原藥材質量標準分析方法驗證

1、藥材質量標準方法建立1儀器與材料UV 1601紫外可見分光光度計 (日本島津AB204-N 電子天平 (萬分之一天平，METTLER TOLEDO BP211D 電子天平 （十萬分之一天平，Sarlorius ） 葡萄糖 (分析純，天津市化學試劑一廠 苯酚 (分析純，天津市化學試劑一廠 蒽酮 分析純，國藥集團化學試劑有限公司） 硫酸 (分析純，天津市凱信化學試劑有限公司當歸藥材購于甘肅岷縣，經天津藥物研究院中藥現(xiàn)代研究部張鐵軍研究員鑒定為傘形科植物當歸Angelica sinensis(OlivDiels的干燥根，經檢測符合中華人民共和國藥典（2010版）一部的有關規(guī)定。黃芪藥材購于甘肅岷縣，

2、經天津藥物研究院中藥現(xiàn)代研究部張鐵軍研究員鑒定為蒙古黃芪Astragalus membranaceus(FischBgeVar mongholicus (Bge.Hsiao的干燥根，經檢測符合中華人民共和國藥典（2010版）一部的有關規(guī)定。2方法與結果2.1藥材中多糖含量測定方法本試驗采用比色法對藥材中的多糖含量進行測定，并建立了含量測定方法。2.1.1 對照品溶液的制備精密稱取105干燥至恒重的無水葡萄糖對照品30.43mg ，置100ml 量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（每1ml 中含無水葡萄糖0.3043mg ）。2.1.2 5苯酚試劑的配制取苯酚100g ，加鋁片0.1g

3、 和碳酸氫鈉0.05g ，蒸餾，收集182餾分，稱取此餾分5g 置棕色容量瓶中溶解后定容，存冰箱備用。 2.1.3 供試品溶液制備方法的考察與確定 水提時間的考察分別取60干燥至恒重的當歸及黃芪藥材細粉5份，每份約0.50g ，精密稱定，置索氏提取器中，用80%乙醇回流提取2小時，殘渣揮干溶劑后，再繼續(xù)以水分別回流提取1.0h 、2.0h 、3.0h 、4.0h 、5.0h ，反復洗至250ml 量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密量取1ml ，置10ml 具塞干燥試管中，采用改良后的苯酚-硫酸法測定吸光度，計算含量，結果見表1-1。表1-1 水提不同提取時間對當歸含量測定的影響結果樣品 提取時間（

4、h ）當歸多糖含量（%）黃芪多糖含量（%）1 1.0 7.568 5.501 2 2.0 8.599 6.511 3 3.0 8.583 6.600 4 4.0 8.594 6.589 55.08.5806.590從表1-1可知，水提提取時間為2.0h 時，藥材含量達到最大值且保持恒定，延長提取時間藥材含量變化不大，故選擇提取時間為2.0h 。 2.1.4 供試品溶液的制備分別取60干燥至恒重的當歸及黃芪藥材細粉約0.5g ，精密稱定，置索氏提取器中，用80%乙醇回流提取1小時，殘渣揮干溶劑后，再繼續(xù)以水回流提取2小時，反復洗滌殘渣及燒瓶至250ml 量瓶中，定容至刻度，搖勻，備用。2.1.5

5、 最大吸收波長選擇取2.1.1項下對照品溶液，在200nm-700nm 波長間進行紫外吸收光譜掃描，最大吸收波長為490nm ，確定選擇490nm 作為檢測波長。2.1.6 標準曲線的制備精密量取對照品溶液1.0ml ，2.0ml ，3.0ml ，4.0ml ，5.0ml ，6.0ml ，分別置50ml 量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密量取上述各溶液1ml ，置具塞試管中，分別加5苯酚溶液0.6ml ，混勻，迅速加入硫酸3.0ml ，搖勻，于90水浴中15分鐘，取出，置冰水浴中15分鐘，取出，以相應試劑為空白，照紫外可見分光光度法（附錄VA ），在490nm 的波長處測定吸光度，結果見表1-2。

6、以吸光度為縱坐標，葡萄糖取樣量為橫坐標，繪制標準曲線，可得回歸方程：y=0.0045x-0.0011，r=0.9995(n=6。葡萄糖在24.24145.44 g范圍內，與吸光度呈良好的線性關系，結果見圖1-1。表1-2 葡萄糖線性范圍考察取樣量(g 吸光度 24.24 0.115 48.48 0.209 72.72 0.330 96.96 0.433 121.20 0.554 145.440.655 圖1-1 葡萄糖標準曲線 Fig 1-1 Standard Curve of glucose2.1.6 精密度試驗精密量取同一供試品溶液，按標準曲線項下方法操作測吸光度，重復測定6次，求得吸光度

