DNA電化學(xué)生物傳感器的原理與研究進(jìn)展

1、第29卷第1期2009年3月CHEMICAL化學(xué)傳感器SENSORSVol29, No1Mar 2009DNA 電化學(xué)生物傳感器的原理與研究進(jìn)展毛斌，韓根亮，馬莉萍，劉斌，高曉平，李工農(nóng)，劉國漢（甘肅省科學(xué)院傳感技術(shù)研究所，甘肅蘭州730000）摘要：DNA 電化學(xué)生物傳感器是近年迅速發(fā)展起來的一種全新的生物傳感器，該類傳感器具有電極制作簡便、使用壽命長、重現(xiàn)性好、靈敏度高、成本低、易于實(shí)現(xiàn)微型化等諸多優(yōu)點(diǎn)，在臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、遺傳工程、藥物作用機(jī)理、新藥篩選、環(huán)境監(jiān)測和食品工程等領(lǐng)域已得到廣泛地研究與應(yīng)用。該文簡單介紹了DNA 電化學(xué)生物傳感器的基本原理，對其研究進(jìn)展加以分類和簡要評述，最后對其

2、發(fā)展方向進(jìn)行了展望。關(guān)鍵詞：DNA 電化學(xué)生物傳感器；基本原理；研究進(jìn)展Fundamentals and progresses of DNA electrochemical biosensorMao Bin , Han Gen-liang , Ma Li-ping , Liu Bin , Gao Xiao-ping , Li Gong-nong , Liu Guo-han(Institute of Sensor Technology , Gansu Academy of Sciences , Lanzhou 730000，ChinaAbstract ：DNA electrochemical b

3、iosensor, which has been developed rapidly in recent years, is one new type of biosensorsThis kind of biosensors has superiority in electrode fabrication, durable years, reproduction quality, testing sensitivity, production cost and micromation realizationSo they are of significant progress in resea

4、rch and application, such as clinical medical analysis, genetic engineering, mechanism of drug action, new drug selection, environmental monitoring and food engineeringThe fundamentals of DNA electrochemical biosensor is introduced, the progresses of the biosensor are assorted and appraised briefly

5、and its development trends is discussed in this articleKey words ：DNA electrochemical biosensor ；fundamentals ；progress0引言隨著人類基因組計(jì)劃（human genome project,分子作為敏感元件，制成用于DNA 快速測定1的傳感器，可與電化學(xué)技術(shù)、熒光技術(shù)2、表面等離子體共振技術(shù)3和石英晶體微天平技術(shù)4等其它檢測技術(shù)聯(lián)用，能極大地提高基因檢測速度。將電化學(xué)方法應(yīng)用于DNA 生物傳感器是近年來發(fā)展非常迅速的一個研究領(lǐng)域5。生物大分子DNA 與電化學(xué)轉(zhuǎn)換器（電流型或電位型

6、的電極）組合即可構(gòu)成DNA 電化學(xué)生物傳感器。此類傳感器具有電極制作簡便、使用壽命長、重復(fù)性好、靈敏度高、成本低、能耗少、易攜帶、不破壞測試樣品、不受溶液顏色影響、易于實(shí)現(xiàn)微型化等諸多優(yōu)點(diǎn)5。研究DNA 電化學(xué)生物傳感器技術(shù)對促進(jìn)DNA 芯片技術(shù)發(fā)展也具有重要的指導(dǎo)意義6。目前利用電化學(xué)生物傳感器可以準(zhǔn)確HGP ）的實(shí)施，為基因疾病的診治提供了科學(xué)依據(jù)，使得基因檢測在分子生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究中的重要性更突顯出來。同時(shí)，人體、病毒和細(xì)菌核酸中特定堿基序列的檢測在食品污染、法醫(yī)鑒定和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域已經(jīng)開始發(fā)揮越來越重要的作用。大規(guī)模的基因分析要求使用更簡便、迅速、廉價(jià)和微型化的檢測裝置。隨著許多生

