸的量得到理論值:因?yàn)槔碚撋戏彩菢?biāo)記的的異常蛋白質(zhì)均應(yīng)該是來源于補(bǔ)給的正常蛋白質(zhì)。再將標(biāo)記的異常蛋白質(zhì)PrP sc水解為單個(gè)氨基酸,測量特定氨基酸的實(shí)際量。比較實(shí)際量和理論值,就可以得到不完全標(biāo)記的PrP sc,從而檢測到假陽性結(jié)果。2.

15、1.5 確定檢驗(yàn)指標(biāo)要檢驗(yàn)PrP c-PrP sc途徑是否存在,有以下三個(gè)重要參考:測定PrP c-PrP sc轉(zhuǎn)化途徑生成得PrP sc的量;用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法分析并獲得PrP c補(bǔ)給量的有效量、誤差量、極量,比較有效量與極量的大小關(guān)系(如果PrP c-PrP sc轉(zhuǎn)化途徑不存在,有效量與極量幾乎相等。表2 試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)表組數(shù)PrP PrP生存期(TN 補(bǔ)給量(A完全標(biāo)記(B 部分標(biāo)記(C 未標(biāo)記(D 感染組對照組1 A1 B1 C1 D1 Ta1 Tb12 A2 B2 C2 D2 Ta2 Tb23 A3 B3 C3 D3 Ta3 Tb3 n An Bn Cn Dn Tan TbnPrP c補(bǔ)

16、給量的有效量:當(dāng)完全標(biāo)記的PrP sc在某一組(N剛好達(dá)到參考量(B時(shí),該組所對應(yīng)的PrP c補(bǔ)給量(APrP c補(bǔ)給量的誤差量:當(dāng)部分標(biāo)記的PrP sc在某一組(N剛好達(dá)到參考量(B時(shí),該組所對應(yīng)的PrP c補(bǔ)給量(APrP c補(bǔ)給量的極量:隨著N的增大,D值明顯減少時(shí)對應(yīng)的PrP c補(bǔ)給量(A在實(shí)際實(shí)驗(yàn)的操作中,可用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法得出參考量及三個(gè)參考值,以獲得更有說服力的證據(jù).由于統(tǒng)計(jì)學(xué)對數(shù)據(jù)的分析,需要結(jié)合具體的實(shí)驗(yàn)操作方式,而本文描述的只是一套實(shí)驗(yàn)方案,因此在此就不述及統(tǒng)計(jì)學(xué)對數(shù)據(jù)的處理方法了。生存期(T作為輔助的參考,可觀察補(bǔ)給正常蛋白質(zhì)對感染組和試驗(yàn)組的影響。3. 氨基酸同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)

17、的基本步驟3.1 對特定氨基酸進(jìn)行同位素標(biāo)記特定種類的氨基酸必須具備的條件:實(shí)驗(yàn)應(yīng)該選擇不發(fā)生轉(zhuǎn)氨基作用的必需氨基酸3。原因:為了使PrP c分子中的某一類氨基酸全部被標(biāo)記,使用必需氨基酸可以使氨基酸的來源唯一,從而提高標(biāo)記的效率。要求不發(fā)生轉(zhuǎn)氨基作用,是為了避免轉(zhuǎn)氨基導(dǎo)致氨基酸種類的變化,給PrP c分子標(biāo)記和待測PrP sc分析帶來不必要的誤差。再對特定種類氨基酸的提純并進(jìn)行同位素標(biāo)記。3.2 對PrP c分子進(jìn)行定量標(biāo)記定量標(biāo)記的目的是使結(jié)果分析準(zhǔn)確。由于同一種蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)是相同的,所以其構(gòu)成的各種氨基酸含量是可測和一致的。生物合成途徑合成包括可用動物飼養(yǎng)、組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)、基因重

18、組等方法獲得特定種類氨基酸全部被標(biāo)記PrP c分子。該試驗(yàn)用組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)可以快捷地獲得結(jié)果,且誤差較小.但技術(shù)要求高.通過動物培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)需要的時(shí)間較長,誤差大,但技術(shù)要求較低.本文選擇動物培養(yǎng)方法,可以比較直觀地描述實(shí)驗(yàn)原理和過程.獲得提純的PrP c分子,要求不破壞PrP c分子生物學(xué)功能。3.3 建立感染動物模型及分析PrP sc的來源3.3.1 建立感染動物模型由于表達(dá)倉鼠PrP c基因的轉(zhuǎn)基因小鼠TgSHaPrP對倉鼠朊病毒株敏感,并產(chǎn)生與倉鼠類似的中樞神經(jīng)系統(tǒng)改變。我們可選擇外源性PrP表達(dá)水平高的小鼠作為實(shí)驗(yàn)動物,可縮短接種后的潛伏期1。設(shè)感染組(A和對照組(B,每組各分N小

19、組,分別為A1 A2 A3 .An 及B1 B2 B3 .Bn。A組用相同劑量(劑量很小的感染因子感染,B組對照觀察。隨n值的不同給與不同劑量的PrP c (補(bǔ)給劑量,補(bǔ)給途徑,補(bǔ)給方法待定3.3.2記錄生存期3.3.3 提取感染組腦組織中的PrPsc動物飼養(yǎng)一段時(shí)間后,待感染組發(fā)病,提取病變腦組織中。對PrP sc總量進(jìn)行定量分析。3.3.4 檢測假陽性結(jié)果,區(qū)分并定量分析被標(biāo)記的PrPsc和未標(biāo)記的PrPsc檢測假陽性結(jié)果方法:第一步:計(jì)算特定氨基酸的理論標(biāo)準(zhǔn)量:只要PrP sc 中有特定氨基酸被標(biāo)記,不管是否全部被標(biāo)記,我們暫假設(shè)PrP sc 均為完全標(biāo)記。通過測定被標(biāo)記的PrP sc

