魚腥草素衍生物對(duì)TNFα誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞Synde

1、魚腥草素衍生物對(duì)TNF誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞Syndecan4 表達(dá)的影響                                     作者：王峰,歐陽平,左 琦,彭文烈, 貝偉劍，張建興,賴文巖,許頂立【摘要】 

2、目的 觀察一種魚腥草素衍生物(houttuyfonate derivative, HD)對(duì)腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor , TNF)誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)增殖及Syndecan4 表達(dá)的影響。方法 以終濃度分別為TNF 20 ng/mL、HD 4 g/mL、HD 8 g/mL、TNF20 ng/mL+HD 4 g/mL及TNF 20 ng/mL+HD 8 g/mL對(duì)體外培養(yǎng)的VSMCs作用24 h，并設(shè)立相關(guān)對(duì)照組，用MTS/PMS法檢測(cè)VSMCs的增殖，用Western blot蛋白免疫印

3、跡法測(cè)定Syndecan4 的表達(dá)情況。結(jié)果 與對(duì)照組相比，HD各劑量組單獨(dú)應(yīng)用對(duì)VSMCs的增殖無明顯作用(P>0.05)；HD 4 g/mL和8 g/mL可分別抑制TNF對(duì)VSMCs的增殖作用(P<0.05)。Western blot測(cè)定顯示：與對(duì)照組相比，HD各劑量組單獨(dú)應(yīng)用對(duì)Syndecan4 的表達(dá)無明顯影響(P>0.05)，HD 4 g/mL和8 g/mL均可抑制TNF刺激后Syndecan4 的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論 HD對(duì)TNF刺激后的VSMCs的增殖及Syndecan4 表達(dá)均有抑制作用。 【關(guān)鍵詞】  Syndecan4 ；魚腥草素衍生

4、物；TNF；血管平滑肌細(xì)胞；細(xì)胞增殖Abstract:Objective To investigate the effects of a new houttuyfonate derivative (HD) on proliferation of VSMCs and expression of Syndecan4  induced by TNF in vitro. Methods Rat VSMCs were cultured and exposed to TNF or HD respectively, and then cotreated with TNF and HD. All t

5、he groups were cultured for 24 hours in vitro, in addition to the untreated control group established for comparison. The ratio of proliferation of VSMCs was determined by nonradioactive MTS/PMS assay and the expression of Syndecan4  was evaluated by western blot using antiSyndecan4  antib

6、ody. Results Statistical analysis showed that, compared to the control group, HD alone had no effect on VSMCs growth, but significantly inhibited VSMCs proliferation induced by TNF. It also showed that compared to control group, HD alone had no effect on the expression of Syndecan4， but significantl

7、y inhibited the expression induced by TNF (P<0.05). Conclusions HD can inhibit proliferation of rat VSMCs and expression of syndean4 protein induced by TNF in vitro.    Key words:Syndecan4 ; new houttuyfonate derivative; TNF; vascular smooth muscle cells; cell proliferation &#

8、160;   血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)增殖和表型改變是心腦血管動(dòng)脈粥樣硬化和支架內(nèi)再狹窄的主要病理基礎(chǔ)之一,動(dòng)脈粥樣硬化是一個(gè)對(duì)血管損傷的過度炎癥反應(yīng)。血管損傷后，單核細(xì)胞、血小板和淋巴細(xì)胞黏附到血管壁，釋放一系列細(xì)胞因子和肽類生長(zhǎng)因子，與特異性受體結(jié)合后轉(zhuǎn)導(dǎo)影響VSMCs表型和生長(zhǎng)的信號(hào)，因此促進(jìn)了晚期纖維增殖病變的發(fā)生。腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor , TNF)是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一,可從多種不同的炎癥細(xì)胞中釋放,在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用。Syndecan4

