一種改進(jìn)的簡便經(jīng)濟(jì)的大鼠胰腺腺泡細(xì)胞分離提純方法

1、一種改進(jìn)的簡便經(jīng)濟(jì)的大鼠胰腺腺泡細(xì)胞分離提純方法         08-10-11 09:12:00     作者：王連才,馬清涌,陳香    編輯：studa20【摘要】  目的: 探索一種簡單、經(jīng)濟(jì)和穩(wěn)定的胰腺腺泡分離純化的新方法，并探討其對細(xì)胞功能的影響. 方法: 16只SD大鼠隨機(jī)分成改進(jìn)方法組和內(nèi)灌注方法組，戊巴比妥腹腔麻醉后，其中8只按改進(jìn)方法迅速切取并剪碎胰腺組織后置于新鮮配制的細(xì)胞分離液中，37，CO2孵箱中孵

2、育30 min，過濾獲得細(xì)胞懸液， Hanks液(不含鈣離子)清洗后獲得胰腺腺泡細(xì)胞，另外8只采用內(nèi)灌注方法獲取胰腺腺泡細(xì)胞，然后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)、活力測定、純化鑒定和細(xì)胞內(nèi)鈣離子測定. 結(jié)果: 改進(jìn)方法所獲得的胰腺腺泡數(shù)量(5.0±0.7)×106、純度(78±6)%與內(nèi)灌注方法所獲得的胰腺腺泡數(shù)量(4.7±0.9)×106、純度(79±7)%比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而細(xì)胞活力(93±4)%顯著高于內(nèi)灌注方法(84±3)%(P<0.05)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度（3.62±0.54）顯著低于

3、內(nèi)灌注方法（5.31±0.37）組(P<0.05). 結(jié)論: 改進(jìn)方法是一種穩(wěn)定高效且對細(xì)胞活力及功能影響較小的胰腺腺泡細(xì)胞分離提純方法. 【關(guān)鍵詞】  胰腺/細(xì)胞學(xué);腺泡細(xì)胞;細(xì)胞分離/方法    0引言    長期以來，胰腺腺泡細(xì)胞的分離、純化都是非常棘手的難題. 從1978年Williams等創(chuàng)建了經(jīng)典的胰腺腺泡細(xì)胞分離純化方法1以來，人們從未停止對這一難題的探索和改進(jìn)，采用各種辦法進(jìn)行改進(jìn). 這些方法雖然穩(wěn)定、可靠，但實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，費(fèi)用昂貴，實(shí)驗(yàn)條件和設(shè)備要求高，甚至有些還可以影響細(xì)胞的生理狀態(tài)，引起

4、病理變化，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，不便于推廣應(yīng)用. 本研究參照已有的國內(nèi)外研究，對現(xiàn)有的胰腺腺泡細(xì)胞分離純化方法進(jìn)行改進(jìn)，擬建立一種簡單、經(jīng)濟(jì)和穩(wěn)定的胰腺腺泡分離純化的新方法.    1材料和方法    1.1材料健康SD大鼠16只，雌雄不拘，體質(zhì)量150200 g (西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心). I型膠原酶(Sigma)，使用時(shí)以新鮮配制的Hanks液(不含鈣離子)配制0.5 g/L細(xì)胞分離液. 100 mL/L的小牛血清(四季青生物公司)DMEM組織培養(yǎng)液(Gibico). Fluo3/AM（Molecular Probes In

5、c, USA）.    1.2方法    1.2.1胰腺腺泡細(xì)胞的分離、純化大鼠16只，術(shù)前12 h禁食，不禁水. 25 g/L戊巴比妥鈉按每100 g體質(zhì)量0.12 mL進(jìn)行腹腔內(nèi)注射麻醉后，將其浸于750 mL/L乙醇中30 min消毒. 其中8只動物在無菌條件下，固定于超凈工作臺上，開腹后于肝臟下緣尋找十二指腸和胰腺，迅速切取胰腺約1 g (1 cm×1 cm)浸于100 mL/L小牛血清DMEM培養(yǎng)液中，洗凈血液、去除脂肪和淋巴等組織后，將其移入盛有5 mL預(yù)熱至37新鮮配置的細(xì)胞分離液的燒杯中，將胰腺組織剪碎為0.

