北冬蟲夏草DNA提取方法的比較-

1、第37卷第2期 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版 Vol.37 No.2 2011年4月 Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences Apr .2011 DIO:10.3724/SP.J.1238.2011.00147北冬蟲夏草DNA 提取方法的比較康信聰1, 2,劉東波1, 2, 3*,夏志蘭1, 2, 3,陳芳1, 2( 1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410128;2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局 亞健康干預(yù)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長(zhǎng)沙 410128;3.作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長(zhǎng)沙 410128摘 要

2、:運(yùn)用CTAB 法、CTAB 改良法1、CTAB 改良法2、氯化芐法、裂解法、改良SDS 法、改良尿素法等7種方法提取北冬蟲夏草基因組DNA ,發(fā)現(xiàn)CTAB 改良法2(提純時(shí)加入低濃度乙醇提取的DNA 的OD 260/OD 280都在1.9以上,能獲得清晰的PCR 擴(kuò)增圖譜,能被Hind 酶切消化。關(guān) 鍵 詞:北冬蟲夏草;基因組DNA ;提取中圖分類號(hào):Q503 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):10071032(201102014703Comparison of genomic DNA extraction from Cordyceps militarisKANG Xin-cong 1, 2, LI

3、U Dong-bo 1, 2, 3*, XIA Zhi-lan 1, 2, 3, CHEN Fang 1, 2(1.College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2.State Key Laboratory of Sub-Health Intervention Technology, State Administration of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410128, China; 3.Hunan

4、Provincial Key Laboratory for Germplasm Innovation and Utilization of Crop, Changsha 410128, ChinaAbstract: This study is an attempt to compare the DNA extraction methods of 7 kinds of extraction: CTAB method, improved CTAB method 1, improved CTAB method 2, benzyl chloride method, lysis method, impr

5、oved SDS method, and improved urea method so as to isolate high quality genomic DNA from Cordyceps militaris enriching polysaccharides and protein. The results showed that the extraction effect of the third method (improved CTAB method 2 (added low concentration ethanol at purification was the best.

6、 The value of OD 260/OD 280 was over 1.90, the DNA was amplifiable in the polymerase chain reaction (PCR and completely digestible with restriction endonucleases Hind . Key words: Cordyceps militaris ; genomic DNA; extract收稿日期:20101116基金項(xiàng)目:國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BIA06A20作者簡(jiǎn)介:康信聰(1988,女,江西吉安人,碩士研究生,主要從事功能食品開

7、發(fā)與評(píng)價(jià)研究,kangxincong ;*通信作者, chinasaga由于北冬蟲夏草某些活性成分如蟲草素含量高于冬蟲夏草14,常被作為冬蟲夏草的替代品在臨床上應(yīng)用。北冬蟲夏草的分子生物學(xué)研究需要能迅速分離出純度高、相對(duì)分子質(zhì)量大的基因組DNA 5。筆者借鑒了大量食用菌基因組DNA 的提取方法,對(duì)北冬蟲夏草基因組DNA 的提取方法進(jìn)行比較研究。1 材料與方法1.1 材 料北冬蟲夏草菌種來源于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌研究所。 1.2 方 法 1.2.1 DNA 的提取采用7種方法提取北冬蟲夏草基因組DNA ,菌148 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版 2011年4月絲體0.5 g。方法1:CTAB法,參照

8、文獻(xiàn)6。方法2:CTAB 改良法1,參照文獻(xiàn)78,將CTAB緩沖液中的NaCl 濃度提高至2.5 mol/L,并在加入CTAB提取緩沖液后再加入蛋白酶K進(jìn)行裂解,沉淀后加入低濃度的NaCl對(duì)DNA進(jìn)行溶解,再用氯仿異戊醇(241進(jìn)行抽提。方法3:CTAB改良法2,參照文獻(xiàn)9,用苯酚氯仿異戊醇(25241進(jìn)行提純的同時(shí),加入30%體積的無水乙醇對(duì)雜質(zhì)多糖進(jìn)行沉淀。方法4、5、6、7分別為氯化芐法、裂解法、改良SDS 法、改良尿素法,參照文獻(xiàn)1013。1.2.2 DNA質(zhì)量檢測(cè)1 純度檢測(cè)。將所得DNA 提取液稀釋后, Shimadzu UV1800紫外分光光度計(jì)測(cè)定260、280 nm 處的吸光

9、度以及DNA質(zhì)量濃度,并根據(jù)OD260/ OD280值判斷DNA 純度。2 電泳檢測(cè)。將所得DNA 于1.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳,在SYNGENE 型凝膠成像系統(tǒng)下觀察、拍照。3 PCR 擴(kuò)增檢測(cè)。以提取的DNA為模板,進(jìn)行PCR檢測(cè)。25 L 反應(yīng)體系中含ddH2O 14.8 L、10PCR Buffer 3 L、10 mmol/L dNTPs(北京鼎國(guó) 0.3 L、20 mmol/L Mg2+ 2 L、2.5 mol/L引物1(上海生工 2 L, 2.5 mol/L引物2 2 L、5 U/L Taq 酶(上海生工 0.4 L、150 ng/L模板0.5 L。擴(kuò)增在東勝龍EDC810 PC