9、是硫酸乙酰肝素類的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多糖Syndecans家族的成員之一，主要在血管平滑肌細(xì)胞上表達(dá)。作為一種與生長(zhǎng)因子結(jié)合的共受體，它調(diào)控著多種細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)，在細(xì)胞伸展、識(shí)別、黏附、遷移和細(xì)胞增殖中扮演著重要的角色，同時(shí)也介導(dǎo)炎癥反應(yīng)1, 2。目前的研究表明，魚腥草素作為中草藥魚腥草的主要成分，具有一定的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用3。本研究觀察了一種新型高效低毒的魚腥草素衍生物(houttuyfonate derivative, HD)對(duì)TNF誘導(dǎo)的大鼠VSMCs的增殖及Syndecan4 表達(dá)的影響。    1  材料和方法   

10、1.1  主要材料    6周齡雄性無特殊病原體(specificpathogen free, SPF)級(jí)SD大鼠由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào)：SCXK(粵)20060015。達(dá)爾伯克(氏)必需基本培養(yǎng)基(Dulbeccos minimum essential medium, DMEM)、2.5 g/L胰酶購(gòu)于Gibco公司。胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購(gòu)于Hyclone公司。HD (結(jié)構(gòu)見圖1)由中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院合成。TNF購(gòu)于Peprotech公司。CellTiter 96 Assay MTS/PM

11、S試劑盒購(gòu)于Promega公司。目的蛋白一抗為Syndecan4 兔多克隆抗體H140，購(gòu)于Santa Cruz公司(sc15350)；二抗為抗兔IgG抗體，購(gòu)于Amersham公司(NA934)。內(nèi)參一抗為Actin鼠單克隆抗體 (C4)，購(gòu)于Santa Cruz公司(sc47778)；二抗為抗鼠IgG抗體，購(gòu)于Amersham公司(NA931)。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)于Pierce公司。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。    1.2  細(xì)胞培養(yǎng)    參考文獻(xiàn)4方法。選用SPF級(jí)SD大鼠斷頭處死，取胸主動(dòng)脈中膜以貼塊法培養(yǎng)于含1

12、0%（）FBS的DMEM中，于37 5% CO2的孵箱中培養(yǎng)。1周后可見細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，23周出現(xiàn)致密細(xì)胞層，此時(shí)即可傳代。傳代細(xì)胞呈典型的“峰谷”狀生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)所用的VSMCs均為第36代傳代細(xì)胞。    1.3  細(xì)胞增殖評(píng)價(jià)    體外培養(yǎng)的VSMCs用2.5 g/L胰蛋白酶消化，然后在96孔板中以5 000個(gè)細(xì)胞/孔的密度鋪板。8 h后換成無血清的DMEM，無血清條件維持48 h以獲得細(xì)胞的同步生長(zhǎng)停止。48 h后分別加入用含5%FBS的DMEM稀釋的TNF 20 ng/mL5、HD 4 g/mL、HD 8 g/

13、mL、TNF 20 ng/mL+HD 4 g/mL、TNF 20 ng/mL+HD 8 g/mL,對(duì)照組為含5%FBS的DMEM。24 h后將MTS/PES混合溶液20 mL加入各孔，96孔板在37 5CO2 孵箱中培養(yǎng)90 min，在BioRad 550型酶標(biāo)儀上以490 nm波長(zhǎng)測(cè)量吸光度（A）值，細(xì)胞的增殖率用吸光度來表示。    1.4  Syndecan4 免疫印跡測(cè)定    將體外培養(yǎng)的VSMCs分別用TNF 20 ng/mL、HD 4 g/mL、HD 8 g/mL、TNF 20 ng/mL+HD 4 g/mL、

14、TNF 20 ng/mL+HD 8  g/mL刺激24 h，對(duì)照組為含10FBS的DMEM。于37 5CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后，倒去培養(yǎng)基并用冰的DHanks液洗2次，吸盡液體，按101的比例加入蛋白裂解液，冰上放置10 min。用刮子將細(xì)胞刮下，迅速移入離心管中，4 12 000 r/min離心30 min，取上清分裝至無菌離心管。分別取40 L于100 沸水中加熱5 min，用12的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)。將已分離的區(qū)帶用電轉(zhuǎn)移儀轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(polyvinylidene difluoride, PVDF)膜上，室溫下用TBS洗3次，每次10 min，然后放入