7、物新技術(shù)的出現(xiàn)，為開發(fā)高靈敏、高特異性的基因檢測方法注入了活力，其中利用DNA 雙鏈的堿基互補(bǔ)配對原則發(fā)展起來的各種DNA 生物傳感技術(shù)，受到生物分析工作者的高度重視。利用DNA基金項(xiàng)目：甘肅省科學(xué)事業(yè)費(fèi)項(xiàng)目(QS001C3201）通訊聯(lián)系人，Tel：09318633673，Email：genlhanvipsinacom10化學(xué)傳感器29卷ssDNA 的固定dsDNA 的雜交雜交指示劑的嵌入電化學(xué)檢測 1期毛斌等：DNA 電化學(xué)生物傳感器的原理與研究進(jìn)展11圖2共價(jià)鍵固定DNA 鏈的方法(a玻碳電極，(b碳糊電極，(c石墨電極，(d金電極，(e金電極，(f鉑電極，(g多種基底電極Fig2Cov

8、alentbindingMethods of DNA ligands Immobilization(a glass carbon electrode，(b carbon paste electrode，(c graphite electrode，(d Au electrode，(e Au electrode，(f Pt electrode，(g many kinds of basic electrode擇性地與dsDNA 結(jié)合，結(jié)合方式有：直接嵌入到DNA 片段的濃度。二茂鐵及其衍生物18、亞甲基藍(lán)等是常用的嵌入劑，一些金屬復(fù)合物也能成為dsDNA 雙螺旋的堿基之間，或通過靜電作用與DNA 骨

9、架上的磷酸基團(tuán)間的結(jié)合。電化學(xué)活性標(biāo)識劑與電極表面的dsDNA 結(jié)合后，電化學(xué)檢測到的信號大小或變化值可以反映電極表面DNA 雜交的指示劑，如鈷復(fù)合物19、銣復(fù)合物20和鋨復(fù)合物21。133利用無機(jī)納米粒子的放大功能間接檢測納米材料具有的特異性質(zhì)，可作為將ssDNAdsDNA 的多少，從而間接測定被測溶液中靶12化學(xué)傳感器29卷固定到電極表面的基質(zhì)，與其它電化學(xué)活性標(biāo)識劑聯(lián)用，使檢測信號放大增強(qiáng)，從而間接檢測靶已證明PNA 與互補(bǔ)核苷酸的雜交特性，在很多方面顯示出優(yōu)于ssDNA 的性能，有望被很好地用于基因診斷。DNA 片段的濃度。研究者們已將納米金22、碳納米管2324、納米銀2527等納米

10、材料應(yīng)用在該領(lǐng)域。其中納米金顆粒具有小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)和量子尺寸效應(yīng)等，呈現(xiàn)出奇異的光學(xué)和電學(xué)性質(zhì)，同時(shí)它還具有良好的生物相容性，宜與DNA 分子結(jié)合。上述這些性質(zhì)使它在電化學(xué)DNA 生物傳感器和基因芯片技術(shù)中得到廣泛應(yīng)用，例如：功能化的納米金粒子、和其它金屬構(gòu)成復(fù)合納米材料以及與磁性微粒2829相結(jié)合都是213DNA 損傷研究DNA 損傷物質(zhì)的監(jiān)測屬于早期診斷和預(yù)防重大疾病的重要步驟之一。孫星炎等39以石墨電極為基底電極，研究了在不同致突變因素（包括紫外光照射、亞硝酸）的作用后，特定堿基序列的DNA 生物傳感器和基因芯片技術(shù)的研究方向與熱點(diǎn)。134利用酶分子的放大功能間接檢測酶聯(lián)放大反應(yīng)的