7、值的RSD 值為0.33%。結果見表1-3，說明儀器的精密度符合要求。表1-3 精密度試驗結果測定次數(shù)吸光度A 1 0.387 2 0.386 3 0.389 4 0.388 5 0.386 6 0.386 RSD （%）0.332.1.7 穩(wěn)定性試驗 精密量取同一供試品溶液，按標準曲線項下方法操作，每10分鐘測定一次吸光度，到1小時后改為30分鐘測一次，求得多糖含量的RSD 值為1.02，結果見表1-4，測定值在120分鐘內保持穩(wěn)定。以下吸光度的測定均在120分鐘內完成。表1-4 穩(wěn)定性試驗結果測定時間(min多糖含量（）0 8.491 10 8.380 20 8.602 30 8.447

8、40 8.647 50 8.624 60 8.536 90 8.491 120 8.513 RSD （%）1.022.1.8 重現(xiàn)性試驗 取60干燥至恒重的當歸藥材細粉6份，精密稱定，按2.1.3項下方法制備供試品溶液，按標準曲線項下方法操作分別測定吸光度，計算多糖含量，求得多糖含量值RSD 值為1.68，結果見表1-5，表明方法重現(xiàn)性良好。表1-5 重現(xiàn)性試驗結果樣品 多糖含量（%）1 8.710 2 8.895 3 8.505 4 8.602 5 8.609 6 8.519 平均含量 8.640 RSD （%）1.682.1.9 加樣回收率試驗 取上述已知多糖含量的當歸藥材細粉6份，每份約

9、0.125g ，精密稱定，精密加入濃度為2.111 mg/ml標準葡萄糖對照品溶液5 ml按2.1.3項下方法制備供試品溶液，按標準曲線項下方法操作分別測定吸光度，計算多糖含量，計算回收率，結果見表1-6。平均回收率為99.12%，RSD 值1.96%。結果表明：本法回收率較好，方法可行。表1-6 加樣回收率試驗結果樣品取樣量（g ）樣品含量（mg ）對照品加入量（mg ）實測量（mg ）回收率（）平均回收率（）RSD （%）1 0.1242 10.70 10.56 20.97 97.25 2 0.1256 10.82 10.56 21.61 102.18 3 0.1257 10.83 10.

10、56 21.33 99.43 99.12 1.96 4 0.1254 10.80 10.56 21.22 98.67 5 0.1255 10.81 10.56 21.39 100.19 60.125010.7710.5621.0196.972.1.10 當歸藥材中多糖含量測定 取60干燥至恒重的當歸藥材細粉三份，每份約0.25g ，精密稱定，按2.1.3項下方法制備供試品溶液，按標準曲線項下方法操作測定吸光度，計算多糖含量，求得當歸藥材中平均多糖含量為8.58，結果見表1-7。表1-7 當歸藥材中多糖含量測定結果樣品 取樣量（g ） 多糖含量（）平均多糖含量（）1 0.2501 8.44 2

11、0.2498 8.54 8.58 30.25008.762.2 黃芪藥材中多糖含量測定方法本試驗采用比色法對藥材中的含量進行測定，建立了含量測定方法。 2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取經105干燥至恒重的無水葡萄糖對照品0.03260g ，置100ml 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（每1ml 中含無水葡萄糖0.3260mg ）。2.2.2 0.2%蒽酮-硫酸溶液的配制 稱取蒽酮粉末0.2g ，置100ml 棕色量瓶中，加硫酸至刻度，搖勻，即得。2.2.3 供試品溶液的制備67 取黃芪藥材粗粉約1g ，精密稱定，置圓底燒瓶中，加水100ml ，加熱回流1.5h ，用脫脂棉濾過，

12、再重復提取2次，三次濾液合并，濃縮，移至100 ml量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密量取2 ml，加乙醇10 ml，攪拌，離心，取沉淀加水溶解，置25 ml量瓶中，并稀釋至刻度，精密量取2 ml，置10ml 具塞干燥試管中，備用。2.2.4 供試品溶液制備方法的考察與確定2.2.4.1 加水量的考察 取黃芪藥材粗粉4份，每份約1g ，精密稱定，置圓底燒瓶中，分別加水50ml 、100ml 、150ml 、200ml ，加熱回流1h ，用脫脂棉濾過，濾液濃縮，移至100 ml量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密量取2 ml，加乙醇10 ml ，攪拌，離心，取沉淀加水溶解，置25ml 量瓶中，并稀釋至刻度

13、，精密量取2 ml，測定吸光度，計算含量，結果見表1-8和圖1-2。表1-8 不同溶劑用量對含量測定的影響結果樣品 加水量（ml ）多糖含量（%）1 50 4.812 2 100 7.874 3 150 7.702 42007.774 圖1-2不同溶劑用量對含量測定的影響結果從表1-8和圖1-2可知，加水量為100ml 時，藥材含量達到最大值且保持恒定，故選擇加水量為100ml 。2.2.4.2 提取時間的考察 取黃芪藥材粗粉5份，每份約1g ，精密稱定，置圓底燒瓶中，加水100ml ，分別加熱回流0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，用脫脂棉濾過，濾液濃縮，移至100 ml量瓶中，加水

