免疫熒光技術(shù)

1、免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)熒光免疫技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的 一種。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與 一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織 或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。Coo ns等于1941年 首次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記而獲得成功。這種以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體而進(jìn)行抗原定位的技術(shù)稱為熒 光抗體技術(shù)(fluorescentantibodytechnique )。熒光免疫法按反應(yīng)體系及定量方法不同，還可 進(jìn)一步分做若干種。與放射免疫法相比，熒光免 疫法無放射性污染，并且大多操作簡便，便于推 廣。國外生產(chǎn)的TDM用試劑盒，有相當(dāng)一部分 即屬于此類，并且還有專供TDM熒光偏振免疫 分析用的自動分析儀生

2、產(chǎn)。由于一般熒光測定中的本底較高等問題， 熒光 免疫技術(shù)用于定量測定有一定困難。 近年來發(fā)展 了幾種特殊的熒光免疫測定，與酶免疫測定和放 射免疫分析一樣，在臨床檢驗中應(yīng)用。有關(guān)熒光的基本知識一、熒光現(xiàn)象(一) 熒光的產(chǎn)生一此化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲存能量（如光 能、化學(xué)能等）而進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)再 回復(fù)到基態(tài)時，過剩的能量可以電磁輻射的形式 放射（即發(fā)光）。熒光發(fā)射的特點(diǎn)是：可產(chǎn)生熒光的分子或原子 在接受能量后即刻引起發(fā)光；而一旦停止供能， 發(fā)光（熒光）現(xiàn)象也隨之在瞬間內(nèi)消失?？梢砸鸢l(fā)熒光的能量種類很多，由光激發(fā)所 引起的熒光稱為致熒光。由化學(xué)應(yīng)所引起的稱為 化學(xué)熒光，由X線或陰極射線

3、引起的分別稱為X 線熒光或陰極射線熒光。熒光免疫技術(shù)一般應(yīng)用 致熒光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。（二）熒光效率熒光分子不會將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒 光，總或多或少地以其他形式釋放。熒光效率是 指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率， 與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。熒光效率=發(fā)射熒光的光量分子數(shù)（熒光強(qiáng) 度）/吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強(qiáng)度）發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強(qiáng)度，除受激發(fā) 光強(qiáng)度影響外，也與激發(fā)光的波長有關(guān)。各個熒 光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜（熒光光 譜），即在某一特定波長處有最大吸收峰和最大 發(fā)射峰。選擇激發(fā)光波長量接近于熒光分子的最 大吸收峰波長，且測定光波量接近于最大發(fā)射光 波峰時，

4、得到的熒光強(qiáng)度也最大。（三）熒光的猝滅熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長時間 的照射后會減弱甚至猝滅，這是由于激發(fā)態(tài)分子 的電子不能回復(fù)到基態(tài)，所吸收的能量無法以熒 光的形式發(fā)射。一些化合物有天然的熒光猝滅作 用而被用作猝滅劑，以消除不需用的熒光。因此 熒光物質(zhì)的保存應(yīng)注意避免光（特別是紫外光） 的直接照射和與其他化合物的接觸。在熒光抗體 技術(shù)中常用一些非熒的色素物質(zhì)如亞甲藍(lán)、 堿性 復(fù)紅。伊文思藍(lán)或低濃度的過錳酸鉀、 碘溶液等 對標(biāo)本進(jìn)行得當(dāng)復(fù)染，以減弱非特異性熒光本 質(zhì)，使特異熒光更突出顯示。二、熒光物質(zhì)（一）熒光色素許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作 熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的

5、熒光并能作為 染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素 或熒光染料。常用的熒光色素有：1異硫氰酸熒光素(fluoresce ini sothiocya nate , FITC )為黃色或橙 黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量 為389.4,最大吸收光波長為490495nm,最大發(fā) 射光波長520530nm,呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光， 結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體I型在效率、 穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用最廣泛的熒光素。 其主要優(yōu)點(diǎn)是：人眼對黃綠色較為敏感，通 常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。2.四乙基羅丹明(rhodamine，RIB20

6、0 )為 橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性 質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。結(jié)構(gòu)式如下：最大吸收光波長為570nm,最大發(fā)射光波長為 595600nm，呈橘紅色熒光。3四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethylrhodamineisothiocyanate ，TRITC )結(jié)構(gòu)式如下：最大吸引光波長為550nm，最大發(fā)射光波長為 620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光 對比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?其 異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。（二）其他熒光物質(zhì)1酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身 無熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的 物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-3-D