15、一塑料袋中，加入含5脫脂奶粉的封閉液，4 過夜。取出PVDF膜，室溫下用TBST洗3次，每次10 min，放入一新的塑料袋中，按0.1 mL/cm2加入一抗(1200稀釋)，室溫下于搖床上震蕩2 h。取出PVDF膜，室溫下用TBST洗3次，每次10 min，放入一新的塑料袋中，再按0.1 mL/cm2加入二抗(110 000稀釋)，室溫下于搖床上震蕩1 h。取出PVDF膜，室溫下用TBST洗3次，每次10 min。在暗室內(nèi)將ECL試劑盒中的試劑1和2按11的比例均勻混合于一玻璃皿中(0.125 mL/cm2)，將PVDF膜浸泡其中約1 min。取出PVDF膜，用ECL Western顯影試劑盒

16、采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白印記條帶。實(shí)驗(yàn)?zāi)z片用光密度掃描儀掃描，結(jié)果用圖像分析軟件Bandscan進(jìn)行分析。    1.5  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析    所有數(shù)據(jù)資料以±s表示，應(yīng)用SPSS 13.0軟件，采用oneway ANOVA分析，組間比較方差齊性采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊采用GamesHowell檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有顯著性。                &#

17、160;                2  結(jié) 果    2.1  HD對(duì)TNF誘導(dǎo)的大鼠VSMCs增殖的影響    結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，TNF 20 ng/mL組能顯著刺激大鼠VSMCs的增殖(P<0.05)，而HD 4 g/mL、8 g/mL單獨(dú)應(yīng)用對(duì)VSMCs的增殖無明顯影響(P>0.05)。TNF 20 ng/mL+HD 4 g/mL、TNF

18、 20 ng/mL+HD 8 g/mL與TNF 20 ng/mL比較對(duì)VSMCs的增殖有顯著的抑制作用(P<0.05)，但不存在劑量依賴性(見圖2)。    2.2  HD對(duì)TNF干預(yù)后VSMCs中Syndecan4 表達(dá)的影響    以目的蛋白對(duì)照組灰度值與內(nèi)參對(duì)照組灰度值的比值為1，其余各組Syndecan4 蛋白表達(dá)量分別為：TNF 20 ng/mL組1.293±0.053, HD4 g/mL組0.925±0.135, HD 8 g/mL組0.877±0.058, TNF 20 ng

19、/mL+HD 4 g/mL組1.031±0.077, TNF 20 ng/mL+HD 8 g/mL組1.017±0.047。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明, 與對(duì)照組比較，TNF組能顯著刺激Syndecan4 蛋白的表達(dá)(P<0.05)，而HD不同劑量組單獨(dú)應(yīng)用對(duì)Syndecan4 表達(dá)無明顯作用(P>0.05)。TNF加不同劑量的HD組與TNF組比較對(duì)VSMCs的Syndecan4 表達(dá)有顯著抑制作用(P<0.05) (見圖3)。重復(fù)5次得到相同的結(jié)果。    3  討 論    炎癥反應(yīng)貫穿于動(dòng)脈

20、粥樣硬化的起始、病變進(jìn)展及斑塊破裂、血栓形成的全過程。TNF是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一，TNF主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，與正常細(xì)胞相比，在動(dòng)脈粥樣硬化病變中其表達(dá)上調(diào)，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊局部的血管平滑肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有TNF mRNA表達(dá)。VSMCs表面具有TNF受體，因此VSMCs既可產(chǎn)生TNF，同時(shí)本身也是TNF作用的靶細(xì)胞。TNF與VSMCs上的相應(yīng)受體結(jié)合后可以促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂過程。4 表達(dá)的影響    目前研究表明Syndecan4 在炎癥及組織創(chuàng)傷愈合中發(fā)揮著重要的作用6。Syndecan4 主要在VSMCs上表達(dá)，Syndecan4 的表達(dá)在動(dòng)脈損傷早期即