14、至刻度，搖勻。精密量取2 ml，加乙醇10 ml ，攪拌，離心，取沉淀加水溶解，置25ml 量瓶中，并稀釋至刻度，精密量取2 ml，測定吸光度，計算含量，結果見表1-9和圖1-3。表1-9 不同提取時間對含量測定的影響結果樣品 提取時間（h ）多糖含量（%）1 0.5 7.598 2 1.0 8.125 3 1.5 8.594 4 2.0 8.597 52.58.585 圖1-3 不同提取時間對含量測定的影響結果從表1-9和圖1-3可知，提取時間為1.5h 時，藥材含量達到最大值且保持恒定，延長提取時間藥材含量變化不大，故選擇提取時間為1.5h 。2.2.4.3 提取次數(shù)的選擇 取黃芪藥材粗粉

15、5份，每份約1g ，精密稱定，置圓底燒瓶中，加水100mll ，加熱回流1.5h ，分別再重復提取0、1、2、3、4次，用脫脂棉濾過，濾液濃縮，移至100 ml量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密量取2 ml，加乙醇10 ml，攪拌，離心，取沉淀加水溶解，置25ml 量瓶中，并稀釋至刻度，精密量取2 ml，測定吸光度，計算含量，結果見表1-10和圖1-4。表1-10 不同提取次數(shù)對含量測定的影響結果樣品 提取次數(shù)（次）多糖含量（%）1 1 7.869 2 2 8.750 3 3 10.130 4 4 9.973 559.702 圖1-4 不同提取次數(shù)對含量測定的影響結果從表1-10和圖1-4可知，次

16、數(shù)對多糖提取有影響，隨著次數(shù)增加多糖含量上升，提取次數(shù)為三次時，藥材含量達到最大值且保持恒定，增加提取次數(shù)藥材含量變化不大，故選擇提取次數(shù)為三次。2.2.5 標準曲線的制備66 精密量取對照品溶液0.1ml 、0.2ml 、0.3ml 、0.4ml 、0.5ml 、0.6ml ，分別置10ml 具塞刻度試管中，各加水至2.0ml ，搖勻，在冰水浴中緩緩滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度，混勻，放冷后置水浴中保溫10分鐘，取出，立即置冰水浴中冷卻10分鐘，取出，以相應試劑為空白，照紫外-可見分光光度法（附錄VA ），在582nm 波長處測定吸光度，結果見表1-11。以吸光度為縱坐標，葡萄糖取樣量為

17、橫坐標，繪制標準曲線，可得回歸方程：y = 0.0041x + 0.0337，r=0.9992(n=6。葡萄糖在32.60195.60 g范圍內，與吸光度呈良好的線性關系，結果見圖1-5。表1-11 葡萄糖線性范圍考察取樣量(g 吸光度A 32.60 0.158 65.20 0.312 97.80 0.426 130.40 0.573 163.00 0.685 195.600.833 圖1-5 葡萄糖標準曲線2.2.6 精密度試驗 精密量取同一供試品溶液，按標準曲線項下方法操作測吸光度，重復測定6次，求得吸光度值的RSD 值為0.14%。結果見表1-12，說明儀器的精密度符合要求。表1-12

18、精密度試驗結果測定次數(shù)吸光度A 1 0.754 2 0.753 3 0.753 4 0.753 5 0.752 6 0.755 RSD （%）0.142.2.7穩(wěn)定性試驗 精密量取同一供試品溶液，按標準曲線項下方法操作，每10分鐘測定一次吸光度，到1小時后改為30分鐘測一次，求得多糖含量的RSD 值為1.17，結果見表1-13，測定值在120分鐘內保持穩(wěn)定。以下吸光度的測定均在120分鐘內完成。表1-13 穩(wěn)定性試驗結果測定時間(min多糖含量（）10.8410 20 30 40 50 60 90 120 RSD（%） 10.72 10.74 11.12 10.98 11.01 10.95 1

19、0.93 10.92 1.17 2.2.8 重現(xiàn)性試驗 取黃芪藥材粗粉 6 份，精密稱定，按 2.2.3 項下方法制備供 試品溶液，按標準曲線項下方法操作分別測定吸光度，計算多糖含量，求得多糖 含量值 RSD 值為 1.14，結果見表 1-14，表明方法重現(xiàn)性良好。 表 1-14 重現(xiàn)性試驗結果 樣品 1 2 3 4 5 6 平均含量 RSD（%） 多糖含量（%） 10.77 11.02 10.93 11.12 10.97 11.08 10.98 1.14 2.2.9 加樣回收率試驗 取上述已知多糖含量的黃芪藥材粗粉 6 份， 每份約 0.5g， 精密稱定，精密加入濃度為 10.978mg/ml 標準葡萄糖對照品溶液 5