10、R儀上進(jìn)行,擴(kuò)增程序?yàn)?4 預(yù)變性5 min,94變性60 s,35 退火60 s,72 延伸2 min,5個(gè)循環(huán),94 變性60 s,50 退火60 s, 72 延伸2 min,35個(gè)循環(huán),72 延伸10 min,16 保溫結(jié)束反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0 %的瓊脂糖凝膠上電泳,在SYNGENE型凝膠成像系統(tǒng)下觀察、拍照。4 限制性內(nèi)切酶酶切檢測(cè)。將提取的DNA用限制性內(nèi)切酶Hind于37 水浴中酶切消化1 h(酶切反應(yīng)總體積為20 L,包括10Buffer 2 L, DNA 5 g,Hind 5 U,加超純水至20 L后,取2.5 L用1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果。2 結(jié)果與分析2.1

11、DNA的紫外吸收值比較用7種方法多次重復(fù)提取北冬蟲夏草的DNA,分別測(cè)定其OD260、OD280、OD260/OD280值,結(jié)果(表1 表明,7種方法提取的DNA,方法3的OD260/ OD280值最佳,大多為1.902.10,平均為1.913,表明這種方法提取的DNA 有較好的純度。表1 7 種方法提取DNA 的紫外檢測(cè)結(jié)果Table 1The ultraviolet absorbance of DNA extracted with seven different methodsOD比值方法1方法2方法3 方法4 方法5 方法6方法7平均值 1.575 1.542 1.913 1.752 1

12、.677 1.769 1.7502.2 電泳檢測(cè)結(jié)果從圖1可看出,7種方法所提DNA電泳后的圖譜清晰,方法1、3、4的DNA條帶較亮,方法5、7的稍弱,而方法2、6幾乎沒有,總體基本無降解拖尾現(xiàn)象,在加樣孔附近滯留的物質(zhì)也很少。但仔細(xì)比較,仍可發(fā)現(xiàn)7種DNA 之間的細(xì)微差別,方法1、3、4比方法5、7的降解略多,在加樣孔附近的滯留物也是方法1、3、4比方法5、7的稍多。方法4的RNA殘留較多,方法1、5次之,說明方法4提取的DNA中仍含有抑制RNA酶的雜質(zhì)。11122233344455566677 71CTAB 法;2CTAB 改良法1;3CTAB改良法2;4氯化芐法;5裂解法;6SDS 法;

13、7尿素法。圖1 7種方法提取北冬蟲夏草基因組DNA 的電泳圖譜 Fig. 1Electrophoresis figure of genomic DNA extracted with seven different methods2.3 PCR擴(kuò)增結(jié)果圖2是7種方法提取的DNA以Me1為正向引物,分別以Em1、Em2為反向引物的PCR 擴(kuò)增結(jié)果。擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果表明,方法3提取的DNA 均能很好地進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,并獲得豐富清晰的擴(kuò)增譜帶;方法4以Em1為反向引物時(shí),雖也有些條帶能擴(kuò)增出來,但譜帶較弱,且擴(kuò)增的條帶不完全。說明方法3所提取的DNA質(zhì)量最好,雜質(zhì)少,對(duì)第37卷第2期 康信聰?shù)?北

14、冬蟲夏草DNA 提取方法的比較 149Taq 酶的活性影響小,所提取的DNA 能用做PCR 的模板,可滿足DNA 分子標(biāo)記的要求。1 2 3 4 5 6 7 M 1 2 3 4 5 6 7 1 CTAB 法;2 CTAB 改良法1;3 CTAB 改良法2;4 氯化芐法;5 裂解法;6 SDS 法;7 尿素法;M DNA marker 。圖2 7種方法提取北冬蟲夏草基因組DNA 的PCR 擴(kuò)增圖譜Fig.2 PCR amplified of DNA extracted with seven different methods2.4 DNA 的酶切效果用限制性內(nèi)切酶Hind 對(duì)7種方法所提取DNA

15、 的酶切結(jié)果(圖3表明,方法1、3、7的DNA 能看出酶切的痕跡,而方法2、4、5、6既無DNA 條帶,也無任何酶切痕跡。方法3的酶切痕跡最為明顯,可能是酶切時(shí)所用DNA 量少,所以總體圖譜不清晰,而方法2、4、5、6 可能含雜質(zhì)較多未被酶切開,卻因DNA 量太少而看不出DNA 條帶;方法1、3、7均被切開,以方法3最為明顯,說明方法3的DNA 質(zhì)量最好,所含抑制限制性內(nèi)切酶的各種污染物最少。1 1 12 2 23 3 34 4 45 5 56 6 67 77 1 CTAB 法;2 CTAB 改良法1;3 CTAB 改良法2;4 氯化芐法;5 裂解法;6 SDS 法;7 尿素法。圖3 7種方法