6、52.0 mm的小塊，置于37， 50 mL/L CO2孵箱中孵育30 min，依次用100目篩網(wǎng)和200目篩網(wǎng)過濾得細(xì)胞懸液，Hanks液(不含鈣離子)清洗兩次（800 r/min，5 min），收集細(xì)胞加5 mL 100 mL/L小牛血清DMEM培養(yǎng)液混勻后移入培養(yǎng)瓶，置于37，50 mL/L CO2孵箱內(nèi). 另外8只動物，采用內(nèi)灌注方法提取胰腺腺泡細(xì)胞培養(yǎng)2.    1.2.2細(xì)胞計(jì)數(shù)吸取20 L細(xì)胞懸液，加到細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，在倒置顯微鏡下(20×物鏡)計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù). 按公式計(jì)算，細(xì)胞數(shù)目=(4大格細(xì)胞數(shù)之和/4)×104×細(xì)胞原液

7、量(mL).    1.2.3細(xì)胞活性測定(臺盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn))吸取2 L細(xì)胞懸液加入4 g/L臺盼藍(lán)5 L，混勻后在3 min內(nèi)計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算細(xì)胞活性率（細(xì)胞活性率=（細(xì)胞總數(shù)-死細(xì)胞數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)）.    1.2.4腺泡細(xì)胞純化與鑒定將細(xì)胞懸液調(diào)整到1×1081×109個/L濃度后，制備細(xì)胞涂片，分別給予HE染色和酶原顆粒的亞甲藍(lán)染色. 方法如下:涂片用亞甲藍(lán)溶液染色后，以0.2 moL/L醋酸鹽緩沖液分色并用4 g/L鉬酸胺溶液處理后觀察，計(jì)算出腺泡細(xì)胞純化率. 分別計(jì)數(shù)10個高倍視野的HE切片上

8、的細(xì)胞數(shù)和亞甲藍(lán)染色切片上的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算出腺泡細(xì)胞純化率.    1.2.5細(xì)胞內(nèi)Ca2+測定將所獲得的胰腺腺泡細(xì)胞用PBS洗兩遍，調(diào)整細(xì)胞密度為5×108個/L，取2 mL加入Fluo3/AMDMSO，使其終濃度為5 moL/L，混勻，置入37水浴箱中避光孵育3045 min，PBS洗3遍后加1 mL PBS混勻，于流式細(xì)胞儀上檢測，激發(fā)波長488 nm，隨機(jī)測定單個胰腺泡細(xì)胞的熒光強(qiáng)度值，取10萬個胰腺腺泡細(xì)胞的熒光強(qiáng)度值的平均值為每份標(biāo)本的測定值.    統(tǒng)計(jì)學(xué)處理: 數(shù)據(jù)均以x±s表示，切應(yīng)用SPSS 13

9、.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.    2結(jié)果    2.1細(xì)胞計(jì)數(shù)采用改進(jìn)方法平均每克大鼠胰腺組織可提取細(xì)胞數(shù)量為(5.0±0.7)×106，與內(nèi)灌注方法相比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05, 表1).表1不同方法分離胰腺腺泡細(xì)胞4項(xiàng)指標(biāo)的比較    2.2細(xì)胞活性率臺盼藍(lán)染色藍(lán)染者為死細(xì)胞. 改進(jìn)方法組活細(xì)胞率為(93±4)%，顯著低于內(nèi)灌注方法（P<0.05, 圖1, 表1).    A: 改良方法組

10、; B: 內(nèi)灌注方法組. 綠色箭頭所示細(xì)胞為活細(xì)胞，紅色箭頭所示為死細(xì)胞.     08-10-11 09:12:00     作者：王連才,馬清涌,陳香    編輯：studa20    圖1不同方法分離的胰腺腺泡細(xì)胞臺盼藍(lán)染色 ×20    2.3腺泡細(xì)胞純化率HE染色（圖2A）可見胰腺腺泡細(xì)胞呈卵圓形或不規(guī)則形，核圓形偏向細(xì)胞一側(cè)，亞甲藍(lán)染色（圖2B）后腺泡細(xì)胞內(nèi)除細(xì)胞核藍(lán)染外，酶原顆粒呈鮮藍(lán)色而背景

11、不著色. 本實(shí)驗(yàn)得到胰腺腺泡細(xì)胞的純化率與內(nèi)灌注方法得到的腺泡細(xì)胞純化率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05, 表1）.    2.4細(xì)胞內(nèi)Ca2+的變化改良方法組胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)Ca2+顯著低于內(nèi)灌注方法組(P<0.05, 表1).A:  HE染色;       B: 亞甲藍(lán)染色.    圖2亞甲藍(lán)法鑒定分離胰腺腺泡細(xì)胞的純化率×40    3討論    大多數(shù)胰腺細(xì)胞提取方法由于多原因所制