11、電化學(xué)寡核苷酸實(shí)驗(yàn)與早期基于酶標(biāo)記的免疫測定相似。在DNA 分子上標(biāo)記酶作為識別元素，酶與底物作用時(shí)，有電化學(xué)響應(yīng)信號。靶基因標(biāo)記酶后，使檢測電極與酶的底物作用，通過檢測電化學(xué)信號，就可以間接檢測靶DNA 。Kavanagh 等30將靶DNA 連上葡萄糖氧化酶，用修飾后的金電極間接檢測靶DNA 。在已有的報(bào)道中研究最廣泛的是過氧化酶3133，目前已實(shí)現(xiàn)商品化34。DNA 與電極表面的ssDNA 能否雜交及雜交程度，以此來探討DNA 突變情況及可能的突變機(jī)理。Wang 等40直接固定dsDNA ，制備出微型電化學(xué)傳感器，通過探討紫外光輻射引起的DNA 中鳥嘌呤氧化峰信號的變化，檢測DNA 的損傷

12、。214藥物檢驗(yàn)DNA 傳感器在藥物分析中的應(yīng)用也越來越受到關(guān)注。Brett 等41利用DNA 修飾電極建立了對抗癌藥卡鉑的測定方法；Ov ádekov á等人42利用DNA 修飾電極研究了黃連素對癌細(xì)胞基因的作用；K erman 等人43建立了一種新型的雜交檢測方法，有望用于制藥和臨床診斷；Gu 等人44研究了一種新型的碳糊電極可檢測抗早孕藥物米非司酮。2DNA 電化學(xué)生物傳感器的應(yīng)用現(xiàn)狀將DNA 電化學(xué)生物傳感器在各個領(lǐng)域的研究進(jìn)展簡要介紹如下：21在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用211細(xì)菌及病毒感染類疾病診斷在傳統(tǒng)方法中，細(xì)菌及病毒感染類疾病是通過血液體外培養(yǎng)來診斷的，這需要幾天甚至幾

13、十天的時(shí)間，嚴(yán)重延誤了疾病診療。利用DNA 電化學(xué)生物傳感器可快速檢測細(xì)菌和病毒，Hashimoto 等35利用光刻微細(xì)加工技術(shù)刻蝕出03mm 的固定DNA 探針微金膜電極，應(yīng)用于測定乙型肝炎病毒。22在環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用221環(huán)境有機(jī)物的監(jiān)測Wang 等45報(bào)道了測定肼類化合物的電化學(xué)DNA 傳感器，能靈敏測定水中的不同肼類化合物，檢測限為1×109g mL 。還研究了46用于芳香胺類化合物測定的DNA 傳感器，對芳香胺類化合物的檢測限可達(dá)到納摩爾數(shù)量級。Brett 等人47研究了DNA 電化學(xué)生物傳感器，可檢測三嗪衍生物引起的環(huán)境污染物。222環(huán)境病原微生物的監(jiān)測大腸桿菌（Ecol

14、i）是一種致病菌，常會引起腹瀉等疾病，Wang 等48利用絲網(wǎng)印刷轉(zhuǎn)換器，研制了測定環(huán)境中EcoliDNA 序列的電化學(xué)生物傳感器。212基因診斷223重金屬離子的監(jiān)測Millan 等36用ssDNA 修飾了碳糊電極，用該傳感器測定了18個堿基長度的囊性纖維變性基因序列。Wang 等37對腫瘤抑制基因p53進(jìn)行檢測，取得滿意的結(jié)果。Wang 等38提出以肽核酸（PNA ）代替ssDNA 作為探針修飾到電極表面，DNA 和重金屬離子相互作用機(jī)理，是研究重金屬對DNA 產(chǎn)生毒效作用的關(guān)鍵，也是近年來活躍的前沿研究領(lǐng)域之一4950。干寧等人51利用DNA 電化學(xué)生物傳感器測定水中痕量鉛，檢測限為20

