常量肉湯稀釋法

1、常量肉湯稀釋法抗菌藥物貯存液制備抗菌藥物貯存液濃度不應(yīng)低于1000g/ml( 如 1280 g/ml) 或 10 倍于最高測定濃度。 溶解度低的抗菌藥物可稍低于上述濃度。 抗菌藥物直接購自廠商或相關(guān)機構(gòu)。所需抗菌藥物溶液量或粉劑量可公式進(jìn)行計算。例如：需配制 100 ml 濃度為 1280g/ml 的抗生素貯存液，所用抗生素為粉劑，其藥物的有效力為 750 g/mg。用分析天平精確稱取抗生素粉劑的量為 mg。根據(jù)公式計算所需稀釋劑用量為：（ mg×750 g/ml ） /1280 g/ml= ，然后將 mg抗生素粉劑溶解于稀釋劑中。制備抗菌藥物貯存液所用的溶劑和稀釋劑見表5。配制好的

2、抗菌藥物貯存液應(yīng)貯存于 -60 以下環(huán)境，保存期不超過 6 個月。藥敏試驗用抗菌藥物濃度范圍 根據(jù) NCCLS抗菌藥物敏感性試驗操作標(biāo)準(zhǔn)，藥物濃度范圍應(yīng)包含耐藥、中介和敏感分界點值，特殊情況例外。培養(yǎng)基 NCCLS推薦使用 Mueller-Hinton （MH）肉湯， 。需氧菌及兼性厭氧菌在此培養(yǎng)基中生長良好。 在測試葡萄球菌對苯唑西林的敏感性時， 應(yīng)在肉湯中加入 2%（ W/V）氯化鈉，按制造廠家的要求配制需要量的 MH肉湯。嗜血桿菌屬菌使用 HTM肉湯，肺炎鏈球菌和其它鏈球菌使用含 2%5%溶解馬血的 MH肉湯。接種物的制備 有 2 種方法配制接種物，一是細(xì)菌生長方法，用接種環(huán)挑取形態(tài)相似

3、待檢菌落 3-5 個，接種于 4-5ml 的水解酪蛋白（ MH）肉湯中，35孵育 2-6h 。增菌后的對數(shù)生長期菌液用生理鹽水或 MH肉湯校正濃度至麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，約含12× 108CFU/ml。二是直接菌落懸液配制法，對某些苛養(yǎng)菌，如流感嗜血桿菌、淋病奈瑟菌和鏈球菌及甲氧西林耐藥的葡萄球菌等菌株，推薦直接取培養(yǎng)1824h 的菌落調(diào)配成麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液。用MH肉湯將上述菌懸液進(jìn)行1100 稀釋后備用。注意應(yīng)在15 分鐘內(nèi)接種完配制好的接種物，并取一份接種物在非選擇性瓊脂平板上傳代培養(yǎng)，以檢查接種物純度。稀釋抗菌藥物的制備及菌液接種取無菌試管（ 13×100mm）13 支，

4、排成一排，除第 1 管加入肉湯外，其余每管加入 MH肉湯 1ml，在第 1 管加入抗菌藥物原液（如 1280g/ml ） 混勻，然后吸取 1ml 至第 2 管，混勻后再吸取 1ml 至第 3 管，如此連續(xù)倍比稀釋至第 11 管，并從第 11 管中吸取 1ml 棄去，第 12 管為不含藥物的生長對照。此時各管藥物濃度依次為256、128、64、32、16、8、4、2、1、 g/ml 。然后在每管內(nèi)加入上述制備好的接種物各 1ml，使每管最終菌液濃度約為 5×105CFU/ml。第 1 管至第 11 管藥物濃度分別為 128、64、32、16、8、4、2、1、05、 g/ml 。孵育 將

5、接種好的稀釋管塞好塞子， 置 35普通空氣孵箱中孵育1620h；嗜血桿菌和鏈球菌在普通空氣孵箱中孵育2024h；對可能的耐甲氧西林葡萄球菌和耐萬古霉素腸球菌應(yīng)持續(xù)孵育滿24h。結(jié)果判斷與解釋在讀取和報告所測試菌株的MIC 前，應(yīng)檢查生長對照管的細(xì)菌生長情況是否良好， 同時還應(yīng)檢查接種物的傳代培養(yǎng)情況以確定其是否污染，質(zhì)控菌株的 MIC值是否處于質(zhì)控范圍。以肉眼觀察，藥物最低濃度管無細(xì)菌生長者，即為受試菌的 MIC。甲氧芐胺嘧啶或磺胺藥物的肉湯稀釋法終點判斷，與陽性生長對照管比較抑制80%細(xì)菌生長管藥物濃度為受試菌MIC。根據(jù) NCCLS推薦的分界點值標(biāo)準(zhǔn)，判斷耐藥（resistant,R）、敏感 (susceptible,S) 或中介（ intermediate, I ）。 S 表示被測菌株所引起的感染可以用該抗菌藥物的常用劑量治療有效，禁忌癥除外。 R 指該菌不能被抗菌藥物的常用劑量在組織液內(nèi)或血液中所達(dá)到的濃度所抑制，或?qū)儆诰哂刑囟退帣C理（如 - 內(nèi)酰胺酶），所以臨床治療效果不佳。 I 是指 MIC接近藥物的血液或組織液濃度，療效低于敏感菌。 還表示被測