7、半乳糖苷受3-半乳 糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒 光，激發(fā)光波長為360nm,發(fā)射光波長為450nm。 其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣 根過氧化物酶的底物對羥基苯乙酸等。2.鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪 （Eu3+）、鋱（Tb3+）、鈰（Ce3+）等的螯合 物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以 Eu3+應(yīng)用最廣。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長范圍 寬，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時間長，最適 合用于分辨熒光免疫測定。免疫學(xué)基本常識：抗原、抗體及單克隆抗體眾所周知，人或動物可以依靠自身的能力抵御 某些疾病的侵襲，也有一些疾病可以通過機(jī)體自 身調(diào)控而自愈，這是因為機(jī)體

8、內(nèi)部存在一個免疫 系統(tǒng)。免疫系統(tǒng)是由中樞免疫組織（骨髓、胸腺、 消化系統(tǒng)免疫組織）和外周淋巴組織（淋巴結(jié)和 脾臟）的免疫活性細(xì)胞（B淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞）， 以及由它們產(chǎn)生的多種淋巴因子和抗體所組成。 免疫系統(tǒng)對外來物質(zhì)產(chǎn)生一系列反應(yīng)的過程稱 為免疫，而這種反應(yīng)本身則稱為免疫應(yīng)答。能夠 在機(jī)體中引起特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)稱為抗原， 免疫應(yīng)答的結(jié)果則是刺激機(jī)體產(chǎn)生與抗原相對 應(yīng)的特異性抗體和引起細(xì)胞免疫。由于免疫應(yīng)答同時取決于機(jī)體，而不僅是進(jìn)入 機(jī)體的物質(zhì)，所以抗原的定義是相對的。由此， 按照免疫應(yīng)答的效果可以將抗原分為完全抗原 和半抗原：完全抗原是指能夠直接誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生 特異性免疫應(yīng)答的一類物質(zhì)。完

9、全抗原的分子量 都大于5000,其化學(xué)成分多為蛋白質(zhì)或脂多糖， 其它如脂蛋白，糖蛋白，多糖體，多肽，核酸等 也都是完全抗原。半抗原能與抗體特異性結(jié)合， 但不能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗體，必須與蛋白質(zhì)（載體） 結(jié)合后進(jìn)入機(jī)體，才能產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答。大 分子的半抗原在體外能與對應(yīng)的抗體結(jié)合發(fā)生 可見反應(yīng)（凝集、沉淀），小分子的半抗原能與 對應(yīng)抗體結(jié)合而不出現(xiàn)可見反應(yīng)。 此外，抗原還 可以按照自身的物質(zhì)屬性分為可溶性（毒素、異 種蛋白）或顆粒性（細(xì)菌、細(xì)胞）抗原，或按臨 床意義分為外源性和內(nèi)源性抗原?？贵w是在抗原刺激下機(jī)體免疫應(yīng)答的產(chǎn)物。所 有抗體都具有與抗原特異性結(jié)合的能力。抗體的 化學(xué)本質(zhì)是免疫球蛋白即

10、 L球蛋白。不過只有 當(dāng)免疫球蛋白針對已知抗原時，才能夠稱這種免 疫球蛋白為抗體。免疫球蛋白屬于結(jié)構(gòu)牢固的分 子物質(zhì)，可以經(jīng)受較大變化的環(huán)境作用，諸如 56C加溫，在室溫下較長時期的貯藏，短期高或 低pH處理，甚至與去污劑或尿素接觸后仍保持 其抗體活性?？贵w活性是指與抗原特異性結(jié)合的能力，即二 者之間的特殊親合力。兩者非共價鍵結(jié)合，結(jié)合 的力包括氫鍵，靜電力，范德華力和疏水結(jié)合力。 抗體抗原之間的反應(yīng)是可逆的，在適宜的條件下 仍可解離而性質(zhì)不變。機(jī)體內(nèi)約有1億種不同的B淋巴細(xì)胞，每個 獨(dú)立的B淋巴細(xì)胞只能接受一種抗原的刺激從 而形成分泌一種抗體的能力，因此特異性是免疫 應(yīng)答的特有標(biāo)志。如常識所