12、約，而難以推廣應(yīng)用. 既往方法步驟過于繁瑣，從時(shí)限上不利于應(yīng)用于胰腺急性疾病的研究；且膠原酶用量大而花費(fèi)昂貴. 人們在這方面做出大量努力，采用各種方法來減少膠原酶的用量，降低費(fèi)用. 如在胰腺細(xì)胞的分離中， Amsterdam等2采用了將膠原酶和透明質(zhì)酸酶混合溶液向胰腺實(shí)質(zhì)中注射的方法， 結(jié)果大大減少了膠原酶的用量. 現(xiàn)在許多文獻(xiàn)介紹的胰膽管內(nèi)灌注法也是旨在提高膠原酶的利用效能、降低膠原酶的使用量和成本，如張樺等3向胰膽管內(nèi)注射大量Hanks液，以機(jī)械方法分離胰腺細(xì)胞，也同樣減少了膠原酶的用量. 而何忠野等4所采用的是向胰膽管中逆行注射大量I型膠原酶稀釋液. 而這些方法在降低胰酶使用量的同時(shí)也帶

13、來了第二個問題，對胰腺腺泡細(xì)胞功能的損害. 如采用膠原酶和胰蛋白酶的混合分離液注射5，根據(jù)胰腺炎的胰酶消化學(xué)說，其中的胰蛋白酶可激活胰腺中多種無活性的酶原使之成為活性酶，如胰淀粉酶、胰脂肪酶等，從而勢必造成程度不一的胰腺腺泡細(xì)胞的損傷；而采用胰膽管逆行注射Hanks液或膠原酶稀釋液，盡管采用了“低壓”、“緩慢”等原則，但通過胰膽管向大鼠胰腺中注射35 mL甚至多達(dá)20 mL左右的液體，其壓力仍然很大，其結(jié)果類似結(jié)石梗阻，將對胰腺腺泡細(xì)胞造成損害，而有可能成為阻礙其應(yīng)用于各種實(shí)驗(yàn)研究、尤其是急性胰腺炎細(xì)胞水平的研究.    細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度異常升高，即鈣超載，不僅是

14、SAP發(fā)病環(huán)節(jié)之一，而且通過作用于其他環(huán)節(jié)而促進(jìn)SAP的發(fā)生發(fā)展，是急性胰腺炎的重要早期事件6-7；而且我們在前期研究中也發(fā)現(xiàn)在重癥急性胰腺炎時(shí)胰腺腺泡細(xì)胞的鈣離子調(diào)節(jié)機(jī)制出現(xiàn)失衡，胰腺細(xì)胞內(nèi)鈣超載，和胰腺細(xì)胞損傷程度相關(guān)8. 所有我們在本研究中選擇細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度作為評價(jià)胰腺腺泡細(xì)胞功能的標(biāo)準(zhǔn).    本研究所建立的胰腺腺泡分離純化的方法，分離細(xì)胞總數(shù)（個/g胰腺組織）和內(nèi)灌注方法相比較更為高效. 即所采用的胰腺組織更少，步驟更簡潔，省時(shí)間. 同時(shí)由于采用的胰腺組織少，所以消耗的膠原酶量也更少，有效的降低了實(shí)驗(yàn)費(fèi)用. 而且，在本研究中我們發(fā)現(xiàn)改良方法所獲取的胰腺

15、腺泡細(xì)胞活力顯著高于內(nèi)注射法，而細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度顯著低于內(nèi)注射法. 這說明改良方法對細(xì)胞造成的損害更小，這和本研究所采用的不經(jīng)胰膽管逆行注射、快速的取材方法和較低濃度膠原酶消化等措施關(guān)系密切. 所以，由本方法所獲取的胰腺腺泡細(xì)胞不僅細(xì)胞數(shù)量和純度穩(wěn)定，而且細(xì)胞損害較小，基本保持了活體組織時(shí)的功能狀態(tài). 本研究所采用的方法穩(wěn)定可靠、經(jīng)濟(jì)簡單，重點(diǎn)著眼于避免或最大程度的減少胰腺腺泡細(xì)胞的損傷，從而為胰腺炎細(xì)胞水平的研究提供了良好的平臺.【參考文獻(xiàn)】  1 Williams JA, Korc M, Dormer RL. Action of secretagogues on a new pr

16、eparation of functionally intact, isolated pancreatic aciniJ. Am J Physiol, 1978, 235:517-524.2 Amsterdam A, Jamieson JD. Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells J. Proc Nat Acad Sci USA, 1972, 69(10):3028-3032.3 張樺，蔡德鴻，徐春生，等. 一種簡易高效的大鼠胰島分離純化方法J. 第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2001, 21(2):119-121.4 何忠野, 郭仁宣. 一種簡易經(jīng)濟(jì)的大鼠胰腺腺泡細(xì)胞分離提純方法J. 中國普通外科雜志, 2006,15(11):866-868.5 司徒鎮(zhèn)強(qiáng), 吳