21、可增加，隨后在7 d內(nèi)減少到可控制的水平。在內(nèi)皮組織裸露的動(dòng)脈，血管中層平滑肌Syndecan4 的mRNA占整個(gè)血管壁的70%90%。Telci等研究顯示，在組織損傷修復(fù)中Syndecan4 可與纖維結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶復(fù)合物結(jié)合，激活蛋白激酶C后，Syndecan4 聚集并與1整合素結(jié)合，激活細(xì)胞存活機(jī)制及RGD依賴的細(xì)胞黏附，從而導(dǎo)致MAPK途徑激活及肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維形成6。Syndecan4 作為一種重要的跨膜蛋白，是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞內(nèi)部的重要傳遞者，也是細(xì)胞外信號(hào)引起細(xì)胞增殖反應(yīng)的重要遞呈者7。位于細(xì)胞表面的Syndecan4 主要通過激活蛋白激酶C參與細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)8。在細(xì)

22、胞因子等致動(dòng)脈粥樣硬化因素的刺激下，Syndecan4 通過硫酸乙酰肝素鏈與胞外的配體相結(jié)合，并調(diào)節(jié)其活性，經(jīng)保守的跨膜區(qū)傳導(dǎo)進(jìn)入胞內(nèi)，在其胞質(zhì)尾區(qū)發(fā)生一系列的去磷酸化作用及寡聚化作用，使Syndecan4 與PIP2的親和力增強(qiáng)，從而激活了蛋白激酶C，進(jìn)一步激活了ERK1/2 (p44/42 MAPK)，從而啟動(dòng)了大多數(shù)促細(xì)胞增殖的共同途徑ERK途徑。    新近已證明，T細(xì)胞(包括Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞、NK T細(xì)胞)介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色6。魚腥草是三白草科植物蕺菜的帶根全草，其主要功能包括清熱解毒、利尿、消腫、止痛等。

23、藥理研究表明，魚腥草素是魚腥草中的有效活性成分，抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用是其生物活性的一個(gè)重要方面。魚腥草素可以通過改善T細(xì)胞和B細(xì)胞的相關(guān)功能進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)9。魚腥草素藥效團(tuán)為醛酮結(jié)構(gòu)。迄今為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)魚腥草素結(jié)構(gòu)改造主要集中在保留醛酮結(jié)構(gòu)不變的情況下，對(duì)脂肪鏈進(jìn)行改造，如改變碳鏈的碳原子數(shù)，在碳鏈中引入碳碳雙鍵、碳碳三鍵等10-12。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的HD借鑒某些具有抗炎活性芳香族醛、酮類化合物的構(gòu)效特點(diǎn)，以醛酮官能團(tuán)為基礎(chǔ)，以醛酮與芳香環(huán)直接相連的化學(xué)結(jié)構(gòu)為主要骨架，在已定的化學(xué)結(jié)構(gòu)骨架上，對(duì)位引入甲氧基，旨在增強(qiáng)其抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用。前期結(jié)果顯示，經(jīng)修飾后，此種HD對(duì)革蘭氏染色陽性金黃色葡萄球菌的

24、抑菌活性優(yōu)于魚腥草素，而殺菌作用也與魚腥草素相當(dāng)13。根據(jù)目前實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)TNF可能是通過與VSMCs表面的相應(yīng)TNF受體結(jié)合，刺激Syndecan4 的表達(dá)增加，隨后激活p44/42 MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞增殖，而HD可能通過抑制TNF誘導(dǎo)的Syndecan4 的表達(dá)，減少蛋白激酶C的激活，從而進(jìn)一步抑制了p44/42 MAPK的磷酸化，最終導(dǎo)致大鼠VSMCs增殖的減少。    本研究結(jié)果提示一定劑量的HD能夠顯著抑制TNF誘導(dǎo)的大鼠VSMCs增殖和Syndecan4 的表達(dá)。因此，將HD作為一種藥物先導(dǎo)物，進(jìn)一步研究其相關(guān)潛在治療作用是非常必要的?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 COUCHMAN J R, WOODS A. Syndecan4 and integrins: combinatorial signaling in cell adhesionJ. J Cell Sci, 1999, 112: 3415-34202 ALEXOPOULOU AN，MUITHAUPT HA，COUCHMAN，et al. Syndecans