16、提取北冬蟲夏草基因組DNA 的Hind 酶切圖譜Fig.3 Hind digesting the genomic DNA extracted with sevendifferent methods3 討 論去除多糖類物質(zhì)是提取藥食用真菌DNA 時(shí)常遇到的難題。藥食用真菌中富含多糖,而多糖的許多理化性質(zhì)與核酸相似,在去除多糖的同時(shí)DNA 也被裹攜,造成DNA 得率的減少;在沉淀DNA 時(shí),產(chǎn)生多糖的凝膠狀沉淀,這種含有多糖的DNA 沉淀難溶于水,或溶解后產(chǎn)生黏稠狀的溶液,由于多糖可以抑制DNA 限制性內(nèi)切酶、T 4 DNA 連接酶、Taq DNA 聚合酶等多種酶類的活性1415,因此污染了多糖的

17、DNA 樣品無法用于進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究。在常規(guī)方法中,通過在CTAB 緩沖液中加入PVP 去除少許多糖16,在高濃度Na +或K +存在條件下,通過苯酚、氯仿抽提除去一些多糖7,通過水飽和乙醚將部分多糖留在上清液中17,或通過區(qū)室法在細(xì)胞裂解前就將細(xì)胞質(zhì)中的大多數(shù)生化物質(zhì)包括多糖去除1819,雖然這些方法都可以在一定程度上減少多糖污染,但仍有相當(dāng)多的多糖與DNA 混雜在一起,所以還需要用更有效的方法來解決DNA 分離純化時(shí)多糖污染的問題。用低濃度乙醇沉淀多糖是提取RNA 去除多糖效果較好的方法,Tesniere 9報(bào)道多糖會(huì)在低濃度乙醇(10%30%中沉淀,而RNA 則要在75% 的乙醇中

18、才能沉淀,所以利用RNA 與多糖在不同濃度乙醇中的沉淀性質(zhì)不同來分離這2種物質(zhì)。本研究中,方法3采用了去多糖效果較好的CTAB 法,并在此基礎(chǔ)上根據(jù)RNA 去多糖的方法進(jìn)行了改良,在加入苯酚氯仿異戊醇(25241的同時(shí),加入30%無水乙醇,所提取的DNA OD 260/OD 280值都處于1.92.0,能獲得清晰的PCR 擴(kuò)增圖譜,也能被Hind 酶切。表明低濃度乙醇沉淀法不僅可以很好地去除RNA 中的多糖,也可以很好地去除DNA 中的多糖。本研究中,7 種方法提取的DNA ,只有方法3(CTAB 改良法2無論從OD 260/OD 280值、PCR 擴(kuò)增,還是從酶切圖譜來看,都是最優(yōu)方法,去除

19、蛋白質(zhì)和多糖的效果好。只是在電泳檢測(cè)時(shí),方法3比方法5、7的降解和加樣孔附近的滯留物略多,但黃建安等18認(rèn)為,這些問題的解決有賴于實(shí)驗(yàn)者對(duì)一些操作細(xì)節(jié)的掌握,只要操作精細(xì)合理,都是可以避免的。 參考文獻(xiàn):1 湯曉赟,丁選勝.蛹草的研究進(jìn)展J.基層中藥雜志,2002,16(4:5053.2 張顯科,劉文霞.蛹蟲草化學(xué)成分測(cè)定J.菌物系統(tǒng),1997,16(1:7880.(下轉(zhuǎn)第210頁(yè)210 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版 2011年4月法外,還有液相色譜法、氣相色譜法、毛細(xì)管電泳法等9,這些方法在測(cè)定低含量的糖類化合物時(shí),無一例外的需對(duì)樣品進(jìn)行柱前衍生或柱后衍生,操作步驟繁瑣,所需時(shí)間較長(zhǎng),人力和

20、物力成本較高,分離效果不理想。而離子色譜法使用了脈沖安培檢測(cè)器,這種檢測(cè)器可對(duì)糖類化合物直接進(jìn)行檢測(cè),無需衍生,具有非常高的靈敏度,且具有選擇性。測(cè)定結(jié)果表明,測(cè)定的精密度、回收率高。本試驗(yàn)中選擇的2套梯度條件分別進(jìn)行檢測(cè),可以較好地解決干擾的問題,達(dá)到較好的分離效果,綜合這兩套數(shù)據(jù)基本可以得到樣品中所有待測(cè)糖類的準(zhǔn)確測(cè)定結(jié)果,從而提供水稻秸稈木質(zhì)纖維素的單糖組成基本信息。參考文獻(xiàn):1陳靜萍,王克勤,熊興耀,等.射線對(duì)稻草纖維組織及酶解效果的影響J.核農(nóng)學(xué)報(bào),2005,22(3:304309.2何源祿.植物纖維原料輻射水解研究進(jìn)展J.核技術(shù),2008,7(5:710.3彭維,向志明.水稻秸稈的

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