15、×108mol L 。1期毛斌等：DNA 電化學(xué)生物傳感器的原理與研究進(jìn)展1323食品工業(yè)231轉(zhuǎn)基因食品的檢測杜曉燕等52將生物素標(biāo)記的ssDNA 通過生物素親和素體系固載到鉑電極上，識別轉(zhuǎn)基因食品中的特異DNA 序列，該方法檢測靈敏度高?；瘜W(xué)DNA 生物傳感器的研究將主要集中在以下幾個方面：1）優(yōu)化電極結(jié)構(gòu)及ssDNA 的固定技術(shù)，例如發(fā)展自組裝修飾技術(shù)等，提高ssDNA 的固定效果；2）結(jié)合其它技術(shù)如納米技術(shù)等，獲得更高靈敏度的檢測；232食品新鮮程度的檢測文獻(xiàn)53報(bào)道上?？茖W(xué)家研制出新型DNA3）繼續(xù)深入研究其在臨床基因診斷、藥物篩選等方面的應(yīng)用；電化學(xué)生物傳感器，能靈敏地檢

16、測細(xì)胞中的能量分子三磷酸腺苷（ATP ）的含量。人工合成的DNA 只要碰上ATP ，雙螺旋結(jié)構(gòu)就會解鏈，導(dǎo)電性增強(qiáng)，因此只要測出電流的大小，就能知道ATP 的含量。該傳感器可用于快捷地檢測食品的新鮮程度。4）尋求其它技術(shù)與DNA 電化學(xué)生物傳感器的結(jié)合，拓展其研究應(yīng)用領(lǐng)域；5）應(yīng)用肽核酸（peptide nucleic acid, PNA ）取代ssDNA ，以提高傳感器的穩(wěn)定性；6）實(shí)現(xiàn)人工智能化、微型化、商品化，使此類傳感器滲透到人們的生活實(shí)踐中。24基因芯片基因芯片是將分子生物學(xué)技術(shù)與半導(dǎo)體工業(yè)的微型制造技術(shù)結(jié)合，把巨大數(shù)量的寡核苷酸、肽核酸或DNA 分子固定在一塊面積極小的基片（如：硅

17、片、玻片或尼龍膜等）上構(gòu)成。經(jīng)典的芯片檢測一般采用同位素或熒光染料為信號報(bào)告分子，但都存在一定的缺點(diǎn)，如：靈敏度低、特異性不高、操作復(fù)雜、耗時(shí)長、有污染、需避光、半衰期短、易淬滅及不易檢測等。從而長期制約著基因芯片的更為廣泛地應(yīng)用和發(fā)展54。因此尋求一種更安全、更方便簡單、更靈敏特異的信號分子或檢測手段是芯片技術(shù)研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。參考文獻(xiàn)1Cilkowski M L ，F(xiàn)anf M M, Lund M E JAsurface plasmonresonance method foe detecting multiple modes of DNAligand interactionwsJPharm

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21、o transducer surfaces and detection methods JDNA 電化學(xué)生物傳感器技術(shù)具有諸多優(yōu)點(diǎn)，其研究對完善DNA 芯片技術(shù)是有益嘗試。Devaraj 等人55設(shè)計(jì)了一種簡易而直接的固定寡核苷酸表面陣列的方法，他們將帶有乙烯基的寡核苷酸與金電極表面疊氮功能化的自組裝單分子層作用，得到高度有序、選擇性好的DNA 陣列。除了上述領(lǐng)域，DNA 電化學(xué)傳感器的研究應(yīng)用范圍還在不斷拓寬，例如蔣曉華等人56研究了DNA過氧化聚吡咯生物復(fù)合膜傳感器，可用于檢測神經(jīng)遞質(zhì)。3展望電化學(xué)DNA 傳感器的研究工作開辟了電化學(xué)與分子生物學(xué)的新領(lǐng)域，為生命科學(xué)的研究提供了一種全新的方

22、法，在遺傳疾病診斷、病原微生物檢測、轉(zhuǎn)基因生物檢測等方面顯示了廣泛的應(yīng)用前景。目前，尤其在國內(nèi)還處于起步階段，電14 化 學(xué) 傳 感 器 29 卷 Biosens. Bioelectron. ,2000 ,15 (5-6 :291303. 11 Xu C , Cai H , He P , et al.Characterization of single stranded DNA on chitosan-modified electrode and its application to the sequence -specific DNA detection J . Fresenius J. A

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