11、見，麻疹患者愈后即 獲得對麻疹的終生免疫，而這并不形成對天花的 免疫。抗體抗原特異性結(jié)合的本質(zhì)是抗原決定簇 與抗體結(jié)合簇的專一適配性，抗原決定簇是指抗 原分子上專有的化學(xué)基因，可以決定其刺激機(jī)體 所產(chǎn)生抗體的特異性?？乖瓫Q定簇與其相對應(yīng)的 抗體結(jié)合簇立體構(gòu)型完全相適應(yīng)。一個抗原分子 可帶有多個不同的決定簇?？乖肿恿坑?，決 定簇數(shù)量愈多。決定簇數(shù)目代表抗原分子的價。 抗體結(jié)合簇是在抗體分子上與對應(yīng)的抗原決定 簇發(fā)生特異性結(jié)合的部位，位于Ig分子的抗原 結(jié)合分段（V段）上，由重鏈和輕鏈的一部分可 變區(qū)構(gòu)成。其特異性由氨基酸排列順序決定， 約 包括515個氨基酸。每個單體免疫球蛋白分子 如IgG

12、有2個結(jié)合簇，IgA是二聚體，有4個結(jié) 合簇，IgM是五聚體所以有10個結(jié)合簇。（但是, 事情并不是絕對的。一種抗體除與相對應(yīng)的抗原 發(fā)生特異性反應(yīng)外，也有可能與化學(xué)結(jié)構(gòu)部分相 似的其它抗原發(fā)生反應(yīng)，這就是通常所說的交叉 反應(yīng)。交叉反應(yīng)可能由于兩種抗原有共同的決定 簇，或由于兩者的抗原決定簇雖然不完全相同， 但在立體化學(xué)結(jié)構(gòu)上密切相關(guān)，導(dǎo)致一種抗原能 與另一種抗原的對應(yīng)抗體結(jié)合。）正常情況下，抗體與抗原在機(jī)體內(nèi)結(jié)合后，可 以被吞噬、排泄而將抗原清除。如果這種抗原屬 于外源性致病抗原（細(xì)菌、病毒、毒素），可以 由此達(dá)到殺滅或削弱抗原危害的目的。 對于內(nèi)源 性抗原，如已經(jīng)衰退、損傷或突變的異常細(xì)胞

13、， 也能被及時排除，實現(xiàn)機(jī)體自身的免疫調(diào)控。當(dāng) 然，在異常情況下，抗體抗原結(jié)合后形成的免疫 復(fù)合物將損傷組織、細(xì)胞，引起花粉過敏一類的 變態(tài)反應(yīng)或免疫性疾病等不良后果。不過長期以來所謂特異性免疫血清抗體， 不論 是從人還是從動物獲得的，也不論是主動獲得還 是被動獲得的，實際上都是有許多種具有不同特 性的抗體所組成的混合抗體。這是因為，進(jìn)入機(jī) 體的抗原往往帶有若干個抗原決定簇。此外，不 同個體對同一抗原決定簇的反應(yīng)并不相同，即使 同一個體不同時間接受抗原刺激后產(chǎn)生的反應(yīng) 也不完全一致。由于人們無法將體內(nèi)已受抗原刺 激的各種不同的B淋巴細(xì)胞克隆區(qū)分開，即使在 體外能將它們分成單細(xì)胞，也無法讓其繼續(xù)

14、生 長，增殖并分泌抗體。因此，用常規(guī)免疫方法制 備的免疫血清抗體只能是數(shù)目眾多的單克隆抗 體的混合物，現(xiàn)在，一般稱其為多克隆抗體（PcAb）。這種多克隆抗體存在特異性差、效價低、數(shù)量有限、動物間個體差異大，難以重復(fù) 制備等固有缺陷，許多場合下使用時難盡人意。1975年，英國劍橋大學(xué)分子生物學(xué)研究室的 Kohler和Milstein合作發(fā)表了題為 分泌預(yù)定特 異性抗體的融合細(xì)胞的持續(xù)培養(yǎng)”的著名論文（Nature,256:495,1975）。他們將已適應(yīng)于體外 培養(yǎng)的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與綿羊紅細(xì)胞免疫小鼠 脾細(xì)胞（B淋巴細(xì)胞）進(jìn)行融合，發(fā)現(xiàn)融合形成 的雜交瘤細(xì)胞具有雙親細(xì)胞的特征：即像骨髓瘤 細(xì)胞一