20、的量,就能計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)情況下(標(biāo)準(zhǔn)情況是指假設(shè)被標(biāo)記的PrP sc均為完全標(biāo)記特定種類氨基酸被標(biāo)記的量,得到特定氨基酸的理論標(biāo)準(zhǔn)量。第二步:測量被標(biāo)記的特定氨基酸的實(shí)際量:用物理方法將PrP sc水解為單個(gè)氨基酸,對特定種類氨基酸進(jìn)行定量分析,測定量的數(shù)值為特定氨基酸實(shí)際量。比較標(biāo)準(zhǔn)量與實(shí)際量的差值,即可了解全標(biāo)記或半標(biāo)記的PrP sc的實(shí)際量。全標(biāo)記的PrP sc可以認(rèn)為是由補(bǔ)給的已標(biāo)記的PrP c轉(zhuǎn)化而來的.第三步:綜合分析,確定補(bǔ)給量的有效量和極量的關(guān)系。檢驗(yàn)全標(biāo)記的PrP sc是否存在假陽性(超過極量后會出現(xiàn)感染動物自身合成的全標(biāo)記的PrP sc3.3.4檢驗(yàn)指標(biāo)及結(jié)果討論若PrP sc復(fù)

21、制模式存在:則可檢測到有參考價(jià)值的全標(biāo)記的PrP sc, 全標(biāo)記的PrP sc與補(bǔ)給量成正比;PrP c補(bǔ)給量的有效量明顯大于極量若復(fù)制模式不存在:全標(biāo)記的PrP sc不達(dá)到具有判斷意義的量;PrP c補(bǔ)給量的有效量與極量相近或相等。3.3.5 生存期的意義PrP c補(bǔ)給量的的增大,試驗(yàn)組的生存期不變甚至延長4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析通過試驗(yàn)所得的結(jié)果,復(fù)制模式是否存在這正反兩個(gè)結(jié)論的確定均對進(jìn)一步了解朊病毒病有重大意義。該實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驕?zhǔn)確地判斷朊病毒病發(fā)生過程中PrP sc復(fù)制模式存在與否,達(dá)到檢驗(yàn)朊病毒學(xué)說是否正確的目的。如果PrP sc復(fù)制模式存在,那么朊病毒學(xué)說的正確性是不容質(zhì)疑的,從而消除人們一直

22、以來TSE因子的本質(zhì)問題的爭議。如果PrP sc復(fù)制模式不存在,那么本文提出的蛋白質(zhì)干擾假說便得到一定程度的支持。提出蛋白質(zhì)干擾假說的理由:第一:Prion病的發(fā)生具有家族遺傳性,因此PrP sc完全可以通過基因水平的調(diào)控而致病。一種疾病、一個(gè)致病因子以兩種完全不同的致病方式導(dǎo)致疾病的發(fā)生,使朊病毒學(xué)說可疑。第二:朊病毒學(xué)說的大多數(shù)證據(jù),都是支持蛋白質(zhì)干擾假說的依據(jù)。朊病毒學(xué)說的不足,可以用蛋白質(zhì)干擾假說來解釋。如解釋“毒株樣”的存在,可認(rèn)為是信號受體與不同結(jié)構(gòu)的病原蛋白質(zhì)親和力大小不同。第三:在其他很多中樞神經(jīng)退行性腦病中,也有蛋白質(zhì)異常聚集這一現(xiàn)象,其病理過程和臨床表現(xiàn)上與朊病毒病非常相似

23、。為什么不認(rèn)為這些疾病的蛋白質(zhì)也有復(fù)制能力呢?如果僅憑蛋白質(zhì)具有傳染性就斷定蛋白質(zhì)可以復(fù)制能力,而沒有精確的試驗(yàn)證實(shí),是缺乏科學(xué)依據(jù)的。第四:本文所設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn),在理論上能夠準(zhǔn)確地檢驗(yàn)朊病毒學(xué)說中PrP sc復(fù)制模式存在與否,實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以間接地檢驗(yàn)蛋白質(zhì)干擾假說是否正確。 5 結(jié)論 如果通過試驗(yàn)可以證實(shí) PrPsc 復(fù)制模式在病變過程中是存在的.可為 prion 學(xué)說的蛋白質(zhì) 唯一理論提供了重要依據(jù)。如果通過試驗(yàn)不能檢測到由 PrPc-PrPsc 途徑生成的 PrPsc，則說明 在體內(nèi) PrPsc 復(fù)制模式可能性小,甚至不存在。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以間接地檢驗(yàn)蛋白質(zhì)干擾假說。本 文所述及的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的

24、標(biāo)記和分析方案， 可以為蛋白質(zhì)定性定量分析及監(jiān)測蛋白質(zhì)在 生物體內(nèi)修飾和加工過程提供更精確的方法。 參考文獻(xiàn) 1 黃文林.分子病毒學(xué).北京-人民衛(wèi)生出版社 2 楊文博等譯.微生物生物學(xué).北京-科學(xué)出版社 3 周愛儒.生物化學(xué).第 6 版.北京-人民衛(wèi)生出版社 A Test Prion Disease PrPsc Replication Model Experimental Design Yuan Huichun Nanhua University School of Medicine，Hengyang，Hunan（421001） Abstract The experiment described in this paper, through th