15、樣在體外培養(yǎng)中能夠無限地快速增殖，又 能持續(xù)地分泌特異性抗體，通過克隆化可使雜交 細(xì)胞成為單純的細(xì)胞系，由此單克隆系就可以獲 得結(jié)構(gòu)與各種特性完全相同的高純度抗體，即單克隆抗體（McAb ）。上述方法創(chuàng)立了一項具有 劃時代意義的新技術(shù)一利用 B淋巴細(xì)胞雜交瘤 產(chǎn)生單克隆抗體。這一技術(shù)的創(chuàng)立和迅速推廣， 為所有需要制備和使用抗體的研究領(lǐng)域提供了 全新的手段和制劑，促進(jìn)了生命科學(xué)諸學(xué)科的發(fā) 展。兩位科學(xué)家也由于這一杰出貢獻(xiàn)榮獲1984年諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎。黃曲霉毒素B1是一種二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)?衍生物，分子量為312，屬于半抗原，不能直接誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。因此我們的工作首先是 將黃曲霉毒素

16、B1與載體蛋白連接，合成為完全 抗原，以后的研究則基本上采用了前述雜交瘤- 單克隆抗體技術(shù)的經(jīng)典方法：動物免疫免疫脾 細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合細(xì)胞篩選用有限稀 釋法分離出可分泌特異性抗體的單個細(xì)胞，再經(jīng) 過克隆化培養(yǎng)建立雜交瘤細(xì)胞株并制備出大量 單克隆抗體，從而在此基礎(chǔ)上最終建立了黃曲霉 毒素B1 （AFB1 ）的免疫檢測方法。免疫標(biāo)記法（一） 熒光免疫法：原理是應(yīng)用一對單克隆抗體的夾心法。底物用 磷酸-4-甲基傘形酮，檢測產(chǎn)物發(fā)出的熒光，熒光 強(qiáng)度與Mb濃度呈正比，可在8min內(nèi)得出結(jié)果。 結(jié)果以Mb每小時釋放的速率表示（ Mb）表示。 該法重復(fù)性好，線性范圍寬，具有快速、敏感、 準(zhǔn)確的特點(diǎn)。以

17、雙抗夾心法為例，首先將特異性抗體與固相 載體連接，形成固相抗體。除去未結(jié)合抗體，然 后加受檢標(biāo)本，使其中的蛋白抗原與固相抗體形成抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去未結(jié)合物，接著加 入熒光標(biāo)記的抗體，使之與抗原特異性結(jié)合，形 成抗體一抗原一抗體復(fù)合物。最后根據(jù)熒光強(qiáng) 度，即可對蛋白抗原進(jìn)行定量。傳統(tǒng)的熒光免疫法受本底熒光的干擾較大，時 間分辨熒光免疫測定法是以具有特長壽命的稀 土金屬如銪，作為標(biāo)記物，加入正常液后激發(fā)測 定，能有效去除短壽命本底熒光的干擾。（二） 放射免疫法放射免疫法是以過量的未標(biāo)記抗原與放射性 物質(zhì)標(biāo)記的抗原，競爭性地與抗體結(jié)合，形成有 放射性的抗原一抗體復(fù)合物與無放射性的抗原 抗體復(fù)合

18、物，并有過剩的標(biāo)記抗原與未標(biāo)記的 抗原。然后通過離心沉淀等方法，將抗原一抗體 復(fù)合物與游離抗原分離，分別測定其放射性強(qiáng)度 與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，即可對未標(biāo)記的待測抗原進(jìn)行 疋量。RIA法測定血清蛋白靈敏度高、特異性強(qiáng)，可 準(zhǔn)確定量到ng/ml水平。但早期的方法操作麻 煩，耗時長，且有放射性污染。近年來，隨著單克隆抗體的應(yīng)用，RIA的靈敏度又有了較大提 高，且操作大為簡化，并已有商品試劑盒供應(yīng)， 使用方便。(三)酶聯(lián)免疫法(ELISA)ELISA法有競爭法和夾心法兩種。競爭法是 基于標(biāo)準(zhǔn)或血清Mb和微孑L板上包被的Mb 競爭性地與單克隆抗體相結(jié)合的原理而建立，該 法的最低檢測限為10卩/ L,線性范圍達(dá)1 OOOug/L。夾心ELISA法與EIA具有良好的相 關(guān)性(r = 0.92)。ELISA法具有靈敏度高，特異性 強(qiáng)，精密度好，操作簡單，適用于多份標(biāo)本的檢 測，不需特殊儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，易于推廣普及。 但不適合急診的快速檢測。以雙抗法為例。首先包被抗原，然后加入一抗， 使一抗與包被抗原形成抗原一抗體復(fù)合物。接著 加入酶標(biāo)二抗，形成抗原 一抗體一抗體復(fù)合物。 最后加入